两种人鼻咽癌活检组织上皮细胞原代培养方法比较

目的 比较两种人鼻咽癌活检组织上皮细胞原代培养方法,并初步探讨鼻咽癌原代培养细胞的生长特性.方法 收集未经放、化疗的鼻咽痛初诊病人鼻咽部肿瘤活检组织33例,其中17例采用组织块培养法.16例采用组织块预消化培养法,用含2%胎牛血清的Keratinocyte-SFM培养基培养.比较两种方法干贴壁时间、成功率及细胞长出所需平均天数,并通过倒置显微镜、抗人角蛋白单克隆抗体免疫细胞化学染色、生长曲线、生存分析来观察原代培养细胞的特性.结果 组织块培养法成功率为23.5%(4/17),干贴壁时间为4.47±0.48h,细胞长出所需时间为13.75±1.5d;组织块预消化培养法成功率为62.5%(10/16),干贴壁时间为7.88±1.01 h,细胞长出所需时间为8.3±4.55d,差异有统计学意义(P<0.05).组织块培养法,细胞多层重叠排列,结构不清,始终没有继续繁殖生长;组织块预消化培养法,细胞呈梭形,核大居中,多个核仁,抗人角蛋自单克隆抗体免疫细胞化学染色阳性,生存时间均数为62.72d.结论 组织块预消化培养法较组织块法成功率高,细胞长出所需平均天数短,干贴壁时间长;低浓度血清的Keratinocyte-SFM培养基适合鼻咽癌原代上皮细胞体外培养.     

人扁桃体隐窝上皮细胞的分离、原代培养与鉴定

目的：建立高效、稳定的人扁桃体隐窝上皮细胞原代培养方法。方法：收集80例3~5岁儿童手术切除的扁桃体组织,分别采用组织块贴壁法和Ⅱ型中性蛋白酶联合0.25%胰蛋白酶?EDTA消化法提取扁桃体隐窝上皮细胞并比较两种方法的提取效果;应用无血清角化细胞培养基进行细胞纯化及原代培养;用相差显微镜观察细胞形态和生长特点、免疫细胞化学染色及免疫荧光技术鉴定细胞来源。结果：Ⅱ型中性蛋白酶联合消化法在分离扁桃体隐窝上皮细胞成功率、细胞密度以及细胞融合时间方面均高于组织块贴壁法（P < 0.05）,细胞接种后第2天开始贴壁,外观呈现多边形,岛状生长,培养12 d左右,细胞连成单层,呈现铺路石样生长。免疫细胞化学染色显示广谱角蛋白表达阳性,波形蛋白阴性;免疫荧光鉴定角蛋白8/18染色阳性。结论：应用Ⅱ型中性蛋白酶联合0.25%胰蛋白酶?EDTA消化法以及无血清角化细胞培养基可建立高效稳定的人扁桃体隐窝上皮细胞原代分离方法和体外培养体系。     

风疹病毒R16株体外感染人胚晶状体上皮细胞的初步研究

目的观察风疹病毒R16株体外感染人胚晶状体上皮细胞的生物学特性。方法利用相差显微镜、透射电子显微镜、免疫细胞化学技术观察风疹病毒R16株在人胚晶状体上皮细胞中的形态学及生长特性。结果风疹病毒R16株体外感染人胚晶状体上皮细胞后,细胞不产生明显的病变效应。受病毒感染的人胚晶状体上皮细胞生长速度较慢,10d后可在细胞质内观察到呈不规则球形、由单层脂质膜包绕、直径60～80nm的病毒颗粒,包括致密核心和无致密核心两种颗粒。而在胞核中未发现病毒颗粒。结论风疹病毒R16株能在人胚晶状体上皮细胞中增殖,为进一步研究风疹病毒感染后先天性白内障的发生机制打下基础。     

风疹病毒R16株体外感染人胚晶状体上皮细胞的初步研究

目的观察风疹病毒R16株体外感染人胚晶状体上皮细胞的生物学特性。方法利用相差显微镜、透射电子显微镜、免疫细胞化学技术观察风疹病毒R16株在人胚晶状体上皮细胞中的形态学及生长特性。结果风疹病毒R16株体外感染人胚晶状体上皮细胞后，细胞不产生明显的病变效应。受病毒感染的人胚晶状体上皮细胞生长速度较慢，10d后可在细胞质内观察到呈不规则球形、由单层脂质膜包绕、直径60～80nm的病毒颗粒，包括致密核心和无致密核心两种颗粒。而在胞核中未发现病毒颗粒。结论风疹病毒R16株能在人胚晶状体上皮细胞中增殖，为进一步研究风疹病毒感染后先天性白内障的发生机制打下基础。     

人、兔结膜上皮细胞的原代培养

目的探索结膜上皮细胞体外培养的最佳方法,研究其生长特性,为毒理实验及体外结膜上皮移植提供基础。方法分别用3种培养方法：(1)组织块培养法;(2)混合肖化法;(3)组织块消化后贴壁法来培养人、兔的结膜上皮细胞,观察细胞状态、不同部位的长生特性等,并尝试在羊膜、饲细胞层上培养建系。结果3种培养方法中,组织块培养法能获得较纯的结膜上皮细胞但生长缓慢,消化法能获得大量细胞,生长较快,但常常混有其它杂细胞,组织块消化后贴壁法获得细胞量较少。观察到来自兔、睑结膜及穹隆部结膜上皮的细胞生长速度较快,细胞量多,来自球结膜的细胞生长较慢。应用间接免疫荧光染色,人结膜上皮细胞K13染色阳性。结论组织块培养法及混合消化法皆能培养结膜上皮细胞,各有利弊。     

以兔去上皮浅层角膜为载体体外培养角膜缘上皮细胞的实验研究

目的 建立以兔去上皮浅层角膜为载体体外培养兔角膜缘上皮细胞的培养方法 ,观察细胞生物学特性。方法 用含5%胎牛血清的DMEM/F12（1∶1）培养液对兔角膜缘上皮细胞进行体外组织块法原代培养,待细胞形成单层后,传代种植于去上皮浅层角膜载体上。每天用倒置显微镜观察培养细胞的形态及生长情况,电镜观察培育细胞的超微结构并采用HE染色和抗增殖细胞核抗原（anti-proliferating cell nuclear antigen,PCNA）单克隆抗体免疫细胞化学染色对生长于去上皮浅层角膜载体上的细胞进行检测。结果 原代培养时,48小时后可见组织块边缘有细胞生长游出,10天左右,细胞汇合成单层。传代种植于载体上,细胞24小时贴壁伸展,第5天可见部分区域细胞逐渐融合成片,11天左右细胞形成良好单层。细胞呈卵圆形或多边形,类似角膜上皮细胞;电镜下,可见细胞表面有许多微绒毛,细胞间有桥粒连接;免疫细胞化学染色显示部分细胞PCNA单克隆抗体呈阳性反应。结论 含5%胎牛血清的DMEM/F12培养液适合角膜缘干细胞的体外培养,并能成功地在去上皮角膜浅层载体上培养出类似生理状态下的角膜上皮细胞。     

兔角膜上皮细胞体外原代培养方法的研究

目的:建立体外原代培养兔角膜上皮细胞简单经济实用的方法,并观察其体外生长的生物学特性。方法:采用消化法、组织块培养法培养兔角膜上皮细胞并进行传代培养,分别测定细胞分裂指数及细胞贴壁率,MTT比色法测定细胞生长曲线。结果:两种方法培养的细胞在原代、第1代形态相似,消化法培养的细胞代数维持低于组织块法;对数生长期时,组织块培养法的细胞具有更好的活力且分裂旺盛(P<0.05);在16 h后,消化法培养的细胞贴壁率低于组织块培养法(P<0.05)。结论:选择组织块培养法培养兔角膜上皮细胞可获得状态良好的连续传代扩增的细胞,且具有经济实用性;角膜上皮细胞符合一般有限细胞系的生长规律。     

大鼠骨髓间质干细胞的分离培养及生物学特性研究

目的建立大鼠骨髓间质干细胞(MSCs)最佳的体外分离培养方法,并研究其基本的生物学特性。方法采用密度梯度离心和贴壁培养两种方法分离大鼠的MSCs,进行形态学观察及增殖生长方面的测定;免疫细胞化学染色鉴定表面标志。结果大鼠MSCs体外培养呈梭形;细胞生长曲线为“S”型;密度梯度离心法原代培养15d达到80%～90%的融合,而改良的直接贴壁法只需要5d;细胞周期显示G0/G1期88.29%;免疫细胞化学染色显示CD44表达阳性,CD34、CD45为阴性。结论两种方法均可获得骨髓间质干细胞,但贴壁培养法操作更简便、快速,具有对细胞活性影响较小,更利于其贴壁和增殖的优点。MSCs体外培养条件下生长性状稳定,适于做组织工程的种子细胞。     

改良组织贴块法培养大鼠气道平滑肌细胞

目的：改进大鼠气道平滑肌细胞（airway smooth muscle cells,ASMCS）的培养方法,了解其生长特性,为研究气道疾病提供体外研究模型。方法：大鼠麻醉后迅速分离支气管树,去除内外膜并用0.2%I型胶原酶消化后,采用改良组织贴块法培养ASMCS,应用形态学和抗SMα-action免疫细胞化学法鉴定平滑肌细胞。结果：采用改良组织贴块法培养2～6 d,细胞开始从组织块周围长出,5～8 d在组织块附近出现＂谷-峰＂结构,9～12 d可融合。传代细胞经SMα-action免疫组化SP法染色阳性率达95%以上。结论：改良组织贴块法培养大鼠气道平滑肌细胞具有简便、易行、产量高、纯度高的优点,为研究气道疾病提供良好的体外研究模型。     

Ⅰ型胶原酶消化组织块法体外培养人牙髓细胞

目的 建立利用Ⅰ型胶原酶消化组织块体外培养人牙髓细胞方法。方法 通过组织块Ⅰ型胶原酶消化法进行人牙髓细胞体外培养，免疫细胞化学法鉴定细胞组织来源，进行细胞传代，酶组织化学法对体外复层生长的人牙髓细胞爬片进行碱性磷酸酶组织化学染色，并检测其矿化能力。结果 采用Ⅰ型胶原酶消化组织块法体外培养的原代牙髓细胞，在第15～20d出现汇合，第4～6代牙髓细胞在连续培养后具有复层生长特性，并具有显著的碱性磷酸酶活性．阳性染色强弱部位呈区域性分布，连续培养的牙髓细胞可形成矿化结节。结论 Ⅰ型胶原酶消化组织块法可以很好地进行人牙髓细胞体外培养，可以用酶组织化学法研究牙髓细胞的生物学特性。     

人胎儿角膜缘干细胞的体外培养及鉴定

目的 探讨人胎儿角膜缘干细胞的体外培养及鉴定方法。方法 应用消化培养法对人胎儿角膜缘上皮组织进行体外培养并观察记录培养细胞的生长特性；对胎儿角膜缘组织及培养细胞采用一系列单克隆抗体进行免疫酶细胞化学染色检测；并用扫描电镜观察原代细胞的表面状况。结果 胎儿角膜缘上皮细胞原代培养时生长旺盛，传代培养时保持高增殖速率。免疫酶细胞化学染色见培养前胎儿角膜缘组织基底层有多量AE5阴性、AE1和PCNA阳性细胞，并见较多HLA-DR阳性细胞；原代细胞绝大部分AE5和HLA-DR染色阴性，AEI和PCNA阳性；传代培养至第3代时AE5阴性细胞仍占大部分；扫描电镜观察原代细胞以球形或短圆柱形为主，表面多突起和微绒毛。结论 采用消化培养法可成功培养出具有高增殖力和低抗原性的人胎儿角膜缘干细胞．为临床眼表重建开辟了新的思路。     

改良的兔晶体上皮细胞体外培养

目的:建立一种改良的兔晶状体上皮细胞体外培养的方法,提高晶体上皮细胞原代培养的成功率。方法:利用改良消化法对兔晶体上皮细胞进原代培养,对培养的细胞进行形态学观察。结果:接种48小时~72小时后即可见上皮细胞贴壁生长,具备上皮细胞的形态特点;约7天后融合。传至5代后,细胞明显成纤维细胞化。结论:此种方法经济简便,可为各种实验提供兔晶体上皮细胞。     

小鼠腹部心脏移植模型的显微外科技巧及并发症的预防

 目的 探讨小鼠腹部心脏移植术的手术技巧及并发症的预防和处理。 方法 雄性昆明（KM）小鼠60只,随机分供、受体2组,采用大鼠Ono术式进行小鼠腹部异位心脏移植,小鼠供体升主动脉与受体腹主动脉端侧吻合,供体肺动脉与受体下腔静脉吻合,实验30例。 结果 实验成功率86.7％(26/30)。取供心时间(9.4±1.2)min,供心修取时间(14.8±1.2)min,受体手术时间(60.4±2.4)min,其中吻合时间(29.8±2.5)min。结论 掌握小鼠心脏移植的显微外科技巧和正确的处理手术并发症,可以成功建立小鼠腹部心脏移植模型。     

人晶状体上皮细胞体外培养方法的改良

目的改良现有人晶体上皮细胞的培养方法,建立稳定的体外培养模型。方法用改良培养法对人胚胎眼晶体前囊膜进行培养,并利用形态学检查方法进行检测和鉴定。结果组织块法在加入培养基24 h内即可见细胞生长,且保持上皮细胞形态,1wk左右细胞融合。在体外可传5代以后细胞衰老,存活者呈成纤维细胞状。消化法中2 d后见细胞壁生长,1周左右细胞融合。结论成功地改进了建立晶状体上皮细胞体外培养模型的方法,为研究后囊膜混浊发病机制提供了方法学基础。     

人羊膜上皮细胞的原代及传代培养

目的 建立体外培养人羊膜上皮细胞的方法,观察体外培养的羊膜上皮细胞的生物学特性.方法 取足月剖宫产术后羊膜,经胶原酶和胰蛋白酶消化后,获取的羊膜上皮细胞接种于含10%胎牛血清培养基中进行原代和传代培养,探索其合适的培养条件,用倒置显微镜观察培养的人羊膜上皮细胞体外生长的特征.用苏木精-伊红染色、扫描电镜和细胞角蛋白免疫组织化学染色的方法对培养细胞进行形态学观察和鉴定.结果 人羊膜上皮细胞可以在体外成功的培养传代,体外可连续传8～10代.体外培养细胞呈多角形,长满后呈上皮细胞特有的铺路石样外观.扫描电镜观察细胞表面有丰富的微绒毛.细胞角蛋白keratin单克隆抗体染色阳性.结论 人羊膜上皮细胞在体外可成功进行原代和传代培养,体外培养的人羊膜上皮细胞在一定时间内可维持增殖能力.     

人类晶体上皮细胞的体外培养与观察

目的：建立人类晶体上皮细胞培养的简便方法并观察原代和传代细胞的生物学特征和组织学变化。方法：将人工晶体植入术中取下的前囊膜分割成小碎片，吸管转移至培养瓶底部进行原代培养，7—10d后常规方法进行传代培养，采用相差显微镜观察活体细胞的增殖活动和形态学变化。结果：人类晶体上皮细胞在体外培养时可以存活并传代，但是其生存能力与供体年龄有关。传代后期细胞发生纤维化改变。结论：本方法简便，有效。可用于实验研究。     

以脱细胞角膜基质为载体的组织工程化兔角膜的构建及移植

目的进行体外分离和培养兔角膜缘干细胞,使之成为一种上皮组织,以便进行角膜移植。方法组织块法体外培养兔角膜缘干细胞：角膜缘组织块作为外植体,在脱细胞猪角膜基质上培养;获得的复合角膜上皮组织移植于兔眼,观察并记录兔角膜组织生长情况,待角膜组织生长良好后做免疫组织化学鉴定。结果兔角膜缘组织应用组织块法在脱细胞角膜基质上生长9~10 d后达到80%汇合状态,显微镜下动态观察细胞生长良好,增殖能力较高,将组织工程化角膜上皮作异体板层角膜移植于兔眼后,4~5 d角膜上皮光滑,20~21 d角膜变为透明,荧光素染色只见缝线处少许着色,期间未见角膜移植排斥反应。术后30 d HE染色显示角膜组织与宿主角膜组织结合良好,上皮细胞可见4~5层结构,可见角膜缘干细胞多呈卵圆形;免疫荧光染色可见培养的细胞P63、CK3单克隆抗体呈阳性表达。结论以组织块法生长的以脱细胞角膜基质为载体的组织工程化兔角膜可在角膜缘干细胞缺乏的兔眼上生长良好。     

人口腔黏膜上皮细胞的培养及其在PLGA膜上生长的初步实验

目的 :探讨人口腔黏膜上皮细胞的原代培养和体外生长方法。方法 :采用美国DispaseⅡ试剂获取人体正常口腔黏膜上皮的原代细胞 ,将其种植在PLGA膜上 ,通过光学显微镜形态学检查、扫描电镜和免疫组织化学进行细胞定性。结果 :采用DispaseⅡ可成功地分离出口腔黏膜上皮层和上皮下层 ,通过进一步处理后可获取口腔黏膜上皮细胞的原代细胞 ,将其植入PLAG膜上 ,细胞获得很快生长 ,5d时细胞出现分化 ,8d时可以长到 5层左右。结论 :本方法可较好地获取口腔黏膜原代细胞 ,获取的口腔黏膜原代上皮细胞种植在PLAG膜上可获得良好的生长。     

输卵管上皮细胞的培养及生物学特性

目的建立输卵管上皮细胞的培养方法，进行形态学观察，鉴定及冻存，方法取雌性日本大白兔的输卵管上皮细胞进行原代及传代培养，用光镜，电镜及单克隆角蛋白抗体进行ＳＰ染色，结果输卵管上皮细胞呈多角形组成簇生长。电镜下可见表面有微绒毛，细胞之间有紧密连接等上皮细胞的特征，免疫组化染色上皮细胞角蛋白染色阳性，原代培养细胞７天长成单层，传代细胞４天长成单层，结论建立稳定的输卵管上皮细胞的培养方法，为进一步研究输卵