PY20抗体检测bcr-abl阳性细胞内磷酸化酪氨酸的临床应用

目的探讨酪氨酸磷酸化抗体 PY20检测 bcr-abl 阳件细胞的特异性及其可能的临床应用。方法采用多色直接免疫荧光标记方法,同时标记膜 CD45和胞质 PY20抗体,应用流式细胞术检测 bcr-abl 阳性细胞系(K562、MEG-01)和阴月性细胞系(Jurkat、MCF-7)的酪氨酸磷酸化水平。并利用bcr-abl 蛋白酪氨酸磷酸化特异性阻断剂伊马替尼作用 K562细胞和 MEG4-01细胞,观察 PY20抗体的特异性。检测了49例白血病患者和3名正常人的骨髓细胞,包括慢性粒细胞白血病(CML)、Ph~+急性淋巴细胞白血病(Ph~+ ALL)、Ph~- ALL、急性髓系白血病、慢性淋巴细胞白血病。PY20~+细胞占白血病细胞群的10%以上定义为阳忡。以阳性细胞的平均荧光强度(MFI)表示其酪氨酸磷酸化水平。结果bcr-abl 阳性细胞系、10例初诊 CML 和8例 Ph~+ALL 患者 PY20抗体均为阳性,而 bcr-abl 阴性细胞系、20例 bcr-abl 阴性白血病患者和3名正常人 PY20抗体均为阴性。伊马替尼作用后 K562细胞和MEG-01细胞的酪氨酸磷酸化水平随作用时间的延长逐渐下降。10例初诊和9例伊马替尼治疗有效的 CML 患者 PY20~+细胞占有核细胞的比例分别为(54.20±19.82)%和(14.84±6.17)%(P<0.05),而2例伊马替尼耐药者 PY20~+细胞比例分别为64.3%和57.2%。2例伊马替尼耐药患者和9例伊马替尼治疗有效患者的 CML 细胞的 MFI 分别为99.42±4.87和46.41±4.67(P<0.01)。结论酪氨酸磷酸化抗体 PY20对 bcr-abl 阳性细胞具有相对特异性,有可能应用于 bcr-abl 阳性疾病如 CML 和Ph~+ALL 的早期快速辅助诊断,同时有可能作为判断该类疾病对伊马替尼敏感性的一个辅助指标。     

酪氨酸激酶抑制剂STI571靶向治疗Bcr-Abl+白血病研究

STI571是通过计算机辅助设计、人工合成的Abl激酶ATP结合位点竞争性抑制剂。体外试验证实:STI571高度选择性抑制Bcr-Abl、c-kit和PDGF受体酪氨酸激酶或底物蛋白的酪氨酸磷酸化而使其灭活;选择性抑制Bcr-Abl阳性细胞生长;诱导Bcr-Abl阳性细胞凋亡和分化;与IFN、DNR、Ara-C和HU有协同作用。对BCR-ABL基因转化小鼠有特异性的治疗作用。Ⅰ、Ⅱ期临床试验STI571治疗慢性期慢性粒细胞白血病(CML)效果显著,对CML急变和Ph~+急性白血病也有一定的疗效。白血病细胞对STI571体外耐药与靶基因扩增导致Bcr-Abl蛋白的过度表达有关,与P糖蛋白(Pgp)的过度表达也有关。体内耐药的机制与酸性糖蛋白(AGP)增加有关。     

酪氨酸激酶抑制剂STI571靶向治疗Bcr—Abl^＋白血病研究

STI571是通过计算机辅助设计、人工合成的Abl激酶ATP结合位点竞争性抑制剂。体外试验证实：STI571高度选择性抑制Bcr-Abl、c-kit和PDGF受体酪氨酸激酶或底物蛋白的酪氨酸磷酸化而使其灭活；选择性抑制Bcr-Abl阳性细胞生长；诱导Bcr-Abl阳性细胞凋亡和分化；与IFN、DNR、Ara-C和HU有协同作用。对BCR－ABL基因转化小鼠有特异性的治疗作用。Ⅰ、Ⅱ期临床试验STI571治疗慢性期慢性粒细胞白血病（CML）效果显著，对CML急变和Ph^ 急性白血病也有一定的疗效。白血病细胞对STI571体外耐药与靶基因扩增导致Bcr-Abl蛋白的过度表达有关，与P糖蛋白（Pgp）的过度表达也有关。体内耐药的机制与酸性糖蛋白（AGP）增加有关。     

急变期慢性髓系白血病骨髓间充质干细胞下调白血病细胞凋亡

本研究旨在观察慢性髓系白血病（CML）骨髓间充质干细胞（BMMSC）对K562细胞和原代急变期CML白血病细胞增殖和凋亡的影响及其可能的机制及意义.K562细胞和原代急变期CML白血病细胞分别与不同组别的BMMSC共培养,应用MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡及细胞线粒体膜电位,Western blot检测凋亡相关蛋白caspase-8、caspase-9、激活的caspase-3的表达.结果表明：CML急变期BMMSC不能抑制原代CML急变期白血病细胞的增殖,对K562仅有轻度的抑制作用;CML急变期BMMSC提高阿霉素处理后的K562细胞的存活率,并保护K562及原代CML-Bp骨髓单个核细胞,抑制阿霉素诱导的细胞凋亡（P＜0.05）;与CML慢性期及正常组BMMSC相比较,CML急变期BMMSC对白血病细胞的保护作用最强,其细胞共培养组的细胞线粒体膜电位下降最少（P＜0.05）;检测CML急变期BMMSC共培养组的K562显示,活性Caspase-3表达均较单独K562＋ ADM组明显下调,caspase-9表达显著增加（P＜0.05）.结论：CML急变期BMMSC下调阿霉素诱导的白血病细胞的凋亡,其机制可能与抑制细胞线粒体膜电位的下降,稳定caspase-9蛋白非活性的表达和下调caspase-3蛋白的激活有关.     

血府逐瘀汤影响慢性粒细胞白血病VEGF表达的体外研究

目的:体外研究血府逐瘀汤含药血清对慢性粒细胞白血病细胞VEGF表达的影响。方法:采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测20例初治CML患者、20例正常人骨髓细胞以及人慢性粒红白血病急性变K562细胞上清液的VEGF含量,并测定CML原代细胞和K562细胞加入不同浓度血府逐瘀汤含药血清共同培养后上清液的VEGF含量。结果:CML原代细胞上清液VEGF浓度为(389.27±65.77)pg/mL、K562细胞VEGF浓度为(461.24±137.57)pg/mL,均比正常人(125.45±28.24)pg/mL显著增高(P<0.05),加入不同浓度的含药血清,在中、高浓度范围,CML原代细胞、K562细胞VEGF表达均明显下降,分别为(152.43±26.29)pg/mL、(80.31±19.73)pg/mL和(188.86±32.77)pg/mL、(114.81±14.16)pg/mL(P<0.05)。结论:异常血管新生可能参与CML发病,血府逐瘀汤含药血清在体外能显著抑制CML原代细胞和K562白血病细胞表达VEGF,该方有参与抑制CML异常血管形成的作用。     

慢性粒细胞白血病PKR基因的表达及临床意义

目的检测双链RNA依赖性蛋白激酶(double-stranded RNA-dependent protein kinase,PKR)基因在慢性粒细胞白血病(CML)病人及CML细胞株K562细胞中的表达情况。方法分离CML患者慢性期(CP)15例,加速期(AP)11例,急变期(BC)9例及11例正常供者骨髓或外周血单个核细胞,应用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测其PKR基因表达情况,并同时检测PKR基因在K562细胞中的表达。结果正常对照组PKR表达阳性率为90.9%,高于加速期的81.8%(P0.05)及急变期的77.8%(P0.05);正常对照组PKR/GAPDH比值为(0.92±0.40)%,高于慢性期的(0.85±0.32)%(P0.05)及加速期的(0.72±0.54)%(P0.05),明显高于急变期的(0.46±0.31)%(P0.01)。K562细胞PKR/GAPDH比值为(0.55±0.13)%。结论 CML细胞及K562细胞株都有一定丰度的蛋白激酶PKR基因表达,为通过激活PKR而靶向诱导CML细胞凋亡奠定理论基础。     

成人慢性髓性白血病骨髓细胞内IL-1受体拮抗剂的表达及意义

为了研究细胞内白细胞介素1受体拮抗剂（intracellular interleukin-1 receptor antagonist，icIL-1ra）在成人慢性髓性白血病(chronic myeloid leukemia，CML)骨髓细胞不同群体细胞内的表达及意义，本研究利用15种不同荧光标记为单克隆抗体，将骨髓细胞分成不同的群体，通过流式细胞术检测未治的，经STI571(signal transduction in-hibitor571)或其它药物治疗的CML慢性期（chronic phase，CP）和加速/急变期（accelerated or blastic phase，AP/BP）病人及正常人骨髓不同群细胞中icIL-lra的表达。结果显示：①IL-lra表达于CML病人及正常人所有的有核细胞内，但各群细胞的表达不同，以粒细胞表达量最高，淋巴细胞表达量最低；②17例未治CML病人骨髓总有核细胞、粒细胞、淋巴细胞icIL-lra平均荧光强度明显低于8例正常人组；③13例骨髓幼稚细胞数大于或等于10％的CML-AP/BP病人骨髓总有核细胞、粒细胞及淋巴细胞icIL-lra平均荧光强度明显低于43例幼稚细胞数小于5％或9例幼稚细胞数为5％-10％的CML-CP病人。结论：CML病人骨髓总有核细胞与正常人相比icIL-lra表达降低。IcIL-lra在CML病人骨髓总有核细胞表达量降低可能是CML疾病进展的因素之一。     

吉西他滨对慢性粒细胞白血病患者骨髓细胞G-CSFR及bcr/abl mRNA的影响

为了观察吉西他滨对慢性粒细胞白血病(CML)患者骨髓粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)及bcr/ablmRNA的作用,收集CML慢性期、急变期患者的及骨髓象正常的非血液病患者骨髓液,分为吉西他滨组(加入吉西他滨,调整浓度为10μg/ml)和对照组,培养48小时后收集细胞。采用流式细胞术检测各组标本骨髓G-CSFR的表达率;采用RT-PCR技术检测各组标本bcr/abl mRNA的表达。结果表明:吉西他滨组CML慢性期、急变期患者及骨髓象正常者骨髓G-CSFR的表达率分别为(50.72±8.57)%、(36.32±4.25)%和(59.42±7.62)%。对照组CML慢性期、急变期患者及骨髓象正常者骨髓粒系G-CSFR的表达率分别为(45.42±6.52)%、(30.58±5.68)%和(58.56±5.54)%。两组CML患者骨髓G-CSFR的表达率分别与骨髓象正常组比较,差异有显著性(p0.05),CML慢性期患者与急变期比较,差异有显著性(p0.05)。吉西他滨组CML患者G-CSFR的表达率与未加药组相应组别比较,差异有显著性(p0.05)。吉西他滨组CML慢性期、急变期患者bcr/abl mRNA表达水平比较,差异无显著性(p0.05)。吉西他滨组与对照组、CML慢性期、急变期患者G-CSFR表达率与bcr/abl mRNA表达水平呈负相关(p0.05)。结论:在体外培养下,吉西他滨可以提高CML慢性期、急变期患者骨髓G-CSFR的表达率,对bcr/abl mRNA表达的作用不明显,CML慢性期、急变期患者G-CSFR表达率与bcr/abl mRNA表达水平呈负相关。     

活化Chk1引起的G2/M期阻滞在调节K562/A02细胞耐药中的机制探讨

本研究探讨活化的Chk1对白血病细胞周期及凋亡的影响,探究Chk1调控肿瘤细胞耐药的机制.以慢性粒细胞白血病细胞系K562及其耐药细胞系K562/A02(耐阿霉素)为研究对象,与阿霉素共孵育后,用流式细胞术检测细胞周期分布,RT-PCR检测Chk1mRNA表达水平,Western blot检测转染前后Chk1磷酸化水平;靶向Chk1shRNA抑制细胞内Chk1的表达后,用流式细胞术检测阿霉素作用后细胞的凋亡情况.结果表明阿霉素致K562/A02细胞阻滞在G2/M期的细胞百分率为(54.12±0.57)%,显著高于K562细胞(36.99±1.28)%; Chk1mRNA表达水平在K562与K562/A02细胞间无显著差异; Chk1磷酸化水平在K562/A02细胞为0.79 ± 0.56,在K562细胞为0.27 ± 1.47,其差异有统计学意义.转染Chk1shRNA后,两株细胞的Chk1磷酸化水平显著下降.转染组K562、K562/A02细胞凋亡率分别是空载体转染组的1.30倍和3.84倍.结论 Chk1的活化水平调控着K562/A02细胞对阿霉素的敏感性.     

新型酪氨酸激酶抑制剂HHGV678对Bcr-Abl野生型细胞株和伊马替尼耐药细胞株抑制作用的体外研究

本研究比较新型的酪氨酸激酶抑制剂HHGV678与伊马替尼(imatinib,IM)在体外对Bcr-Abl野生型和IM耐药细胞株的抑制作用,探索HHGV678替代IM治疗CML及IM耐药CML患者的可能性。以Bcr-Abl野生型细胞株(K562和32Dp210)及16种IM耐药细胞株(K562R和15种Bcr-Abl点突变细胞株)为研究对象,用MTT法检测HHGV678和IM对上述细胞的生长抑制作用;以DNA梯形条带法和Annexin-V/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡;应用Western blot检测HHGV678对上述细胞BCR-ABL融合蛋白及酪氨酸激酶磷酸化表达的影响。结果表明:HHGV678呈剂量依赖性显著抑制Bcr-Abl野生型细胞株和除T315I点突变细胞株以外的IM耐药细胞株生长。比较IC50发现,HHGV678在低剂量下(0.01-0.3μmol/L)抑制K562和32Dp210细胞生长的作用比IM分别强15.5和28倍;而对除T315I点突变细胞株以外的15种IM耐药细胞株细胞的生长抑制作用比IM强1.4-124.3倍。HHGV678抑制上述细胞酪氨酸激酶磷酸化的能力均强于IM。更重要的是HHGV678在10.0μmol/L剂量下诱导IM强耐药细胞株K562R和T315I点突变细胞株的凋亡率分别达到40.06%和33.32%,显著高于IM的19.77%和10.68%。结论:新型酪氨酸激酶抑制剂HHGV678对Bcr-Abl野生型细胞株和IM耐药细胞株,尤其是对IM强耐药细胞株的生长抑制作用明显强于IM,但HHGV678能否成为治疗CML和IM耐药CML患者新的靶向药物,仍有待进一步的研究。     

桂皮醛体外诱导慢性髓系白血病细胞凋亡的机理研究

本研究探讨桂皮醛(cinnamic aldehyde,CA)对慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia,CML)细胞的诱导凋亡作用及其机制。以不同浓度的桂皮醛作用于体外培养的K562细胞和骨髓CML原代细胞,流式细胞术检测细胞凋亡率,Real-time PCR技术检测K562细胞BCR-ABL融合基因表达变化,免疫印迹法检测K562细胞CrkL磷酸化水平和C-MYC蛋白表达。结果表明:桂皮醛可诱导K562和骨髓CML原代细胞凋亡。在K562细胞凋亡过程中,BCR-ABL融合基因mRNA的表达、CrkL蛋白磷酸化及C-MYC蛋白表达均明显受抑。结论 :桂皮醛体外诱导CML细胞凋亡,其机制与BCR-ABL融合基因表达和功能受抑有关。     

人可溶性血管内皮生长因子受体1抑制白血病细胞增殖的研究

本研究通过体外实验探讨人可溶性血管内皮生长因子受体1（sFLT-1）对白血病细胞增殖的抑制作用。用RT—PCR检测白血病细胞株K562、HL-60、U937和骨髓LTC—IC VEGF mRNA、VEGF—R1（FLT-1）mRNA的表达，用流式细胞术检测上述细胞VEGF和VEGF—R1（FLT-1）的表达，ELISA法检测细胞培养上清中VEGF的含量，将sFLT-1加入K562、HL-60白血病细胞株和骨髓LTC—IC培养体系中，应用MTT法计算细胞生长的抑制率。结果显示：白血病细胞株K562、HL-60、U937和骨髓LTC—IC均表达VEGF，以K562表达VEGF量最高。K562和HL-60细胞株还表达FLT-1，U937细胞和骨髓LTC—IC表达的FLT-1表达量很低。sFLT-1明显抑制白血病细胞株K562及HL-60的生长，并且随着sFLT-1浓度的增加，其抑制率增加，以用药后48小时抑制作用最明显。结论：sFLT-1能够抑制某些白血病细胞株的生长，其抑制效应随用药浓度的增加而增加，而sFLT-1对正常骨髓细胞增殖无影响。     

WNK1通过磷酸化激活MAPK7对人慢性髓系白血病K562细胞的影响及相关机制

目的:探讨WNK1通过调控MAPK7对人慢性髓系白血病K562细胞的影响及相关机制。方法:通过体外培养不同肿瘤细胞,采用RT-qPCR和Western blot分析WNK1、MAPK7在不同血液肿瘤细胞系中的表达。通过慢病毒转染siRNA-WNK1至K562细胞,采用流式细胞术分析细胞凋亡情况,以及K562细胞中总MAPK7、磷酸化MAPK7表达的变化,通过CCK-8方法检测细胞增殖,并进行统计学分析。结果:WNK1的mRNA及蛋白在HL-60、THP-1、U266和K562细胞中均高表达,但是在K562细胞中表达水平最高(P<0.05),MAPK7的mRNA及总蛋白表达在HL60、THP-1、U266和K562细胞中均无明显变化(P>0.05),但是在K562细胞中磷酸化MAPK7的表达最高(P<0.05)。转染WNK1 siRNA的K562细胞增殖受到明显抑制、细胞凋亡增加(P<0.05)。转染WNK1 siRNA的K562细胞磷酸化MAPK7蛋白表达显著下降(P<0.05),但是总MAPK7蛋白无明显变化(P>0.05)。结论:WNK1在K562细胞中高表达,能够促进K562细胞增殖、抑制凋亡等恶性细胞生物学行为,其机制可能是促进了下游MAPK7的磷酸化。     

自分泌VEGF对人慢性髓性白血病细胞系K562的作用

血管内皮细胞生长因子（VEGF）是血管内皮细胞特异性的丝裂原,与实体肿瘤的血管生成、生长、转移及不良预后密切相关。最近的报送表明,慢性髓性白血病（CML）病人骨髓过度表达VEGF。然而,VEGF在CML细胞异常增殖中的作用还不清楚。为了探讨自分泌VEGF对CML细胞系K562增殖与凋亡的影响,本研究首次采用正义和反义VEGF121cDNA转染K562细胞,通过RT-PCR及ELISA方法鉴定各转染克隆VEGF mRNA及蛋白的表达。结果显示,转染反义VEGF121 cDNA可以降低K562细胞VEGF的表达,而转染正义VEGF121 cDNA可使VEGF的表达提高3倍以上。MTT,集落形成试验及细胞凋亡检测试验观察：反义VEGF121 cDNA转染可以抑制K562细胞的增殖及其集落形成,而促进其凋亡;正义VEGF121 cDNA转染与其结果相反。本研究结果说明自分泌VEGF在CML细胞系K562的增殖与凋亡起重要作用。     

慢性髓系白血病DNA依赖蛋白激酶催化亚基基因的研究

本研究旨在探讨髓系粒细胞白血病（CML）的DNA依赖蛋白激酶催化亚基（DNA-PKcs）基因表达水平、调控机制及其在CML急性变中的作用。用半定量RT-PCR、Western blot方法分别检测62例CML患者及K562细胞的DNA-PKcs mRNA和DNA-PKcs蛋白表达,并与23例正常人作对照;对26例接受同种异基因外周血干细胞移植（allo-PBSCT）及4例使用伊马替尼治疗的CML患者用RT-PCR、Western blot方法分别动态检测bcr-abl mRNA和DNA-PKcs蛋白表达水平;用伊马替尼体外作用CML患者的单个核细胞（MNC）及K562细胞后,用RT-PCR、Western blot方法分别检测DNA-PKcs mRNA和DNA-PKcs蛋白表达及bcr-abl融合蛋白的酪氨酸磷酸化水平。结果表明：与正常人比较,CML患者及K562细胞的DNA-PKcs蛋白表达量明显降低（P〈0.05）;26例allo-PBSCT及4例使用伊马替尼治疗的CML患者,DNA-PKcs蛋白表达量随着bcr-abl mRNA表达量的降低而升高;伊马替尼体外作用于CML患者MNC及K562细胞后,DNA-PKcs蛋白表达量随着bcr-abl融合蛋白酪氨酸磷酸化水平的降低而升高。结论：bcr-abl融合基因通过转录后机制下调DNA-PKcs蛋白的表达;DNA-PKcs蛋白表达下降可能是CML急性变的机制之一。     

慢性粒细胞白血病错配修复基因的研究

目的 探讨慢性粒细胞白血病（CML）错配修复（MMR）基因的表达水平及调控机制。方法 用半定量RT-PCR方法检测62例CML患者及K562细胞的5个MMR基因（hMSH2、hMSH3、hMSH6、hMLH1、hPMS2）mRNA的表达；用RT-PCR方法动态检测26例进行异基因外周血造血干细胞移植（allo-PBSCT）及4例使用伊马替尼治疗的CML患者ber-abl及MMR mRNA的表达水平；用伊马替尼体外作用于CML患者的单个核细胞（MNC）及K562细胞后，用Western blot方法检测BCR—ABL融合蛋白的酪氨酸磷酸化水平，RT-PCR方法检测MMR mRNA表达水平。结果 与正常人比较，CML患者及K562细胞的hMSH2、hMSH3、hMLH1 mRNA的表达明显降低（P〈0．05）；26例行allo—PBSCT及4例使用伊马替尼治疗的CML患者，其hMSH2、hMSH3、hMLH1 mRNA的表达随着bcr—abl mRNA的表达降低而升高；伊马替尼体外作用于CML患者MNC及K562细胞后，其hMSH2、hMSH3、hMLH1 mRNA的表达随着BCR—ABL融合蛋白酪氨酸磷酸化水平的降低而升高。结论 CML患者、K562细胞hMSH2、hMSH3、hMLH1 mRNA比正常人降低，bcr—abl融合基因抑制hMSH2、hMSH3、hMLH1 mRNA的表达。     

Novel indole retinoid derivative induces apoptosis and cell cycle arrest and modulates AKT and ERK signaling in HL-60 cells

Chemotherapy with targeted drugs is the first line therapy option for acute and chronic myeloid leukemia. However, hematopoietic stem cell transplantation may be used in high-risk patients or patients with failed responses to chemo drugs. Discovery and development of more effective new agents with lower side effects is the main aim of leukemia treatment. In this study, a novel retinoid compound with tetrahydronaphthalene ring was synthesized and evaluated for anticancer activity in human chronic and acute myeloid leukemia cell lines K562 and HL-60. Novel N-(1H-indol-1-yl)-5,5,8,8-tetramethyl-5,6,7,8-tetrahydronaphthalene-2-carboxamide was synthesized based on molecular hybridization of the two different bioactive structures retinoid head and indole. The effects of the synthesized carboxamide compound, which was referred to as compound 5 , were determined in K562 chronic myeloid leukemia and HL-60 acute myeloid leukemia cell lines and L929 fibroblast cell line, which served as a control. Colorimetric MTT and caspase3 activity tests, flow cytometry, western blot, and microscopic examinations were used to evaluate biological activity. Compound 5 more effectively induced cell death in HL60 cells in comparison to K562 cells and L929 fibroblast cells. Therefore, further mechanism of cell death was investigated in HL60 cell line. It was found that compound 5 induced remarkable cytotoxicity, caspase3 activation, and PARP fragmentation in HL60 cells. Flow cytometric staining showed that the percentage of cells arrested in G0/G1 was also increased with compound 5 treatment. Important modulator proteins of cell proliferation p-ERK, p-AKT, and p-m-TOR were also found to be inhibited with compound 5 treatment. Collectively, our results reveal compound 5 , which is a novel indole retinoid compound as a potential active agent for the treatment of acute promyelocytic leukemia.