犬脱钙骨基质复合骨髓间充质干细胞的体外培养

目的:制备犬脱钙骨基质(demineralized bone matrix,DBM),研究DBM作为骨组织工程支架材料的可行性。方法:杂种犬的股骨行脱脂、脱钙、脱非胶原蛋白、冷冻干燥、灭菌制成DBM,与骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcells,MSCs)复合,应用倒置相差显微镜、扫描电镜观察脱钙骨基质的结构及细胞在材料表面的生长情况。结果:犬脱钙骨基质具有三维立体网孔结构,平均孔隙直径为(254.39±88.71)μm,孔隙率约为70%。与MSCs复合培养后,细胞黏附其上,上架率高,生长状态良好,增殖迅速,并分泌大量细胞外基质。结论:DBM具有良好的生物相容性。     

异体脱钙骨基质粉复合自体骨髓构建可注射人工骨的实验研究

目的:探讨异体脱钙骨基质粉(DBM)复合自体骨髓(AM)构建可注射人工骨替代材料的可行性,检验其异 位诱导成骨能力。方法:将24只新西兰兔随机分为3组,分别在背部皮下注射DBM／AM、DBM、AM,术后2,4周取 材,通过大体观察、X线、组织学检查、扫描电镜研究以及碱性磷酸酶(ALP)测定,进行比较观察。结果:DBM与 AM按照一定比例复合后可以通过注射途径应用,X线、组织学检查结果均表明DBM／AM组有较多新骨形成,新生 骨具有丰富的哈氏系统结构,骨基质内胶原纤维的结构排列交错紊乱,新生骨边缘可见大量的成骨细胞突起;DBM 组仅见微量软骨和骨新生,AM组诱导出少量新生骨。DBM／AM组ALP水平较DBM组、AM组高,统计学上具有显 著性差异(P<0.01)。结论:DBM/AM复合可注射人工骨具有良好的骨诱导性和应用价值。     

骨髓基质干细胞与冻干脱矿骨基质材料体外附着的实验研究

目的 :研究骨髓基质干细胞 (bonemarrowstromalcells,BMSCs)经诱导、扩增后与冻干脱矿骨基质 (freeze -drieddemineralizedbonematrix ,fdDBM)的相容性及体外附着规律 ,为进一步体内回植提供研究基础。方法 :抽取成年犬骨髓 ,用全骨髓培养法获取单核细胞 ,经条件培养液体外诱导、扩增后 ,以不同浓度接种于制备的fdDBM上 ,通过倒置相差显微镜、扫描电镜观察细胞与材料的附着情况并以MTT实验了解适宜的接种浓度。结果 :当接种密度为 1.0× 10 6/cm2 时 ,细胞与支架材料之间有最大附着量。结论 :BMSCs能在fdDBM上粘附并生长 ,相容性良好 ,是理想的骨组织工程支架材料。     

犬骨髓基质干细胞向成骨细胞诱导分化及细胞片层的制备

目的分离培养犬骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）并向成骨细胞诱导分化,制备骨髓基质干细胞的细胞片层。方法密度梯度离心法分离犬骨髓基质干细胞,接种于DMEM成骨诱导培养基,向成骨细胞诱导分化,利用温度反应性培养皿的温度感应性,制备细胞片层。观察犬BMSCs、成骨细胞诱导分化及细胞片层形态学特点与生物学特性。结果分离培养出犬BMSCs,成功地向成骨细胞实现诱导分化,并观察到钙结节。利用温度反应性培养皿的温度感应性,收获了完整的细胞片层。结论细胞片层技术与传统的骨组织工程方法相结合,将有望构建出含板层骨结构的大块组织工程骨。     

骨髓基质干细胞的体外培养及其细胞片层制备

目的探讨犬骨髓基质干细胞(BMSCs)的体外培养及成骨向诱导后细胞片层的制备方法。方法密度梯度离心法分离培养犬BMSCs,向成骨细胞方向诱导分化后,倒置相差显微镜和扫描电镜下进行形态学观察;将诱导后的BMSCs接种至温度反应性培养皿中,37℃、5%CO2饱和湿度培养,然后降温至20℃制备BMSCs的细胞片层。结果原代培养的BMSCs呈长梭形,漩涡状生长;向成骨细胞诱导后的BMSCs呈卵圆形或多角形,当温度降至20℃时,BMSCs从温度反应性培养皿上完全脱落。扫描电镜下观察可见到富含细胞外基质的完整BMSCs细胞片层。结论应用密度梯度离心法可有效获取BMSCs,并向成骨细胞诱导分化;应用温度反应性培养皿能获取完整的BMSCs细胞片层可包裹支架,并用于功能性成骨。     

大鼠骨髓基质细胞与β-磷酸三钙体外复合培养

目的观察大鼠骨髓基质细胞与β-磷酸三钙复合后，细胞在材料表面的贴附、伸展及生长情况，探讨将细胞与β-磷酸三钙的复合体植入体内的最佳时间。方法分离的骨髓基质细胞用舍10％胎牛血清的DMEM培养，添加矿化液，将诱导培养后的细胞与预先处理过的β-磷酸三钙复合，复合后每日检测细胞生长增殖情况，并在扫描电镜下观察细胞在β-磷酸三钙表面的贴附情况。结果骨髓基质细胞接种后，在材料表面贴附良好，复合后7天细胞数量最多，是植入体内的最佳时间。结论β-磷酸三钙的生物相容性良好，可以作为骨组织工程的支架材料。骨髓基质细胞贴附材料后继续保持增殖活性，表达成骨细胞的表型，是理想的种子细胞。     

犬骨髓基质细胞片层在构建组织工程骨中的作用

目的:探讨犬骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)细胞片层在构建组织工程骨中的价值.方法:制备犬同种异体脱钙骨基质(dermineralized bone matrix,DBM).将人重组骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)复合到DBM上.抽取犬髂骨骨髓,采用密度梯度离心法分离犬骨髓基质细胞(BMSCs).将经成骨诱导的第3代细胞接种于温度反应性培养皿中,制备BMSCs细胞片层.用得到的BMSCs细胞片层包裹DBM/rhBMP-2/BMSCs复合体,植入犬背阔肌血运丰富的肌筋膜下为实验侧,以无BMSCs细胞片层包裹的DBM/rhBMP-加MSCs复合体为对照侧.术后4、8、12周取材,行组织学观察,评价体内异位成骨的情况.采用SPSS13.0软件,对数据进行两样本均数差别的t检验.结果:实验侧成骨面积大于对照侧,2组差异有显著性(P<0.05).术后12周,实验侧生成大量板层骨,有哈弗系统形成,骨髓腔内有红骨髓.对照侧有板层骨形成,无哈弗系统形成,骨髓腔内无红骨髓.结论:BMSCs细胞片层可促进具有致密板层骨和哈弗系统的组织工程骨的形成.     

应用骨髓基质细胞片层构建组织工程骨的实验研究

目的 探讨犬骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)片层在构建组织工程骨中的价值。方法 抽取犬髂骨骨髓,采用密度梯度离心法分离犬骨髓基质细胞(BMSCs)。制备犬同种异体脱钙骨基质(dermineralized bone matrix,DBM)。将人重组骨形态发生蛋白-2(recombination human bone morphogenetic protein-2,rhBMP-2)复合到DBM上。将经成骨诱导的第3代细胞接种于温度反应性培养皿中,制备BMSCs细胞片层。用得到的BMSCs细胞片层包裹DBM/rhBMP-2/BMSCs复合体,植入犬左侧背阔肌肌筋膜下为实验组,以无BMSCs细胞片层包裹的DBM/rhBMP-2/BMSCs复合体植入犬右侧背阔肌肌筋膜下为对照组。术后8、12、16周取材行组织学观察,评价体内异位成骨的情况。结果 成骨面积实验组(对照组,两组差异有显著性(P<0.05)。术后16周,实验组有大量板层骨形成,有哈弗氏系统形成,骨髓腔内有红骨髓。对照组有板层骨形成,无哈弗氏系统形成,骨髓腔内无红骨髓。结论 BMSCs细胞片层可促进具有致密板层骨和哈弗氏系统的组织工程骨的形成。     

骨髓基质干细胞与不同支架材料复合异位成骨能力的实验研究

目的:研究骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)与不同支架材料复合后的异位成骨能力。方法:将体外诱导培养的成年犬骨髓基质干细胞,以1×106/cm2的密度接种到冻干骨基质(fdDBM)、磷酸三钙(TCP)、孔径分别为200μm及500μm的珊瑚羟磷灰石(CH200、CH500)等支架材料上,分别于体外培养的第4￣7天进行扫描电镜及石蜡切片HE染色,了解细胞在不同支架上的黏附及生长情况,并于1周后将大小为10mm×5mm×2mm的上述细胞支架复合物(fdDBM、TCP、CH200、CH500)分别植入裸鼠(n=8)背部皮下,每只裸鼠均植入4个实验组及1组无细胞的fdDBM空白支架对照组。9周后,取材行石蜡切片及HE染色,以IMAGER-PROPLUS软件测量每组的新生骨小梁量,并采用SAS软件包行单因素方差分析。结果:犬BMSCs与4种支架材料均黏附良好,TCP、CH200及CH5003组各样本均能观察到新骨形成,fdDBM及fdDBM空白对照组分别有75%、25%的样本有新骨形成;其中,TCP组的TBV值(28.2%±2.86%)显著高于CH200组(24.1%±4.12%)及CH500组(18.1%±4.66%)(P<0.01)。结论:BMSCs与4种材料的相容性良好。TCP与BMSCs复合后异位成骨效果显著,是很有希望的骨组织工程支架材料。     

珊瑚、异体脱钙骨、自体骨髓复合可注射骨替代物异位成骨的研究

目的 :检验珊瑚 (NC)、异体脱钙骨基质 (DBM )、自体骨髓 (AM )复合可注射骨替代材料的异位诱导成骨能力。方法 :将 2 4只新西兰兔随机分为 4组 ,分别在背部皮下注射NC/DBM /AM、NC/DBM、NC/AM、NC ,术后 2、4周取材 ,通过X线、组织学检查、碱性磷酸酶 (ALP)测定 ,进行比较观察。结果 :X线、组织学检查结果均表明NC/DBM /AM组有较多新骨形成 ,NC/AM组诱导出少量骨 ,NC/DBM组仅见微量软骨和骨新生 ,NC组未见新生骨。NC/DBM /AM组ALP水平较NC/DBM组、NC/AM组、NC组高 ,统计学上具有显著性差异 (P <0 .0 1)。结论 :NC/DBM /AM复合可注射骨替代材料具有良好的骨诱导性和临床应用价值     

外周血来源的间充质干细胞与内皮祖细胞体外构建血管化组织的研究

目的利用两种外周血细胞在体外构建出血管样组织。方法从外周血提取内皮祖细胞与间充质干细胞并鉴定,在纤维蛋白凝胶中以不同的密度培养,在显微镜下观察至第7天。结果兔外周血可以提取出内皮祖细胞与间充质干细胞,内皮祖细胞与间充质干细胞的比值为100万/m L:200万/m L时可以在体外形成血管样结构。结论外周血中可以提取出特定细胞并在体外共培养形成血管样组织。     

内皮祖细胞对骨髓间充质干细胞－种植体复合物成骨能力的影响

目的：研究内皮祖细胞（EPCs）对骨髓间充质干细胞（BMSCs）膜片－种植体复合体成骨能力的影响。方法：分离培养大鼠 BMSCs 并采用细胞膜片技术培养细胞膜片;分离培养大鼠骨髓来源 EPCs;将 EPCs 加载于 BMSCs 细胞膜片上并检测相关基因;制作细胞膜片－种植体复合体并植入裸鼠皮下,8周取材,行 Micro-CT 检查及组织学检测。结果：体外实验显示EPCs 加载于 BMSCs 细胞膜片后成骨相关 Runx-2、ALP、BMP2和成血管相关 VEGF 的基因表达提高;裸鼠体内实验取材 Mi-cro-CT 检查显示加载 EPCs 组成骨量较高,HE 切片显示加载 EPCs 组成骨面积较多,免疫组化检测显示加载 EPCs 组 Runx2、BMP2表达较高。结论：加载 EPCs 能提高 BMSCs-种植体复合物的成骨能力。     

组织工程骨修复9例颅骨缺损畸形初步报道

目的：探讨利用自体骨髓间充质干细胞（BMSC）作为种子细胞的组织工程骨修复外伤后颅骨缺损畸形的可行性。方法：运用自体BMSC组织工程骨技术,对9例外伤术后颅骨缺损患者行颅骨修复手术。抽取患者自体骨髓,密度梯度离心法分离BMSC,经体外扩增和成骨诱导后,接种部分脱钙骨支架材料,构建组织工程骨。细胞材料复合物体外共培养1周后,手术植入颅骨缺损区。分别于术后1周和3、6、12个月进行临床外形和三维CT检查,随访治疗效果。结果：术后1周三维CT显示,颅骨缺损区被所植入的组织工程骨填充,头颅外形明显改善。术后3至12个月CT显示,组织工程骨形成并修复颅骨缺损,新生骨与骨缺损断端融合。9例患者中2例术后失访,2例高龄患者及大面积骨缺损患者发生不同程度的组织工程骨吸收现象,其余均良好地修复了颅骨缺损。结论：通过选择适宜的病例,以自体BMSC作为种子细胞,运用组织工程技术可以在人体内形成稳定的组织工程化骨并修复颅骨缺损。     

大鼠骨髓内皮细胞的分离培养及其形态特征

目的：分离培养大鼠骨髓内皮并进行生物学鉴定。方法：应用Peroll细胞分离介质（密度1．04－1．06g/ml),将SD大鼠长骨骨髓经非连续梯度离心后收集位于中层的细胞进行培养,观察细胞生长状况,绘制细胞生长曲线并以透射电镜及Ⅷ因子免疫组化方法对培养细胞进行鉴定。结果：细胞圆型单层融合贴壁生长,平均直径15μm,单个核并位中央,群体倍增时间约为37h;Ⅷ因子免疫组化染色阳性;透射电镜显示细胞内具有特征性的W－P小体。结论：采用非连续梯度离心沉降法可获得高纯度的骨髓内皮细胞,该细胞具有与血管内皮细胞共同的特征。     

釉基质蛋白对骨髓基质细胞分泌TGF-β1的影响

目的：探讨釉基质蛋白(EMPs)对大鼠骨髓基质细胞(rMSCs)分泌内源性转化生长因子β1(TGF－β１)的影响。方法：采用全骨髓法培养rMSCs，通过酶联免疫测定法(ELISA)测定EMPs对rMSCs分泌TGF－β1的浓度效应和时间效应。结果：EMPs作用后，实验组rMSCs分泌TGF－β1明显高于对照组，且有浓度依赖性。结论：EMPs能有效促进rMSCs分泌TGF－β1。     

Influence of porcine-derived collagen matrix on endothelial progenitor cells: an in vitro study

Porcine-derived collagen matrix (PDCM) has been reported as a promising alternative to autogenous soft tissue grafts in periodontal plastic surgery. The aim of this study was to analyze the influence of a novel PDCM on endothelial progenitor cells (EPC) in vitro. EPC were isolated from human peripheral blood, cultured and transferred on the PDCM (mucoderm^®). Tissue culture polystyrene surface (TCPS) served as control. Cell viability of EPC on PDCM was measured by a MTT and PrestoBlue^® assay. Migration ability was tested using a Boyden migration assay. A ToxiLight^® assay was performed to analyze the influence of PDCM on adenylate kinase (ADK) release and apoptosis rate of EPC. Using the MTT assay, EPC cultured on PDCM demonstrated a significantly increased cell viability compared to the control group at days 3, 6 and 12 (p each <0.001). According to the PrestoBlue^® assay, EPC showed a significant increase of cell viability compared to the control group at 48, 72, and 96 h (p each <0.001). In the Boyden migration assay, a significantly increased EPC migration ability could be observed after 3–12 days (p each ≤0.001). No significantly increased apoptosis rate of EPC on PDCM could be observed with exception after 96 h (p each >0.05). Overall, our results suggest a good biocompatibility of PDCM without any cytotoxic effects on EPC, which might support a rapid revascularization and therefore a sufficient ingrowth of the PDCM.     

培养状态下成人骨髓基质细胞的生长特性

目的研究培养状态下成人骨髓基质细胞的生长特性,为自体骨组织工程的功能细胞培养提供实验基础研究。方法培养健康成人骨髓基质细胞连续8代,测定第3、6代细胞的生长曲线、分裂指数、贴壁率及倍增时间。结果所测第3、6代细胞生长曲线基本相同,12h内细胞贴壁率达88.54%,分裂指数最高达15‰。结论在本实验条件下,细胞生长较稳定,接种成活率较高,增殖速度较快,可用于自体骨组织工程。