人牙髓干细胞在钛金属表面向成骨细胞样细胞分化的实验研究

目的：探讨矿化液诱导条件下人牙髓干细胞( human dental pulp stem cells,HDPSCs)在钛金属表面向成骨细胞样细胞分化的潜力。方法将HDPSCs接种于钛金属板表面,于第3、7d时观察其增殖状态。将HDPSCs接种于钛金属板表面进行矿化液诱导,于诱导的第0、3、5、7、14、21、28d时,采用RT-PCR检测其牙本质涎磷蛋白( DSPP)、碱性磷酸酶( ALP)、骨涎蛋白( BSP)和骨钙素( OCN)的基因表达。 Western印迹分析、免疫荧光检测BSP及OCN蛋白表达。对照组为矿化液诱导培养皿中的HDPSCs,检测指标、方法基本相同,免疫细胞化学染色检测OCN蛋白表达。结果钛金属板上 HDPSCs增殖迅速,表现出良好的生物相容性。两组细胞均自诱导第3天ALPmRNA呈高表达、DSPP始终不表达。培养皿组BSP、OCNmRNA于第5天开始表达,并随时间延长而表达增高;钛金属组BSP、OCNmRNA表达于第14天出现第一峰值,随后有所下降,28天再次升高。两组BSP蛋白表达趋势与其RT-PCR结果一致,第5天 OCN染色阳性。结论钛金属表面 HDPSCs 经矿化液诱导向成骨细胞样细胞分化。     

金属蛋白酶解离素28对人牙髓干细胞生物学功能的影响

目的:探讨金属蛋白酶解离素28(ADAM28)基因对人牙髓干细胞(HDPSCs)增殖、分化、凋亡特性的影响和可能的作用机制.方法:体外分离培养、鉴定人牙髓干细胞(HDPSCs),应用基因重组构建ADAM28真核表达质粒并转染HDPSCs,应用四唑盐(MTT)比色法、酶动力学法和流式细胞术(FCM)检测ADAM28对HDPSCs生物学特性的影响.应用免疫细胞化学和图像分析技术检测ADAM28对HDPSCs表达牙本质涎磷蛋白(DSPP)、骨涎蛋白(BSP)、骨桥蛋白(OPN)的影响.采用SPSS13.0软件包的SNK检验进行统计学分析.结果:成功构建并转染ADAM28真核质粒,真核质粒转染组HDPSCs的增殖活性、增殖指数显著低于空载体组和未转染组,碱性磷酸酶(ALP)分泌水平及凋亡细胞百分比明显上升,差异显著(P＜0.05);HDPSCs内DSPP的表达水平显著提高(P＜0.05).结论:ADAM28可显著抑制HDPSCs增殖,促进ALP的分泌活性和HDPSCs内DSPP的表达,显著诱导HDPSCs的凋亡.     

牙髓干细胞向成牙本质样细胞分化过程中基因表达研究

目的：分离培养来源于人成体牙髓组织的干细胞(dental pulp stem cells，DPSC)，分析研究其在未分化状态及在矿化诱导液中基因表型的变化：方法：采用胶原酶消化法获得人牙髓组织的单细胞悬液，14 d后挑取细胞克隆，分别在普通培养基和矿化诱导培养基中进行培养，利用RT-PCR，图像分析检测细胞基因表型变化。结果。未诱导的DPSC不表达牙本质特异性蛋白(dentin phosphprotein,DSPP)及骨涎蛋白(Bone sialoprotein，BSP)，表达部分成骨(osteocalcin,OCN alkaline phsphatase,ALP)相关表型，低表达转录因子核心结合因子(Cbfa-1)；与末诱导的DPSCs相比较，在成骨诱导中DPSCs表达DSPP和BSP，骨相关基因表达也相应上调。结论：DPsCs在矿化诱导液的作用下向成牙本质样细胞分化，其过程有可能是通过谱系特异表犁的表达或表达上调实现的。     

Chir99021调控Wnt/β-catenin信号通路干预干细胞成骨/成牙分化的研究

目的:探讨Chir99021调控Wnt/β-catenin信号通路干预人牙髓干细胞成骨/成牙分化及其可能的机制.方法:分离纯化和培养人前磨牙牙髓干细胞(HDPSCs),免疫荧光检测牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein,DSP)和波形蛋白(Vimentin),CCK-8检测不同浓度Chir99021对HDPSCs细胞增殖作用的影响.将HDPSCs分为3组培养,第1组正常培养,为空白对照组;第2组成骨诱导液培养,为实验对照组;第3组成骨诱导液+Chir99021培养,为实验组.15 d后用茜素红染色对各组细胞进行钙沉积物检测;qPCR于5、10、15 d检测各组轴抑制蛋白2(axis-inhibition protein2,Axin2)、β连环蛋白(β-catenin)及糖原合成激酶3(GSK-3β)水平;Western blot于5、10、15 d检测各组RUNT相关转录因子2(Runx2)、碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OC)、牙本质涎磷蛋白(DSPP)和Ⅰ型胶原的表达.结果:分离培养后的HDPSCs中DSP和Vimentin呈阳性表达;Chir99021浓度为2000 nmol/L时,细胞增殖情况最明显;茜红素染色显示实验组钙沉积物较其余两组显著增加;实验组中Axin2、β-catenin显著上升,GSK-3β显著下降(P<0.05);Runx2、ALP在实验组及实验对照组中有显著表达(P<0.05),OC在实验组中显著表达(P<0.05);DSPP、Ⅰ型胶原在实验组中显著表达(P<0.05).结论:Chir99021通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进HDPSCs的增殖和成骨/成牙分化.     

永生化成牙本质细胞表达牙本质基质蛋白的实验研究

目的　探讨永生化人成牙本质细胞样细胞系hTERT-hOd-l表达牙本质基质蛋白的情况。方法　矿化液培养hTERT-hOd-l细胞5周,检测骨钙素(OC)分泌量和碱性磷酸酶(ALP)活性。采用免疫组织化学、RT-PCR和原位杂交方法检测Ⅰ型胶原、骨涎蛋白(BSP)、牙本质基质蛋白1 (DMP1)以及成牙本质细胞标志物牙本质涎磷蛋白(DSPP) 和牙本质涎蛋白(DSP)在细胞中的表达。结果　在矿化液诱导下,hTERT-hOd-l细胞ALP活性和OC分泌量升高。 hTERT-hOd-l细胞在mRNA水平上表达BSP、DMP1和DSPP,在蛋白质水平上表达DSP和Ⅰ型胶原。结论　hTERT- hOd-l细胞在体外表达牙本质基质蛋白,具有矿化的潜能。     

山羊乳牙牙髓细胞分离培养与矿化诱导的体外研究

目的:分离培养山羊乳牙牙髓细胞,研究其矿化诱导前、后生物学特性的改变。方法:采用改良酶解组织块法培养山羊乳牙牙髓细胞,应用免疫组化方法(SAB法)对第2代细胞进行来源检测,经矿化诱导培养的第4代细胞与常规培养细胞做对照,进行相关生物学特性检测,包括细胞增殖能力、矿化能力、细胞形态改变、蛋白OCN表达、相关成骨基因(ALP、COL-I、OCN、OPN)表达水平。结果:改良酶解组织块法可较快地培养出山羊乳牙牙髓细胞,细胞爬出时间为培养的第3～4天。第2代细胞抗波丝蛋白阳性,抗角蛋白阴性,证明其间充质来源。MTT法测定显示,未诱导细胞的增殖能力明显高于矿化诱导后的细胞。与未诱导细胞相比较,矿化诱导的细胞ALP染色、钙结节茜素红染色均呈强阳性,免疫组化OCN阳性表达。诱导14d后,定时定量PCR检测证实成骨基因OCN、ALP显著上调。结论:本实验采用改良酶解组织块法成功培养出山羊乳牙牙髓细胞;连续矿化诱导培养14d后,山羊乳牙牙髓细胞分泌矿化基质,具有向成骨细胞分化和形成骨组织的潜能。     

矿化液对人牙髓干细胞生物学特性的影响

目的 探讨矿化液对人牙髓干细胞(DPSCs)生长特性的影响.方法 用含一定浓度的β-甘油磷酸钠、抗坏血酸和地塞米松的矿化液诱导人牙髓干细胞,通过倒置相差显微镜、透射电镜、免疫细胞化学染色、von Kossa染色方法,观察和检测矿化液诱导后细胞形态、超微结构、表型和矿化基质分泌的变化,以未诱导组为对照.结果 矿化液连续培养7d,人DPSCs细胞形态明显改变,呈牙本质样极化细胞表现,另一侧为增大的胞体;超微结构显示,诱导后的细胞体积增大,核浆比例下降,胞浆细胞器丰富;诱导前细胞不表达牙本质涎磷蛋白(DSPP)和骨钙素(OC),诱导后均表达;连续培养21d,诱导组细胞形成多个矿化结节.结论 矿化液能诱导人DPSCs向成牙本质细胞样细胞分化并产生矿化基质.本研究从细胞水平上揭示了人DPSCs向成牙本质细胞分化机理,为人DPSCs应用于牙髓损伤的修复再生提供了依据.     

骨桥蛋白与矿化液诱导牙髓干细胞向成骨细胞分化的对比研究

目的:比较骨桥蛋白(OPN)和矿化液对牙髓干细胞(DPSCs)向成骨细胞分化的作用。方法:矿化液培养DPSCs作为矿化液组,添加适宜浓度OPN作为OPN组,茜素红染色法检测矿化结节的形成;RT-RCR检测骨涎蛋白(BSP)、Runt相关转录因子2(Runx-2)、骨钙蛋白(OCN)、Ⅰ型胶原(Col-1)等骨源性基因表达情况。结果:茜素红染色显示诱导培养28 d后2组出现的矿化结节数量相近(P>0.05)。OPN诱导培养7 d后2组DPSCs骨源性基因表达均成阳性,其中OPN组BSP基因表达水平高于矿化液组(分别为0.864±0.112和0.514±0.068,P<0.05);OPN组Runx-2基因表达水平低于矿化液组(分别为0.186±0.017和0.324±0.058,P<0.05);Col-1及OCN基因表达水平相近(P>0.05)。结论:OPN和矿化液对DPSCs的诱导能力相近。     

矿化液促进犬牙周膜细胞异位成骨实验

目的：探讨矿化液对犬牙周膜细胞（PDLCs）体外诱导分化、体内成骨作用的影响。方法：酶消化法原代培养成年犬前磨牙PDLCs并鉴定。再以含地塞米松、β甘油磷酸钠和抗坏血酸的矿化液连续诱导PDLCs，观察细胞形态变化，检测骨涎蛋白（BSP）表达碱性磷酸酶（ALP）活性。将诱导14d的细胞接种于钠米羟基磷灰石-胶原-聚乳酸复合支架（nHAC／PLA）上，体外培养5d后植入犬自体皮下，8W取材HE、三色法染色评价骨形成情况。以未诱导细胞为对照。结果：PDLCs波形丝蛋白（VIM）表达阳性，角蛋白（CK）阴性。矿化诱导后强阳性表达BSP，ALP活性也显著升高，提示细胞向成骨样细胞分化。体内移植8W，组织学见对照组主要形成纤维样组织而诱导组形成大量骨样组织。结论：矿化液具有促进PDLCs体外向成骨细胞分化和体内成骨作用。     

应用人恒牙牙髓干细胞与明胶支架构建组织工程骨的研究

目的构建由人恒牙牙髓干细胞和三维明胶支架组成的组织工程骨,并验证其成骨效果。方法从正畸治疗减数拔除的恒前磨牙牙髓组织中应用酶消化法获得牙髓细胞,单抗Stro-1标记、免疫磁珠阳性分选系统分选获得牙髓干细胞。第3代细胞被分别接种到6孔板或三维明胶支架上进行成骨向诱导培养,诱导14天后支架组移植入裸鼠背部皮下。应用ALP染色、Von Kossa染色验证牙髓干细胞的体外成骨能力;应用X线、HE染色和免疫组化验证组织工程骨的体内成骨效果。结果牙髓干细胞体外成骨向诱导后7、14天ALP染色呈阳性;14、21天Von Kossa染色形成矿化结节。在体内组织工程骨成骨明显,X线显示实验侧支架内有团块状高密度阻射影;HE染色显示大量的骨组织形成;免疫组化显示骨结构区域骨桥蛋白、骨涎蛋白和骨钙素阳性表达。结论人恒牙牙髓干细胞和明胶支架构建形成了组织工程骨。     

成体干细胞及牙源性干细胞的研究进展

人体干细胞是在人体生长和发育过程中起主干作用的细胞,干细胞研究是目前生物医学研究的前沿领域,本文着重对成体干细胞和牙源性干细胞的研究现状及进展作一介绍。     

外周神经胶质细胞：牙髓干细胞的新来源

来源于早期外胚间充质组织头部的神经嵴细胞迁移衍生出牙髓间充质干细胞,随后这些细胞产生牙髓细胞和成牙本质细胞。神经胶质细胞是另外一个神经嵴细胞衍生迁移而形成的细胞系。神经胶质细胞有广泛的分化发育潜能,研究发现神经胶质细胞可以分化为神经细胞和牙髓间充质干细胞,并且神经胶质细胞的不同分化发育阶段间可以互相转变。通常认为,大多数组织中的间充质干细胞来源于血管周细胞,但有研究发现相当一部分牙髓间充质干细胞来源于外周神经相关的神经胶质。本文通过对神经嵴细胞、牙髓间充质干细胞和神经胶质细胞的分化发育以及神经胶质细胞的衍生细胞的概述,介绍牙髓再生领域一种新的更有前景的牙髓间充质干细胞来源。     

Role of injured endothelial cells in the recruitment of human pulp cells

In restorative dentistry, deep cavity preparation may lead to partial destruction of the odontoblastic layer. However, newly formed odontoblast-like cells can replace the necrotic odontoblasts and secrete a reparative dentine matrix. While growth factors such as transforming growth factor beta1 (TGFbeta1) and bone morphogenetic proteins (BMP-2 and BMP-4) seem to be involved in the proliferation and differentiation of pulp cells, little is known about the migration of the newly proliferating stem cells to the injury site. Our hypothesis was that endothelial cell injury may be involved in directing these cells towards the injury site. For this study, human pulp fibroblasts and L929 cells were fluorescence-labeled by transduction with the Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP). Similarly, human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were labeled with the Discosoma Red Fluorescent Protein-2 (DsRed2). Cell migration was then studied in an insert cell culture system. The HUVEC cells were cultured in the lower compartment while the human pulp fibroblasts or L929 were in the upper compartment. After artificial injury to the HUVEC cells, only human pulp fibroblasts migrated to the lower compartment. At early time periods (4 days), migrating cells were randomly localized on the HUVEC layer. However, after 14 and 20 days, they were perfectly aligned along the injury site. In the absence of injury, no migration was observed. These results suggest that, the endothelial injury is involved in the recruitment of odontoblast-like cells at the injury site.     

胚胎干细胞向神经干细胞分化的研究进展

干细胞是一种具有多向分化潜能的细胞,能向骨、软骨、肌肉、血管和神经分化。在组织工程与临床应用中,神经干细胞常用于组织神经系统修复与再造萎缩、坏死、缺损的神经元以及神经胶质。神经干细胞可由胚胎干细胞、骨髓干细胞、问充质干细胞、表皮干细胞和脂肪干细胞等在不同的培养条件和特定的细胞生长因子作用下定向诱导其向神经细胞分化。滑膜间充质干细胞的多向分化能力使其在神经缺损与修复应用中具有广阔的前景。下面就近年来利用胚胎干细胞向神经细胞分化的研究进展作一综述。     

人牙周膜干细胞体外诱导分化为神经元样细胞的实验研究

目的体外定向诱导人牙周膜干细胞分化为神经元样细胞,探讨人牙周膜干细胞的多向分化潜能。方法体外分离、培养人牙周膜细胞,待细胞达一定量后用有限稀释法进行克隆化培养,筛选鉴定牙周膜干细胞（PDLSC）,用含10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的预诱导培养液诱导培养24 h,然后换用含5 mmol/L β-巯基乙醇（β-ME）的诱导培养液诱导培养6 h,光镜下观察诱导细胞形态学的改变,免疫荧光、RT-PCR等方法检测鼠抗人神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经丝蛋白（NF）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。同时以未诱导细胞为对照。结果体外诱导培养6 h细胞即发生形态学改变,可看到典型的神经元样细胞;免疫荧光、RT-PCR检测诱导细胞表达神经元细胞特异性标志NSE、NF,未诱导细胞无表达。结论人牙周膜干细胞在体外可以诱导分化为神经元样细胞,具有多向分化的潜能。     

癌细胞与间质细胞共培养的形态学观察

目的研究在体外间质细胞对癌细胞生长的影响,为肿瘤治疗提供理论基础。方法体外分离培养口腔癌间质细胞（TSF）和正常口腔组织间质细胞（NSF）,并分别与口腔舌鳞癌Tca8113细胞系共培养,观察两者相互影响的方式。结果癌细胞与NSF共培养时,癌细胞增生快,迅速形成集落,间质细胞增生慢,逐渐连接成片状和网状,癌细胞被分割包围,癌细胞单个或成片的收缩、变圆、悬浮,最终均为间质细胞排挤,位置被占据。癌细胞与TSF共培养,间质细胞增生慢,但伸出多个突起,增生活跃的癌细胞先是沿突起两侧增生,或伸出短小的突起与TSF的突起或胞体相连,增生的癌细胞逐渐覆盖TSF的突起,并最终完全覆盖TSF的胞体,最后覆盖的是细胞核所在的部位。随后TSF的结构溶解消失,留下多个癌细胞排列成TSF的形状。结论NSF排斥癌细胞,不利于癌细胞生长或抑制癌细胞的生长;TSF可促进癌细胞的生长,是癌细胞生长的基础和前进的桥梁。     

Influence of bisphosphonates on endothelial cells, fibroblasts, and osteogenic cells

Bisphosphonate-associated osteonecrosis of the jaws (BP-ONJ) is a side effect primarily in patients receiving highly potent nitrogen-containing bisphosphonates. The exact etiopathology is unknown. In addition to reduced bone remodeling, there may also be an impact on soft tissues. The impact of nitrogen- (ibandronate, pamidronate, zoledronate) and non-nitrogen-containing bisphosphonates (clodronate) on human umbilicord vein endothelial cells (HUVEC), fibroblasts and osteogenic cells was analyzed employing cell viability testing and a scratch wound assay. The impact on the cell morphology of vital-stained osteogenic cells was investigated by cell visualization (confocal laser scanning microscopy). Pamidronate and zoledronate had the greatest negative impact on all cell lines, whereas the impact of ibandronate and clodronate was less distinct. The effect of clodronate on HUVEC and fibroblasts was particularly marginal. BP-ONJ could be a multifactorial event with multicellular impairments. This might result in altered wound healing. The increased impact of the highly potent bisphosphonates, particularly on non-bone cells, may explain the higher occurrence of BP-ONJ.     

Bone marrow cells can give rise to ameloblast-like cells

Post-eruptive loss of ameloblasts requires identification of alternative sources for these cells to realize tooth-tissue-engineering strategies. Recent reports showed that bone-marrow-derived cells can give rise to different types of epithelial cells, suggesting their potential to serve as a source for ameloblasts. To investigate this potential, we mixed c-Kit(+)-enriched bone marrow cells with embryonic dental epithelial cells and cultured them in re-association with dental mesenchyme. Non-dividing, polarized, and secretory ameloblast-like cells were achieved without cell fusion. Before basement membrane reconstitution, some bone marrow cells migrated to the mesenchyme, where they exhibited morphological, molecular, and functional characteristics of odontoblasts. These results show, for the first time, that bone-marrow-derived cells can be reprogrammed to give rise to ameloblast-like cells, offering novel possibilities for tooth-tissue engineering and the study of the simultaneous differentiation of one bone marrow cell subpopulation into cells of two different embryonic lineages.