茶黄素对人骨髓基质干细胞的成骨诱导作用

目的探讨茶黄素对体外培养人骨髓基质干细胞（BMSCs）的成骨诱导作用及其能力。方法将第二代人BMSCs分为茶黄素组、对照组,茶黄素组加入浓度为10 mmol/L茶黄素,对照组不干预。对比观察两组干预后细胞形态,钙结节、碱性磷酸酶（ALP）、Ⅰ型胶原及骨钙素（OCN）免疫组化染色结果,并检测各组4、8、12、16 d各时点ALP、OCN活性。结果茶黄素组钙结节、ALP、Ⅰ型胶原及OCN免疫组化染色均呈阳性,对照组均为阴性;茶黄素组各时点ALP、OCN活性均高于对照组（P均〈0.05）。结论茶黄素可促进人BMSCs向成骨细胞分化。     

低浓度补肾中药血清联合骨形态发生蛋白-2对人脐血间充质干细胞的生物学作用

目的观察低浓度补肾中药血清联合骨形态发生蛋白(BMP)-2对人脐血间充质干细胞(MSCs)体外增殖、成骨分化的生物学作用。方法取正常孕妇脐静脉血培养第3代人脐血MSCs,制备补肾中药大鼠血清,按诱导分化培养基不同,随机分为空白对照组、中药血清组、BMP-2组、中药血清+BMP-2组(联合组)。以MTT比色法检测脐血MSCs增殖活性,观察碱性磷酸酶(ALP)活性、矿化结节及Ⅰ型胶原染色以检测细胞成骨分化能力。结果与空白对照组比较,联合组、BMP-2组在诱导第3、5天细胞增殖活性明显提高,在诱导第3、6、9、12天ALP活性明显提高(P0.05)。与BMP-2组比较,中药血清+BMP-2组在诱导第5天增殖活性明显提高,在诱导第6天ALP活性明显提高(P0.05)。成骨诱导第14天,除空白对照组外各组von Kossa染色均可见细胞间散在黑色颗粒,尤以联合组为明显;而Ⅰ型胶原纤维表达,BMP-2组、联合组与空白对照组相比均明显增强。结论低浓度补肾中药血清联合BMP-2后能诱导人脐血MSCs增殖及定向成骨分化,是复合型诱导因子的一种理想选择。     

复方接骨中药介导MAPK信号通路促进骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化

目的探讨复方接骨中药介导MAPK信号通路对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖及成骨分化的促进作用。方法取健康雄性SD大鼠60只,随机平均分为实验组和对照组,实验组灌喂复方接骨中药煎剂,对照组灌喂等体积自来水,处理10 d后提取各组大鼠血清。分离BMSCs,利用体积分数为0.1的含药血清及非含药血清单独处理BMSCs 24、48、72 h及联合10μmol/L p38MAPK抑制剂SB203580处理BMSCs 72 h后,MTT检测细胞增殖;RT-PCR及Western印迹检测两组血清单独处理及联合SB203580处理BMSCs 72 h后成骨细胞分化标记基因ALP、BGP、BMP-2的表达;Western印迹检测两组血清处理BMSCs 72 h p38蛋白表达及磷酸化。结果含药血清处理24、48 h,细胞OD值与非含药血清组及对照组相比差异无统计学意义(P>0.05),第72小时含药血清组细胞OD值显著高于对照组及非含药血清组(P<0.01),非含药血清组细胞OD值与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。两组血清处理72 h后,含药血清处理组ALP、BGP、BMP-2表达及p38磷酸化明显高于对照组及非含药血清组(P<0.01),非含药血清组ALP、BGP、BMP-2表达及p38磷酸化与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),p38总蛋白表达三组差异无统计学意义(P>0.05)。SB203580联合两组血清处理72 h后,非含药血清+SB203580组与SB203580组细胞增殖及ALP、BGP、BMP-2表达差异无统计学意义(P>0.05),明显低于对照组(P<0.01),含药血清+SB203580组细胞增殖及ALP、BGP、BMP-2表达显著高于SB203580组(P<0.01),与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。结论复方接骨中药可能通过促进MAPK信号通路促进BMSCs的增殖及成骨分化。     

BMSCs的分离培养、纯化与鉴定

目的 建立一种持续、稳定的可多向分化的骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外分离培养体系.方法 运用密度梯度离心法从1月龄新西兰兔骨髓中分离培养BMSCs,利用相差显微镜观察其形态及生长情况,扫描电镜观察其细胞结构,运用流式细胞术分析分离细胞群所处细胞周期和细胞活力,用MTT比色法绘制细胞生长曲线,并用特定诱导液将分离的BMSCs向成骨细胞和成脂肪细胞定向诱导分化,利用ALP和油红O进行染色鉴定.结果 所分离的BMSCs细胞在形态学观察与生长动力学上均符合BMSCs特征,分离培养的BMSCs细胞在第3天进入对数生长期,第10天进入平台期;在成骨、成脂肪的诱导培养条件下,分别出现成骨、成脂肪表型特征,可进一步定向分化,结论所收获的细胞具有BMSCs的特异性.     

尼古丁对兔骨髓源成骨细胞生物学特性的影响

体外成骨诱导兔骨髓间充质干细胞(BMSCs),使之分化为骨髓源成骨细胞(MOOBs),用含不同浓度尼古丁的成骨条件培养液培养MOOBs,于第1、3、5、7天采用MTT比色法检测MOOBs的增殖力,用磷酸苯二钠比色法测定MOOBs的碱性磷酸酶(ALP)活性.与对照组相比,10、100 μg/ml尼古丁对MOOBs的增殖有抑制作用(P<0.05),降低其ALP活性(P<0.05),并呈时间依赖性.提示尼古丁对兔MOOBs的增殖及ALP活性有抑制作用,这对种植体骨整合可能有影响.     

阿霉素体外抑制成骨分化和促进破骨形成的机制研究

目的:研究阿霉素在体外对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向成骨细胞分化和骨髓单核细胞(BMMs)向破骨细胞分化的影响。方法:将大鼠BMSCs在成骨培养基中用不同浓度的阿霉素处理,以CCK-8法检测其对BMSCs活性的影响,通过碱性磷酸酶(ALP)染色、茜素红染色以及ALP活性的测定检测阿霉素对成骨细胞分化的影响。实时...     

丹参酮ⅡA对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的研究丹参酮ⅡA（TanⅡA）对体外培养的SD大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨分化能力的影响。方法扩增传代至第3代的SD大鼠BMSCs向成骨诱导分化培养,分为实验组和对照组,采用MTT比色法检测细胞的增殖能力;采用RT—PCR方法检测成骨相关细胞因子mRNA的表达;通过钙结节染色对比观察细胞形态情况。结果实验组各浓度TanⅡA较对照组BMSCs增殖速度提高（P〈0．05）,细胞增殖速率随TanⅡA浓度的增高而加快（P〈0．05）;实验组各浓度TanⅡA成骨相关细胞因子mRNA的表达较对照组提高（P〈0．05）;钙结节染色观察TanⅡA各浓度组均阳性显色,对照组显色不明显。结论TanⅡA能够提高体外培养的BMSCs增殖速率,对BMSCs向成骨细胞分化有明确的诱导作用,缩短骨细胞的成熟时间。     

Wnt/β-catenin基因对骨髓瘤患者间充质干细胞成骨潜能的影响

目的:探讨Wnt/β-catenin基因和多发性骨髓瘤骨病的关系。方法:分离培养多发性骨髓瘤患者和正常人的骨髓间充质干细胞(MSCs),体外诱导分化成骨细胞,茜素红实验检测矿化物沉积、荧光定量RT-PCR方法检成骨指标(OPN、OC、ALP、Cbfal)和Wnt/β-catenin mRNA表达,分析MSCs细胞成骨能力变化及两组间Wnt/β-catenin mRNA表达差异。结果:骨髓MSCs体外成骨诱导后,茜素红染色阳性,呈现明显红色钙化结节;MSCs体外诱导成骨细胞,试验组与对照组比较,成骨指标OPN、OC、ALP、Cbfαl mRNA表达降低(P<0.05);骨髓MSCs体外成骨诱导后β-catenin mRNA表达降低(P<0.05)。结论:骨髓MSCs体外可成功诱导分化为成骨细胞;多发性骨髓瘤患者MSCs向成骨细胞分化潜能比正常人降低,Wnt/β-catenin可作为多发性骨髓瘤骨病潜在治疗靶点。     

罗格列酮对经诱导的骨髓间充质干细胞ALP、BMP-2及TGF-β1分泌的影响

目的 体外观察罗格列酮对骨髓间充质干细胞(BMSCs)向成骨细胞分化的影响,并观察对碱性磷酸酶(ALP)、骨形成蛋白-2(BMP-2)、转化生长因子β1(TGF-β1)分泌的影响,探讨其对骨代谢的作用机制.方法 无菌条件下从大鼠长骨骨髓中分离获取BMSCs,采用全骨髓贴壁培养法对BMSCs进行纯化、传代扩增,随后在1、2、5、10 μmol/L罗格列酮干预下诱导成骨细胞分化培养21 d,进行茜素红染色观察矿化结节,并测定成骨细胞标记物ALP、BMP-2及TGF-β1的分泌.结果 1、2、5、10 μmol/L罗格列酮干预组与成骨经典组对比,成骨细胞的钙结节形成比例显著降低(P＜0.05),ALP、BMP-2、TGF-β1水平呈剂量依赖性地下降(均P＜0.05).结论 罗格列酮可剂量依赖性地抑制BMSCs向成骨细胞分化,这可能是罗格列酮致骨质疏松的重要机制.

Abstract：

Objective To observe the effects of rosiglitazone on differentiation of rat bone-marrow stromal cells (BMSCs) into osteoblasts (OB) and on secretion of alkaline phosphatase (ALP), bone morphogenetic protein2 (BMP-2), and transforming growth factor-β1 (TGF-β1) in order to investigate its mechanism of the impact on the bone metabolism.Methods BMSCs from long bone were bred by using differential time adherent culture method,and then were interfered with 1,2,5,10 μmol/L rosiglitazone to differentiate into osteoblasts in the presence of an osteogenic medium.The rate of mineralization was examined by staining mineralized nodules with Alizarin red S,and the secretion of ALP, BMP-2, and TGF-β1 was examined by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)after 21 d of culture.Results Compared with the classic group, the rate of mineralization was significantly decreased by 1,2,5 and 10 μmoL/L rosiglitazone (P＜0.05), the levels of ALP, BMP-2, and TGF-β1 decreased in a dose-depedent manner (P＜0.05).Conclusion Rosiglitazone dose-dependently inhibits differentiation of BMSCs into osteoblasts, which may be an important mechanism in causing osteoporosis.     

兔骨髓间充质细胞分化为肌细胞的实验研究

目的　探讨兔骨髓间充质细胞 (BMSCs)体外分化为肌细胞的可能性。方法　穿刺法抽取成年新西兰兔双侧股骨骨髓 ,分离培养BMSCs ,5 -溴脱氧尿苷 (bromod eoxyuridine)标记 ,再经过 5一氮杂胞苷 (5 azacytidine)诱导或与乳鼠心肌细胞共培养 ,通过免疫细胞化学染色及透射电镜检查 ,研究其分化情况。结果　体外培养的BMSCs无论是在 5 aza诱导还是在与心肌细胞共培养的条件下 ,均有部分细胞表达横纹肌肌动蛋白 (α actin)。电镜检查显示分化后的细胞具有原始肌小节样结构。结论　成年兔BMSCs在 5 aza诱导或与心肌细胞共培养的条件下均可向肌细胞方向分化     

辛伐他汀对成骨细胞成骨能力的影响

目的　研究辛伐他汀促进成骨作用的机制及量效关系。方法　取成人的髂骨松质骨 ,采用胶原 胰蛋白酶消化 ,获得松质骨中的成骨细胞 ,进行纯化和培养。在此基础上添加不同浓度的辛伐他汀 ( 1× 1 0 - 1 1 、1× 1 0 - 9、1× 1 0 - 7、1× 1 0 - 6、1× 1 0 - 5、5× 1 0 - 5 mol/L)并进行培养。用生化法测定细胞碱性磷酸酶 (ALP)活性 ,用放射免疫法测定细胞培养液中骨钙素 (OC)和细胞间质含钙量。结果　辛伐他汀对成骨细胞ALP活性和骨钙素分泌的影响均呈正相关 ,即各浓度辛伐他汀对ALP活性、骨钙素的分泌和成骨细胞的成骨能力均有刺激作用 ,并与辛伐他汀剂量呈正相关。结论　辛伐他汀能增加成骨细胞的ALP活性和骨钙素的产生 ,提高成骨细胞的成骨能力。     

橘红素对大鼠成骨细胞增殖、分化和成骨功能的影响

目的 研究橘红素(TG)对体外培养大鼠成骨细胞增殖、分化、矿化和成骨功能指标基因蛋白表达的影响。方法 选取出生24 h内的SD大鼠乳鼠颅骨，通过酶消化法培养原代成骨细胞，倒置显微镜下观察细胞形态和状态，并以碱性磷酸酶(ALP)染色和茜素红(ARS)染色法进行细胞鉴定；分别采用噻唑蓝(MTT)法、ALP染色法、ARS染色法检测TG对原代成骨细胞的存活率、评价成骨细胞分化能力和矿化能力的影响；采用Western印迹检测TG对原代成骨细胞成骨相关转录因子(OSX)、ALP、Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)和骨桥蛋白(OPN)等成骨功能指标基因的蛋白表达。结果 与Control组相比，TG作用浓度为5、10、15、20μmol/L时可明显促进成骨细胞的增殖(P<0.01);TG共培养7 d后，与Control组比较，TG作用浓度为5、10、15、20μmol/L时ALP染色明显增加，说明TG能明显促进成骨细胞分化(P<0.05);TG共培养21 d后，与Control组比较，TG浓度为5、10、15、20μmol/L时ARS染色明显增加，说明TG能明显促进成骨细胞的矿化功能(P&...     

氟剂对成骨细胞成骨功能表达的影响

目的　从不同剂量氟化钠 (NaF)对大鼠成骨细胞 (OB)功能表达的影响 ,研究氟剂促进成骨作用的机制及剂量效应关系。方法　经酶消化法从新生 2 4hSpregne Dawley (SD)种乳鼠头盖骨分离得到的成骨细胞。在 10 -7～ 5× 10 -4mol/LNaF中培养。用生化法测定细胞碱性磷酸酶 (ALP)活性 ,用放射免疫法测定培养液中骨钙素 (OC)含量。结果　NaF对细胞ALP活性的影响呈双向 ,即低浓度NaF(10 -7～ 10 -5mol/L)增加ALP活性 ,高浓度NaF (10 -4～ 5× 10 -4mol/L)则抑制ALP活性 ;对骨钙素产生和分泌的影响则呈单向 ,即各浓度NaF均刺激细胞骨钙素分泌 ,并与氟剂剂量呈正相关 ,其中 5× 10 -4mol/L组骨钙素水平最高 ,与对照组相比增加 6 7 14 % (P <0 0 5 )。结论　适量氟剂能增加成骨细胞ALP的活性及骨钙素的产生 ,促进成骨细胞的骨形成功能 ,但有效剂量范围狭窄     

细胞接触诱导骨髓间充质干细胞获得窦房结细胞表型的初步研究

目的 通过建立体外骨髓间充质干细胞(BMSCs)与纯化培养的乳鼠窦房结细胞共培养体系,探讨窦房结微环境对BMSCs分化的诱导作用.方法 自新生乳鼠的心脏分离窦房结细胞,并差速贴壁纯化培养,免疫荧光检测超极化激活环核苷酸门控阳离子通道基因4(HCN4)和缝隙连接蛋白45(Cx45)的表达.自成年大鼠的骨髓分离BMSCs,传2代后,用脂质体介导pEGFP-N1转染标记BMSCs,再与纯化培养的窦房结细胞以1:5比例进行直接接触共培养,并用窦房结细胞条件培养液对转染后的BMSCs进行培养作为对照.1周后应用免疫荧光检测BMSCs的HCN4和Cx45表达.结果 接触共培养组中,可见部分表达绿色荧光蛋白的BMSCs同时表达HCN4和Cx45,而条件液培养组中未见HCN4和Cx45的表达.结论 直接接触共培养体系可诱导BMSCs初步分化为窦房结样细胞.     

体外培养人骨髓基质细胞表面抗原检测及分化能力观察

目的检测体外培养人骨髓基质细胞（BMSCs）表面抗原,并观察其分化能力。方法取人颅骨板骨髓组织,以BMSCs专用培养基接种培养,经多次换液得到较纯的BMSCs;在倒置显微镜下观察细胞形态,应用流式细胞仪对细胞表面抗原进行检测;体外脂肪细胞、成骨细胞定向诱导,分别进行油红0染色及yonKossa染色。结果培养细胞表面抗原检测显示,CD14阴性、CD45阴性、CD29阳性、CD90阳性、CD105。阳性;脂肪细胞定向诱导后,油红0染色见胞质内有红色脂肪颗粒;成骨细胞定向诱导后,yonKossa染色见有钙结节形成。结论培养细胞表型特征符合BMSCs,并具有自我更新特性和多向分化潜能。     

氟化物对成骨细胞增殖和分化的影响

目的研究不同浓度氟化物对体外培养大鼠成骨细胞增殖和分化的影响.方法经酶消化法从24h新生Wister乳鼠颅盖骨分离得到的成骨细胞经不同浓度的氟化钠(NaF)作用后,采用MTT法检测细胞增殖;PNPP法测定碱性磷酸酶(ALP)活性;放射免疫法测定培养液中骨钙素(BGP)含量.结果低浓度NaF(10-7mol/L～10-5mol/L)可刺激细胞增殖;高浓度NaF(10-4mol/L～10-3mol/L)则抑制细胞增殖.NaF对成骨细胞分化的影响则呈多样性.ALP的活性改变基本与细胞增殖率的变化相同,即各浓度NaF均促进细胞骨钙素分泌,与对照组相比有统计学意义.结论氟化物对成骨细胞的增殖及早期分化呈双向调节,即小剂量促进,大剂量抑制.但对其晚期分化呈一致性,即促进作用.     

BMP-Smad信号通路在骨髓间充质干细胞分化中的作用

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是骨髓基质中的一种多功能干细胞,离体培养可诱导分化为软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞等。骨形态发生蛋白信号通路(bone morphogenetic protein signaling pathways,BMPS)参与BMSCs分化的胞内信号调控,是向成骨细胞分化的主要途径,对骨骼的形成具有重要作用。本文详细介绍BMP-Smad通路在BMSCs的研究现状,着重强调机械载荷、外源性药物和因子的补充。从BMSCs角度探究促进骨形成、增加生长期的峰值骨量、缓解老年期骨丢失速率的部分机制,从而为骨质疏松的防治提供新的理论依据。在疾病方面的应用也为今后筛选基因辅助治疗提供关键性靶点,致力于对后续BMSCs研究提供一定的思路。     

BMP-2和IGF-1基因治疗糖尿病骨折延迟愈合的作用和机制

目的探讨骨形态发生蛋白(BMP)-2、胰岛素生长因子(IGF)-1基因治疗糖尿病(DM)骨折延迟愈合的作用和机制。方法选取6~7周龄雄性Wistar大鼠150只,分为骨折对照组、DM骨折组和治疗组。利用酶联免疫试剂盒检测各组大鼠血清中BMP-2、IGF-1的表达;测定各组大鼠血清中碱性磷酸酶(ALP)的含量,以判断对成骨细胞生长的影响;利用放射免疫竞争法检测血清中骨钙素的含量变化;利用局部骨密度仪检测骨折区域局部骨密度的变化情况。结果术后前3 w,DM骨折组与骨折对照组BMP-2、IGF-1的浓度均呈上升趋势,第3周达到最大值,治疗组BMP-2含量在第2周达到最大值,IGF-1的浓度在第3周达到最大,随后开始下降、实验中,治疗组BMP-2、IGF-1的表达量最高,DM骨折组表达量始终最低。DM骨折组ALP与骨钙素的含量始终显著低于骨折对照组与治疗组,骨折前3 w,治疗组ALP与骨钙素的含量显著低于对照组骨折无显著差异(P>0.05)。骨折区域局部骨密度检测结果显示治疗组骨密度最高,骨折对照组其次,DM骨折组骨密度最低。结论 BMP-2、IGF-1基因通过提高DM大鼠骨折愈合过程中与成骨细胞增殖成熟相关的细胞因子的表达,促进骨折愈合过程中骨折区域局部骨密度的增加,从而显著改善DM骨折延迟愈合情况。     

脉冲电磁场对脂肪干细胞成骨分化的影响

目的 观察脉冲电磁场对大鼠脂肪干细胞（ADSCs）成骨能力的影响.方法 获取大鼠脂肪干细胞,分为两组,一组接受频率12 Hz、场强1.1 mT的脉冲电磁场刺激,8 h/d,共2周,另一组为空白对照组,不接受任何脉冲电磁场处理.检测骨钙素、Ⅰ型胶原表达量、碱性磷酸酶（ALP）活性,通过上述实验评价成骨情况.通过MTr实验检测细胞增殖情况.结果 脉冲电磁场作用后骨钙素、Ⅰ型胶原表达量及ALP活性较对照组明显增高（P＜0.01）.细胞增殖能力在第2周时降低,与分化功能增强相符.结论 ADSCs经脉冲电磁场体外刺激后,细胞向成骨方向分化,在骨组织工程中具有良好的应用前景.     

雌二醇对成骨细胞护骨素基因表达的影响

目的 研究在MG－63细胞和成人成骨细胞培养的不同阶段,雌激素对护骨素（OPG）基因mRNA表达的影响,探讨雌激素对成骨细胞的作用机制。方法 在细胞培养的不同时间,测定细胞内碱性磷酸酶（ALP）活性、骨钙素（OC）含量和进行Van Gieson胶原染色,以确定细胞培养的增殖、成熟、矿化,于成熟阶段用17β－雌二醇（E2）对培养细胞进行处理,用半定量RT－PCR技术测定雌二醇对成骨细胞OPG基因mRNA表达的影响。结果 ALP活性、骨钙素含量及胶原染色均表明,细胞培养汇片后12天达到成熟。正常成人髂骨分离的成骨细胞（HOB）及成骨肉瘤细胞株MG－63均能表达OPG,且表达量与培养的时程有关。培养12天时,两各OPG基因mRNA表达均达最高峰（P＜0．01）。10^-8mol/L的E2能使MG－63细胞OPG基因mRNA的表达至基础值的10倍（P＜0．001）,HOB的OPG基因mRNA表达增加至基础值的7－8倍（P＜0．01）。结论 OPG在成骨细胞表达。雌激素使成骨细胞OPG基因mRNA表达的增加是雌激素缺乏导致骨质疏松的重要机制之一。