采用活体成像技术监测肿瘤生长及转移模型的建立

目的 采用活体成像技术监测稳定高表达荧光素酶报告基因的肿瘤细胞在小鼠体内生长及转移情况,为肿瘤治疗的药物研发提供新的有用工具.方法 采用lipofectamine2000介导的基因转染方法,将pcDNA3.1/Luc载体转染小鼠高转移乳腺癌细胞株4T1、EMT-6及结肠癌细胞株CT26,经G418抗性筛选及有限稀释法获得可稳定高表达荧光素酶的单克隆细胞;MTT法测定各转染细胞对不同化疗药物的抗性,并采用活体成像的方法检测各转染细胞在小鼠体内的成瘤和转移.结果 获得了可稳定高表达荧光素酶基因的单克隆细胞株,该单克隆细胞株具有与亲本细胞系相同的对化疗药物的敏感性;将单克隆细胞株植入小鼠皮下,可采用活体成像技术准确监测肿瘤细胞体内生长及转移.结论 采用活体成像技术构建的肿瘤动物模型是拓展肿瘤体内生长、转移及治疗相关研究的理想模型.     

人胰腺癌裸鼠异种移植瘤模型的生物发光成像和超声成像比较

目的利用荧光素酶基因标记的人胰腺癌细胞株Capan-2建立胰腺癌裸鼠移植模型,评价生物发光和小动物超声成像在移植瘤模型建立中的作用。方法将表达荧光素酶基因的真核表达载体转入人胰腺癌细胞Capan-2,将1×106人胰腺癌细胞悬液分别接种于裸鼠胰腺和右后肢皮下,使其成瘤。生物发光成像和小动物超声成像系统观察肿瘤的生长情况。结果肿瘤细胞原位移植成功率为75%,皮下移植成功率为100%。生物发光成像系统在肿瘤细胞原位接种第7天,可以观察到肿瘤发光;小动物超声成像系统在肿瘤细胞皮下接种第7天,可以测量肿瘤的大小,但在肿瘤细胞原位接种的第7天不能测量肿瘤的大小。另外肿瘤细胞在裸鼠皮下生长的速度比原位生长速度快3倍左右。结论生物发光成像系统更适用于肿瘤早期监测,为深入研究胰腺癌的发生发展、侵袭转移机制提供理想工具。     

荧光素酶标的人肝癌细胞裸鼠异种移植瘤模型的生物发光成像和PET-CT成像比较

目的利用荧光素酶基因标记的人肝癌细胞株BEL-7402建立裸鼠肝原位移植模型,及小鼠肝原位移植模型的生物发光和小动物PET-CT成像的比较。方法构建表达荧光素酶基因的真核表达载体并将其转入人肝癌细胞BEL-7402,经梯度浓度G418筛选获得稳定表达荧光素酶基因的细胞克隆并扩大培养。BALB/cA-nu裸鼠肝门静脉接种5×105个发光细胞使其成瘤,活体荧光成像和小动物PET-CT成像系统观察肿瘤的生长情况。结果获得了稳定表达Luc的人肝癌细胞株,将其接种到裸鼠体内,活体荧光成像系统观察发现能够成瘤,小动物PET-CT影像观察发现小鼠肝脏边缘对18 F-FDG有高摄取区域。结论利用荧光素酶基因标记的人肝癌细胞BEL-7402成功建立了原位肝癌裸鼠模型,小动物活体成像结合小动物PET-CT技术为原位肿瘤模型的建立提供了一种新的可靠的技术,为进一步研究肝癌生长转移机制和药物开发提供了新的有用工具。     

一种基于血管内皮细胞损伤的大鼠局灶性脑梗死模型

目的：建立一种因血管内皮细胞损伤而诱导的大鼠局灶性脑梗死模型。方法：取S—D大鼠11只，分离左侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。结扎左颈外动脉远心端，夹闭左翼腭动脉和颈总动脉，经颈外动脉逆行插管并缓慢注入月桂酸钠至颈内动脉系统，造成大脑中动脉血管内皮细胞受损。结果：从模型动物的行为表现、梗死灶形态学和病理学进行考察，10只大鼠均产生一定程度的脑梗死表现，造模成功率为90．9％。结论：该模型的稳定性和重复性较好，能在大脑中动脉的供血区产生恒定的梗死灶，适合进行脑缺血损伤的有关实验研究。     

子宫内膜腺上皮永生化细胞模型的建立

目的建立永生化人子宫内膜HPV16型E6和E7基因诱导的腺细胞,以促进对其的细胞生物学、生长分化调节等方面的研究。方法将质粒pcDNA3.1(+)/HPV16E6E7转入腺上皮细胞中,G418筛选,WesternBlot检测目的基因的表达;用相差显微镜观察细胞变化;上机分析细胞周期。结果转化后腺细胞形态无明显改变,相差显微镜下观察细胞贴壁较紧,为多边形或圆形,密集区域呈镶嵌状排列,阳性细胞灶胞浆被均染成棕黄色,胞核呈蓝色;转化后细胞倍增时间约为52.8 h,对数生长期后细胞停止分裂增生,活性降低;转化后的细胞无凋亡峰出现,S期比例为33.23%,明显增加。与未转化细胞相比差异具有统计学意义。结论转染HPV16E6、E7基因至体外培养的子宫内膜腺上皮细胞寿命明延长,得到了可以在体外传代30次以上的转化细胞;具有正常细胞的表型和生长特性,有较强的增殖能力却不具有致瘤性。     

实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型的建立及其病理学和影像学表现

目的：建立实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）小鼠模型并做病理学及影像学鉴定,为研究多发性硬化的发病机制奠定基础。方法：C57BL/6雌性小鼠80只,分为EAE1组、EAE2组、EAE3组、EAE4组,各15只,用MOG35-55抗原加完全弗氏佐剂不同注射方法制作EAE小鼠模型;佐剂组10只用生理盐水代替MOG35-55制备免疫乳剂,对照组10只仅注射生理盐水;用MRI对小鼠脑和脊髓进行扫描,HE、LFB染色和Bielschowskys银染观察小鼠脑和脊髓病理学改变。结果：免疫后第14天,EAE1组、EAE2组、EAE3组、EAE4组小鼠开始出现EAE临床症状,发病率分别为80%、80%、73%、67%;EAE2组、EAE3组小鼠临床症状评分与EAE1组比较,P〉0.05,EAE4组小鼠临床症状评分与EAE1组比较,P〈0.05;佐剂组与对照组小鼠均未出现临床神经系统症状;EAE小鼠脑和脊髓小血管周围炎细胞浸润呈袖套状或脱髓鞘改变,神经元变性及轴突损伤,MRI可显示脑和脊髓病灶。结论：应用背部、颈部、腋窝、蹊部多点注射可提高EAE发病率,1次免疫与两次免疫小鼠对EAE发病率的影响没有明显差别。     

兔VX2肝癌模型的建立及其影像学表现

目的建立兔VX2肝癌模型,观察模型动物在USG,MSCT,MRI及肝动脉造影的影像学表现。方法新西兰大白兔40只,采取VX2瘤块开腹种植法成瘤,分别在不同时段行USG,MSCT,MRI及肝动脉造影检查。结果实验组成瘤率97．5％．肿瘤在MSCT平扫时呈等密度或低密度灶,增强后呈低密度结节,边缘环形强化。MRI平扫时,肿瘤在T1WI和T2WI上分别为较均匀低信号和稍高信号灶,3周后肿瘤因坏死、液化而表现为高低密度混合型结节。肝动脉插管造影,VX2肝癌呈丰富动脉血供表现。结论经开腹种植法制作兔VX2肝移植瘤模型是一种简单、成功率高的建模方法。DSA示VX2肝癌呈丰富动脉血供,与人原发性肝癌血供相似。兔VX2肝癌模型的最佳干预期是植瘤后2～3周,USG可用于对兔VX2肝癌生长情况做连续观察,MSCT及MRI检查精确可靠,可作动态观测。     

精原干细胞移植受体鼠模型的建立

目的通过对4周龄昆明白小鼠腹腔内单次注射白消安来制作精原干细胞移植受体鼠模型。方法将实验动物分为4组,A、B、C组注射白消安的剂量分别是30 mg/kg4、0 mg/kg5、0 mg/kg体重,D组为对照组。注射后每天记录小鼠的存活情况,注射白消安后的20 d3、0 d4、0 d称量睾丸重量、测定血常规、制作并观察睾丸组织学切片、统计曲细精管的中空率。结果A、B、C、D组的死亡率分别是25.00%3、1.58%、80.00%、0.00%,注射白消安后30 d各组小鼠曲细精管中空率分别是45.25%、75.25%、1.50%、0.00%,白细胞、红细胞、血小板数量等血常规指标均恢复正常。结论腹腔内单次注射30 mg/kg或40 mg/kg剂量的白消安,死亡率较低(25.00%、31.58%),30 d后曲细精管中空率较高(45.25%7、5.25%)、血常规指标恢复正常,适合做精原干细胞移植受体。     

转基因肝癌细胞株BEL-7404/HBx的构建与鉴定

目的 构建稳定表达HBx的转基因细胞株BEL-7404/HBx,为进一步研究HBx对肝癌细胞BEL-7404生物学特性的影响,探讨HBx在原发性肝细胞癌(HCC)发生发展中的作用机制及HCC新的防治策略奠定基础.方法 通过脂质体转染将亚克隆有HBV X基因的重组质粒pcDNA3.1(+)-V5-HisB-HBx导入肝癌细胞系BEL-7404,并用G418筛选获取阳性克隆,分别用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和West-em-blot检测不同生长时期阳性克隆中HBx mRNA和HBx蛋白的表达情况.结果 不同生长时期阳性克隆均能检测到HBx mRNA和HBx蛋白的表达.结论 成功构建稳定表达HBx的转基因肝癌细胞株BEL-7404/HBx,为进一步研究HBx在HCC发生发展过程中的作用建立一个理想的实验模型.     

大鼠心肌微血管内皮细胞缺氧模型的建立

目的 对大鼠的心肌微血管内皮细胞(myocardial microvascular endothelial cells,MMVECs)离体培养方法进行改良,建立该细胞的缺氧模型.方法 取出7日龄左右的Wistar大鼠的心脏,用胰蛋白酶和胶原酶二次消化法获得MMVECs,密度梯度离心法纯化细胞,计算细胞纯度;用免疫细胞化学方法检测微血管内皮细胞特异性第Ⅷ因子、CD34及CD31相关抗原;将原代培养的细胞置于持续通人体积分数为1％O2、5％ CO2和94％N2的自制缺氧装置中,并在37℃孵箱中分别缺氧处理4、6、12、18、24h,各时间段均设置正常对照组;用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色实验检测缺氧对大鼠MMEVCs增值活力的影响,Hoechst33342染色观察缺氧诱导该细胞凋亡形态学变化.结果 细胞形态特征及相关抗原检测证实:与仅用二次消化法培养细胞相比,密度梯度离心纯化后所得MMVECs纯度提高(P＜0.01);MTT比色实验:随着培养时间的延长,与正常对照组相比,各缺氧组OD值均有所降低,其中缺氧12、18和24h的OD值降低显著(P均＜0.01);从缺氧12h开始,各缺氧组的OD值逐渐降低,与12h相比均有显著差异(P＜0.01或P＜0.05);Hoechst33342染色:缺氧12h细胞开始出现核固缩、碎裂、蓝色浓染等典型的凋亡形态学变化,随着缺氧时间延长该变化更为明显.结论 该原代离体培养方法可以获得纯度较高的MMVECs;缺氧对MMVECs的增殖有抑制作用,本方法可以简便、有效地建立MMVECs的缺氧模型.     

视网膜神经节细胞体外高压培养模型的建立

目的建立视网膜神经节细胞的体外高压培养模型并观察压力和加压时间对视网膜神经节细胞凋亡的影响。方法建立视网膜神经节细胞混合培养和纯化培养的高压模型,并用流式细胞仪(FCM)检测凋亡细胞百分率。结果成功分离并培养了视网膜神经节细胞R(GCs)混合培养和纯化培养模型,RGCs的混合培养最长可存活3～6w,RGCs的纯化培养可存活时间4～7d。成功对混合培养和纯化培养的细胞进行压力造模,压力20、40、60、80mmHg,加压时间1～4h均能促进RGCs的凋亡,其凋亡细胞的数目以80mmHg、4h为最多(P<0.01)。结论混合培养的RNCs比纯化培养的RGCSs存活时间长。压力能促进RGCSs的凋亡,其凋亡细胞的数目随压力的增大、加压时间的延长而增加。