氨甲喋呤对映体药物对A549人肺腺癌细胞株增殖抑制作用及诱导凋亡作用

目的 探讨氨甲喋呤对映体[(+)MTX,(-)MTX]对A549细胞的增殖抑制作用及诱导凋亡作用。方法 采用培养的A549细胞,应用MTT比色法分析其活性;用光学显微镜和荧光显微镜观察细胞的形态学变化;碘化丙啶(PI)单染流式细胞术检测细胞周期;DNA梯度电泳检测凋亡。结果 在0.1~150 μmol·L^-1范围内,(+)MTX和(-)MTX作用于A549细胞24,48,72 h,均抑制细胞A549增值,但抑制强度为(+)MTX>(-)MTX,倒置显微镜和荧光显微镜观察不同浓度(+)MTX和(-)MTX作用A549细胞不同时间后,出现细胞不同程度的形态学改变;用10 μmol·L^-1的(+)MTX和(-)MTX作用A549细胞48 h后,PI单染流式细胞术检测A549细胞周期的影响,表明氨甲喋呤对映体干扰A549细胞DNA合成;DNA梯度电泳检测结果发现MTX作用组有凋亡条带出现,其中(+)MTX最为明显。结论 (+)MTX和(-)MTX对A549细胞的抗增殖作用具有化学结构的立体选择性,(+)MTX的抗A549细胞增殖作用明显强于(-)MTX。     

哇巴因对血管内皮细胞ECV304细胞凋亡及胞内游离钙离子和活性氧浓度的影响

目的研究哇巴因(毒毛花苷G)对人脐静脉血管内皮细胞ECV304凋亡的诱导作用,并探讨其可能的作用机制。方法哇巴因0.01,0.05,0.1,0.5,1和10μmol·L-1与ECV304细胞作用24,48和72h,MTT法检测细胞存活率,Hoechst33342/碘化丙锭双荧光染色法和流式细胞仪检测细胞凋亡百分率,激光共聚焦显微镜观察细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)和活性氧(ROS)浓度,逆转录PCR和Western印迹法检测胱天蛋白酶3mRNA和蛋白表达。结果哇巴因在0.01～10μmol·L-1浓度范围内与ECV304细胞分别作用24,48和72h,对细胞存活的抑制率明显增加,且呈浓度和时间依赖性,24,48和72h浓度-效应相关系数分别为0.984,0.994和0.997(P<0.05);哇巴因作用24,48和72h的IC50值分别为0.624,0.184和0.041μmol·L-1,时间-效应相关系数为0.974(P<0.05)。哇巴因0.1μmol·L-1与ECV304细胞作用24h,细胞凋亡百分率由正常对照组的(4.2±0.5)%升高到(26.0±3.2)%,作用48h,细胞凋亡率由(4.7±0.5)%升高到(36.5±5.3)%,差异有统计学意义(n=3,P<0.01);同时细胞出现染色质凝集。哇巴因0.01,0.1和0.5μmol·L-1分别与ECV304细胞作用12,24和36h,[Ca2+]i和ROS浓度呈浓度和时间依赖性增加,在哇巴因0.5μmol·L-1时[Ca2+]i和ROS浓度的时间-效应相关系数分别为0.912和0.924,作用36h时[Ca2+]i和ROS浓度的浓度-效应相关系数分别为0.889和0.907(P<0.05)。逆转录PCR和Western印迹法分析显示,哇巴因0.1和0.5μmol·L-1作用ECV304细胞24h后,胱天蛋白酶3mRNA表达增加,差异有统计学意义(P<0.05);哇巴因0.01,0.1和0.5μmol·L-1作用ECV304细胞24h,胱天蛋白酶3蛋白表达明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论哇巴因可诱导人脐静脉血管内皮细胞ECV304凋亡,其机制可能与增加[Ca2+]i和ROS浓度及胱天蛋白酶3表达有关。     

白藜芦醇和紫檀芪体外抗肿瘤转移作用

目的比较白藜芦醇和紫檀芪体外抗肿瘤转移作用。方法白藜芦醇和紫檀芪5～50μmol·L-1分别与小鼠黑色素瘤细胞B16F1和内皮细胞ECV304作用48 h,再分别用磺基罗丹明B染色法测定细胞增殖率。白藜芦醇和紫檀芪10μmol·L-1与细胞作用48 h,用划痕实验评价B16F1和ECV304细胞体外迁移能力,用明胶酶电泳和ELISA测定B16F1细胞分泌基质金属蛋白酶2(MMP-2)的活性和含量。用重建基底膜法观察白藜芦醇和紫檀芪10μmol·L-1作用24 h对ECV304细胞拟管腔形成的抑制作用。结果白藜芦醇和紫檀芪作用48 h均能显著抑制B16F1和ECV304细胞增殖,抑制B16F1细胞增殖的IC50分别为119.7μmol·L-1和37.3μmol·L-1,抑制ECV304细胞增殖的IC50分别为72.2μmol·L-1和37.2μmol·L-1。白藜芦醇和紫檀芪10μmol·L-1作用48 h,B16F1细胞愈合率分别为58.0%和36.8%,ECV304细胞愈合率分别为61.8%和28.9%,明显低于正常对照组的67.7%和88.4%(P<0.01),而且紫檀芪组明显低于白藜芦醇组(P<0.01)。与正常对照组相比,白藜芦醇和紫檀芪10μmo·L-1作用48 h使B16F1细胞MMP-2蛋白表达分别降低7.4%和13.9%(P<0.01),MMP-2活性分别降低19.3%和78.9%(P<0.01)。白藜芦醇和紫檀芪作用24 h均可使ECV304细胞管腔样结构破坏,且紫檀芪的作用较白藜芦醇更加明显。结论白藜芦醇和紫檀芪均具有抑制B16F1和ECV304细胞增殖和转移的作用,并能抑制ECV304细胞拟管腔形成;浓度为10μmol·L-1时紫檀芪的抑制作用强于白藜芦醇。     

氨甲喋呤对映体药物对A549人肺腺癌细胞株增殖抑制作用及诱导凋亡作用

目的探讨氨甲喋呤对映体[（＋）MTX,（-）MTX]对A549细胞的增殖抑制作用及诱导凋亡作用。方法采用培养的A549细胞,应用MTT比色法分析其活性;用光学显微镜和荧光显微镜观察细胞的形态学变化;碘化丙啶（PI）单染流式细胞术检测细胞周期;DNA梯度电泳检测凋亡。结果在0.1～150μmol·L-1范围内,（＋）MTX和（-）MTX作用于A549细胞24,48,72h,均抑制细胞A549增值,但抑制强度为（＋）MTX〉（-）MTX,倒置显微镜和荧光显微镜观察不同浓度（＋）MTX和（-）MTX作用A549细胞不同时间后,出现细胞不同程度的形态学改变;用10μmol·L-1的（＋）MTX和（-）MTX作用A549细胞48h后,PI单染流式细胞术检测A549细胞周期的影响,表明氨甲喋呤对映体干扰A549细胞DNA合成;DNA梯度电泳检测结果发现MTX作用组有凋亡条带出现,其中（＋）MTX最为明显。结论 （＋）MTX和（-）MTX对A549细胞的抗增殖作用具有化学结构的立体选择性,（＋）MTX的抗A549细胞增殖作用明显强于（-）MTX。     

眼镜蛇毒L-氨基酸氧化酶对人膀胱癌ECV304细胞增殖和细胞周期的影响及机制

目的研究眼镜蛇毒L-氨基酸氧化酶(Naja atra L-a-mino acid oxidase,NA-LAAO)对人膀胱癌细胞株ECV304的生长抑制作用,探讨其作用机制。方法 CCK-8法测定NA-LAAO的细胞毒性及对细胞增殖抑制能力;流式细胞术分析NA-LAAO对ECV304细胞周期的影响;实时定量PCR和Western blot分析细胞周期相关基因mRNA和蛋白质表达。结果 NA-LAAO对ECV304细胞有强烈抑制作用,且呈剂量-效应和时间-效应关系。NA-LAAO处理6、12、24 h对ECV304的IC50分别为(1.54±0.23)、(1.09±0.15)和(0.48±0.14)mg.L-1;细胞生长曲线显示,0.156 mg.L-1的NA-LAAO作用4 d可明显抑制ECV304细胞增殖;0.313 mg.L-1从d 2起就有明显效果;0.625 mg.L-1处理后细胞多数死亡;流式细胞术分析提示NA-LAAO可使ECV304细胞阻滞在G1期,并呈量效关系;实时定量PCR结果显示,NA-LAAO可下调Cyclin A2、B1、D1、E1、CDK2、CDK6、Survivin、Skp2,上调p21、p16、p27的表达,Western blot结果显示NA-LAAO可下调Cyclin A、CDK2、CDK6,上调p21,与实时PCR结果一致。结论 NA-LAAO可通过调节细胞周期相关分子,使ECV304细胞阻滞在G1期,抑制细胞增殖。     

多沙唑嗪以及阿夫唑嗪对映体对小鼠离体心房心率和收缩力的影响

目的分析多沙唑嗪以及阿夫唑嗪的光学异构体及其外消旋体与药物调节小鼠离体心房心率和心肌收缩力效应的关系。方法制备小鼠离体左心房和离体右心房标本,观察消旋多沙唑嗪[(±)DOX]、左旋多沙唑嗪[(-)DOX]、右旋多沙唑嗪[(+)DOX]、消旋阿夫唑嗪[(±)ALF]、左旋阿夫唑嗪[(-)ALF]以及右旋阿夫唑嗪[(+)ALF]对小鼠离体右心房心率及左心房心肌收缩力的影响。结果 (+)DOX组的16例标本中,加入30μmol·L-1药物后,5例(31.3%)发生停搏;(±)DOX组、(-)DOX组各有1例发生停搏;其他各组标本未出现停搏反应。(+)DOX和(±)DOX各浓度均减慢小鼠右心房心率(P<0.01),并具有浓度依赖关系;(+)DOX减慢心率的作用强于同浓度(±)DOX(P<0.01)。10和30μmol·L-1浓度的(-)DOX减慢心率(P<0.01),其作用弱于同浓度(+)DOX(P<0.01)。(-)ALF、(+)ALF及(±)ALF在10和30μmol·L-1浓度时均轻度减慢小鼠右心房心率(P<0.05)。在小鼠离体左心房标本,(+)DOX(10和30μmol·L-1)抑制心肌收缩力(P<0.05);而(-)DOX(3～30μmol·L-1)增强心肌收缩力(P<0.05),其增强作用强于同浓度(±)DOX(P<0.05)。(±)ALF及其对映体(3～30μmol·L-1)对小鼠离体左心房心肌收缩力无影响。结论 DOX对小鼠离体心房的心率和心肌收缩力具有明显的影响,高浓度尚可诱发心脏停博反应;DOX的手性结构对其上述活性具有明显的影响。相反,ALF仅影响小鼠心率,ALF的手性结构对其心脏效应无明显影响。     

雪胆素乙通过破坏微丝结构和促进p21~(Cip1)表达抑制前列腺癌PC-3细胞的增殖

目的分析雪胆素乙(CuⅡb)对人前列腺癌PC-3细胞增殖及细胞周期的影响,探讨其作用机制。方法 MTS法检测CuⅡb 0.064～200μmol·L-1作用48 h后PC-3细胞增殖;CuⅡb 2和20μmol·L-1作用24 h,相差显微镜观察细胞形态;CuⅡb 2和20μmol·L-1作用48 h,流式细胞术分析细胞周期分布;免疫荧光染色分析CuⅡb 20μmol·L-1分别作用1,4和24 h后微丝和微管细胞骨架变化;免疫印迹法测定CuⅡb20μmol·L-1分别作用1,4和24 h后G肌动蛋白、F肌动蛋白、p21Cip1及细胞周期蛋白A,B1,E和D1的表达。结果 CuⅡb以浓度依赖方式抑制PC-3细胞的增殖(r=0.9817,P<0.05)。CuⅡb 20μmol·L-1作用48 h,使细胞周期阻滞于G2/M期,从溶剂对照组的(27.7±1.5)%上升为(45.3±1.8)%(P<0.01),相差显微镜见细胞发生明显收缩。CuⅡb 20μmol·L-1作用24 h,使G肌动蛋白水平显著下降,F肌动蛋白发生严重聚集(P<0.05),而对微管只有轻微影响。与溶剂对照组相比,CuⅡb 20μmol·L-1作用24 h后,细胞p21Cip1表达明显升高,细胞周期蛋白A表达显著下调,其他细胞周期蛋白表达上调(P<0.05)。结论 CuⅡb能明显抑制人前列腺癌PC-3细胞的增殖,其机制可能是通过诱导肌动蛋白聚集,破坏微丝骨架,促进抑癌因子p21Cip1表达,阻滞细胞周期的进程。     

地钱素C衍生物F41对子宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响

目的对地钱素C(MC)羟基衍生物进行筛选,寻找具有高抗肿瘤活性的MC衍生物,并初步探讨其抗肿瘤的细胞与分子生物学机制。方法用MTT法观察56种MC羟基衍生物对子宫颈癌HeLa细胞的毒性作用,筛选其中细胞毒作用最强的MC衍生物,并比较其与MC对HeLa细胞存活的抑制作用。用倒置显微镜、DAPI染色和DNA梯带检测其对细胞凋亡的影响。用流式细胞术检测其对细胞周期的影响。用Western印迹法检测其对细胞周期和凋亡相关蛋白表达的影响。结果在56种MC衍生物中,F41对HeLa细胞毒性最强,抑制HeLa细胞存活的IC50为(11.31±2.13)μmol·L-1,明显低于MC〔IC50为(17.19±3.28)μmol·L-1〕(P<0.01)。F41和MC与HeLa细胞作用24,48和72h,F41对HeLa细胞存活的抑制作用均明显强于MC(P<0.05)。形态学和DNA梯带检测显示,F41处理后,HeLa细胞皱缩变小,有空泡和凋亡小体出现,胞核浓缩变小,DNA电泳呈梯状条带。流式细胞分析显示,F41 15μmol·L-1处理HeLa细胞24h,G2/M期细胞占总细胞的比例为(43.8±3.0)%,明显高于对照组的(13.1±1.6)%(P<0.01);G1期细胞比例为(34.8±3.8)%,明显低于对照组的(63.6±5.5)%(P<0.01)。Western免疫印迹结果表明,F41可使HeLa细胞内磷酸化细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶1水平降低,细胞周期蛋白B1和P53蛋白表达增多。结论 F41可诱导HeLa细胞凋亡,抑制HeLa细胞分裂,其抗肿瘤活性可能强于MC。     

灵芝多糖肽对ECV304细胞氧化损伤的保护作用

目的研究灵芝多糖肽对ECV304氧化损伤的保护作用。方法培养ECV304细胞,以叔丁基氢过氧化物(tBOOH)为氧化剂损伤细胞,造成氧化损伤模型,培养液中加入不同浓度灵芝多糖(12.5、25、50、100mg.L-1),以MTT法测细胞存活率;以光镜、电镜检测细胞形态学改变及线粒体损伤;用AnnexinV/PI双标记细胞,流式细胞检测细胞凋亡的百分率。结果灵芝多糖(12.5、25、50、100mg.L-1)可减少叔丁基氢过氧化物对ECV304的氧化损伤,MTT检测灵芝多糖给药组,ECV304细胞存活率增加。光镜下可见细胞损伤减少,电镜可见灵芝多糖(50mg.L-1,温育24h)减轻细胞器如线粒体氧化损伤,减少细胞凋亡。细胞流式检测表明:对照组、给药组、损伤组总凋亡百分率分别2.24%±0.43%、24%±6.4%(P<0.01)、82.1%±7.9%。结论灵芝多糖肽(GLPP)对ECV304细胞氧化损伤具有保护作用。     

H_2O_2预处理对多巴胺损伤PC12细胞的适应性保护作用

目的探讨H2O2预处理对多巴胺(dopamine,DA)损伤PC12细胞的适应性保护作用。方法透射电镜、Hoechst染色和PI染色流式细胞仪(flowcytometry,FCM)观测细胞凋亡,MTT代谢率法观察细胞线粒体氧化磷酸化功能状态,Rh123染色FCM检测细胞线粒体膜电位(△Ψm)。结果50μmol·L-1DA作用PC12细胞24h后,电镜可观察到PC12细胞体积缩小,核染色质浓缩、边集,核碎裂等细胞凋亡征象。Hoechst33258染色显示,DA(50μmol·L-1)作用24h后,经H2O2预处理的PC12细胞的凋亡量较未预处理的明显减少。50、100和200μmol·L-1DA作用24h后,PC12细胞的凋亡率分别为(20.9±1.8)%、(40.5±6.4)%、(88.1±3.9)%,而经H2O2预处理的PC12细胞的凋亡率分别下降至(4.9±2.9)%、(12.0±1.4)%、(61.5±3.4)%(P<0.01)。20、40、80μmol·L-1DA作用细胞24h后,细胞MTT代谢率明显下降,而H2O2预处理抑制20、40、80μmol·L-1DA引起的PC12细胞MTT代谢率的下降(P<0.01)。50μmol·L-1DA作用24h后,PC12细胞的平均Rh123荧光强度由正常对照的(46.87±0.33)下降至(4.39±2.93),而经H2O2预处理的PC12细胞,其平均Rh123荧光强度仅下降到(10.50±0.28),下降程度明显减轻(P<0.01)。结论H2O2预处理对DA损伤PC12细胞具有适应性保护作用。     

硫化氢对多柔比星致心肌细胞凋亡的保护作用

目的:研究硫化氢对多柔比星引起的心肌细胞凋亡的保护作用及其机制.方法:以硫氢化钠(NaHS)作为供体,先用不同浓度NaHS处理心肌细胞,再加入多柔比星(DOX)致其凋亡.应用胎盘蓝染色测量细胞的存活率;应用Annexin V和PI双染流式术检测其凋亡情况;应用比色法检测凋亡相关蛋白CASPASE-3和CASPASE-9的活性.结果:分别以DOX(5μmol·L-1)+ NaHS(50μmol·L-1)、DOX(5μmol·L-1)+ NaHS(100 μmol·L-1)、DOX(5μmol·L-1)+ NaHS( 200 μmol·L-1)浓度处理的各组细胞存活率均较单用DOX组(5μmol·L-1)增高;以DOX(5μmol ·L -1)+ NaHS(200 μmol·L-1)处理的细胞凋亡率较单用DOX组(5μmol·L-1)降低,以DOX(5μmol·L-1)+ NaHS(200μmol·L-1)处理的细胞的caspase-3和caspase-9活性较单用DOX组(5μmoloL-1)降低,各项指标差异均有统计学意义(P＜0.05).结论:硫化氢可以保护DOX引起的心肌细胞损伤,抑制DOX引起的心肌细胞凋亡.     

补骨脂酚及其与补骨脂素合用对HK-2细胞的毒性及其机制

目的研究补骨脂酚(bakuchiol)及补骨脂酚与补骨脂素(psoralen)合用的肾细胞毒性,并初步探讨其毒性机制。方法采用人肾近曲小管上皮细胞(HK-2),研究补骨脂酚、补骨脂酚与补骨脂素合用以及在大鼠肝匀浆S9作用下,对HK-2细胞的毒性作用。实验分为空白对照、溶剂对照、阳性对照马兜铃酸Ⅰ(AAⅠ)、补骨脂素5μmol.L-1、补骨脂酚5,10,20,30和40μmol.L-1,补骨脂酚与补骨脂素合用(20+5),(30+5),(40+5)μmo.lL-1组。MTT法检测细胞存活率;乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测细胞膜损伤;倒置显微镜观察细胞形态改变;AnnexinⅤ/PI染色法检测细胞凋亡;PI染色法检测细胞周期。结果补骨脂素5μmol.L-1作用于HK-2细胞,未观测到毒性作用;补骨脂酚、补骨脂酚与补骨脂素合用分别与HK-2细胞作用4,24,48和72h,在较高浓度下(20,30和40μmol.L-1)细胞存活被明显抑制(P<0.01),补骨脂酚24,48和72h的IC50值分别为(26.4±4.8),(21.8±0.6)和(24.1±0.8)μmol.L-1;在大鼠肝匀浆S9作用下,补骨脂酚的细胞毒性明显降低(P<0.01)。较高浓度(30和40μmol.L-1)的补骨脂酚、补骨脂酚与补骨脂素合用分别与HK-2细胞作用24h,LDH的释放率明显增高(P<0.01),呈浓度依赖性;倒置显微镜下观察细胞形态变化,HK-2细胞随着浓度的增高,作用时间的延长,细胞收缩、变小变圆和破裂脱落现象越明显。补骨脂酚40μmol.L-1、补骨脂酚与补骨脂素合用(20+5),(30+5)和(40+5)μmol.L-1可诱导HK-2细胞发生不同程度的凋亡,并且引起明显的细胞死亡。补骨脂酚10,20,30和40μmol.L-1、补骨脂酚与补骨脂素合用均影响细胞周期,主要表现为G2期减少,G1和S期增加或减少。结论补骨脂酚对HK-2细胞有明显的毒性,与补骨脂素合用不能降低其毒性,经大鼠肝匀浆S9作用后,补骨脂酚的细胞毒性明显降低。补骨脂酚对HK-2细胞毒性作用机制可能为:①直接对细胞膜造成损伤;②引发细胞凋亡;③抑制细胞内DNA合成,阻滞细胞有丝分裂,抑制细胞增殖。     

虫草素对高糖诱导脐静脉内皮细胞凋亡的保护作用研究

目的探讨虫草素对高糖环境下人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的保护作用及其机制。方法原代培养HUVECs,实验分为空白对照组、模型组、对照组、抑制剂A组、抑制剂B组、干预A组、干预B组和低、中、高浓度虫草素组。空白对照组给予正常糖浓度(5.5 mmol·L^-1);模型组给予40 mmol·L^-1高糖孵育48 h;对照组给予10μmol·L^-1白藜芦醇+高糖;低、中、高浓度虫草素组分别给予1,10,20μmol·L^-1虫草素+高糖;抑制剂A组给予1μmol·L^-1 CLI-095+高糖;抑制剂B组给予100 nmol·L^-1西罗莫司+高糖;干预A组给予1μmol·L^-1 CLI-095+20μmol·L^-1虫草素+高糖;干预B组给予100 nmol·L^-1西罗莫司+20μmol·L^-1虫草素+高糖。用5-溴脱氧尿嘧啶核苷-酶联免疫吸附法检测光密度值观察细胞增殖能力,用Annexin V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶流式细胞术检测细胞凋亡率,用实时荧光定量聚合酶链反应检测沉默信息调节因子2同源蛋白1(SIRT1)mRNA的表达水平,用Western Blot检测SIRT1蛋白的表达水平。结果模型组、对照组和低、中、高浓度虫草素组以及干预A组、干预B组的增殖能力(光密度值)分别为(1.38±0.11),(1.86±0.06),(1.44±0.03),(1.60±0.05),(1.70±0.08),(1.85±0.04)和(1.85±0.06),细胞凋亡率分别为(6.72±1.00)%,(0.56±0.37)%,(3.86±0.16)%,(2.64±0.23)%,(2.16±0.15)%,(1.57±0.28)%和(0.86±0.20)%,SIRT1 mRNA表达相对倍数分别为(0.24±0.05),(2.97±0.41),(0.62±0.07),(1.37±0.18),(2.14±0.35),(3.45±0.76)和(3.02±0.79)。模型组、对照组、高浓度虫草素组、抑制剂B组和干预B组的SIRT1蛋白表达分别为(0.82±0.11),(1.14±0.29),(0.98±0.13),(0.74±0.19)和(1.30±0.20)。对照组和高浓度虫草素组的上述指标与模型组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。干预A组和干预B组的细胞增殖力及SIRT1 mRNA表达水平与高浓度虫草素组比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。干预B组细胞凋亡率与高浓度虫草素组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。干预B组SIRT1蛋白表达与抑制剂B组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论虫草素可能通过促进SIRT1表达,从而起到保护高糖损伤的内皮细胞作用。     

吡格列酮对脂多糖引起大鼠大脑皮质神经元损伤的抑制作用

目的探讨吡格列酮对脂多糖(LPS)引起的神经元损伤的抑制作用,并探讨其信号传导机制。方法取培养7d的大鼠大脑皮质神经元细胞,除正常对照组外,其余各组先给予相应的处理30min～1h后,再加LPS10mg.L-1处理4～24h。MTT法测定细胞存活率;Hoechst33258核染色观察细胞凋亡的形态学改变;免疫荧光染色法测定磷酸化c-Jun氨基端激酶1(JNK1)细胞内定位;Western蛋白印迹法检测活性胱天蛋白酶3(caspase3)蛋白表达和磷酸化JNK1水平;Griess法测定细胞培养上清液中一氧化氮(NO)含量。结果与对照组相比,LPS可使体外培养神经元细胞存活率明显下降,(100.0±10.9)%vs(72.3±2.1)%;凋亡细胞百分率明显增加,(11.5±4.2)%vs(39.5±8.2)%;活性caspase3蛋白表达和磷酸化JNK1水平增加;细胞培养上清液中NO含量明显增加。吡格列酮0.01,0.1和1μmo.lL-1可明显对抗LPS引起的培养神经元细胞存活率下降,并呈一定浓度依赖性。吡格列酮0.1和1μmol.L-1也可明显对抗LPS引起的培养神经元凋亡细胞百分率、活性caspase3蛋白表达、磷酸化JNK1水平和NO含量增加。LPS+吡格列酮(1μmo.lL-1)组,细胞存活率为(97.8±9.7)%,凋亡细胞百分率为(20.6±5.0)%,NO含量为(6.8±1.3)μmol.L-1。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的特异性阻断剂GW9662不能去除吡格列酮对LPS引起的神经元细胞损伤的抑制作用,在LPS+吡格列酮(1μmol.L-1)+GW9662(10μmo.lL-1)组,细胞存活率为(90.7±6.9)%,凋亡细胞百分率为(23.4±4.1)%,NO含量为(5.8±0.7)μmol.L-1。GW966210μmol.L-1对LPS引起的细胞存活率降低没有影响。与LPS组相比,JNK特异性阻断剂SP6001255μmol.L-1可明显对抗LPS引起的神经元损伤,细胞存活率明显增加,(72.3±2.1)%vs(109.8±11.8)%;凋亡细胞百分率降低,(39.5±8.2)%vs(19.1±4.8)%;NO含量降低,(21.1±5.0)μmol.L-1vs(4.0±1.3)μmol.L-1。结论吡格列酮能明显抑制LPS引起的皮质神经元损伤,这种作用可能与抑制JNK信号传导通路有关,与PPARγ激活无关。     

金丝桃苷对新生大鼠神经细胞缺氧/再给氧损伤的保护作用及其机制

目的探讨金丝桃苷(hyperin,Hyp)对新生大鼠脑细胞缺氧/再给氧损伤的保护作用及其机制。方法将分离的新生大鼠脑细胞缺氧30min或缺氧30min后再给氧40min造成细胞缺氧或再给氧损伤模型,测定细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)水平的变化,用Fura2-AM方法测定脑细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)的变化。结果脑细胞缺氧时,细胞培养上清液中LDH从(62.0±13.0)U·L-1(Sham组)增高到(116.0±16.6)U·L-1(Control组,P<0.01),再给氧时,LDH和MDA分别从(45.6±9.2)U·L-1和(9.1±0.9)μmol·L-1(Sham组)增高到(106.0±17.4)U·L-1和(16.4±2.7)μmol·L-1(Control组,P<0.01)。Hyp在1.0～16.0μmol·L-1范围内,明显地抑制缺氧及再给氧损伤诱导的上述LDH和NO增高,并呈一定的浓度依赖性。1.0～16.0μmol·L-1的Hyp不仅可明显地抑制缺氧诱导的细胞培养上清液中NO和脑细胞内[Ca2+]i的增高(P<0.05或P<0.01),也可明显地抑制再给氧时NO和脑细胞内[Ca2+]i的升高(P<0.05或P<0.01),16.0μmol·L-1的Hyp可将再给氧时NO和[Ca2+]i分别从(34.4±6.3)μmol·L-1和(640±94)nmol·L-1(Control组)降至(25.0±5.1)μmol·L-1(P<0.05)和(331±56)nmol·L-1(P<0.01)。结论Hyp对神经细胞缺氧/再给氧损伤保护作用可能与抑制NO的释放、钙超载及自由基脂质过氧化有关。     

硫化氢对人胚肺成纤维细胞缺氧后增殖活力及细胞凋亡的影响

目的探讨内源性及外源性硫化氢(H2S)对缺氧诱导下人胚肺成纤维细胞增殖效应及凋亡率的影响。方法以2%O2-93%N2-5%CO2体外培养人胚肺成纤维细胞24h,制备细胞缺氧模型。细胞培养分为6组:①缺氧(N2)组;②N2+600μmol.L-1NaHS组;③N2+1200μmol.L-1NaHS组;④N2+6400μmol.L-1NaHS组;⑤N2+400μmol.L-1L-半胱氨酸(Cys)组;⑥N2+200μmol.L-1S-腺苷甲硫氨酸(SAM)组。各组细胞24h缺氧培养后,采用MTT法和流式细胞术分别检测细胞增殖活力和细胞凋亡率。结果与N2组相比,600和1200μmol.L-1NaHS(H2S供体)可降低缺氧后人胚肺成纤维细胞的增殖活力(P<0.01),但对细胞凋亡率无影响(P>0.05);而6400μmol.L-1NaHS虽然不影响细胞缺氧后的增殖活力(P>0.05),但却增加其凋亡率(P<0.05);胱硫醚-β-合酶(H2S合成酶)底物Cys和激动剂SAM对缺氧后人胚肺成纤维细胞增殖活力无影响(P>0.05);但它们却使缺氧后人胚肺成纤维细胞凋亡率高于N2组(P<0.05)。结论内源性及外源性H2S可降低缺氧诱导的人胚肺成纤维细胞增殖活力、促进细胞凋亡,提示内源性H2S还可能通过肺成纤维细胞,抑制缺氧导致的肺血管结构重建发挥其保护作用。     

重组人内抑素对内皮细胞增殖的影响

目的　探讨原核表达的可溶性重组人内抑素(rhEndo)对ECV 30 4内皮细胞和原代培养兔主动脉内皮细胞增殖的影响。方法　利用酶标仪进行噻唑蓝 (MTT)法检测 ,同时采用倒置相差显微镜、电子显微镜、流式细胞仪、半胱天冬酶 3活性分析观察该内抑素对碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)刺激的血管内皮细胞增殖的影响。结果　该rhEndo明显抑制ECV 30 4细胞的增殖 ,MultiCycleDNACycle软件分析表明细胞增殖阻滞在G1期 ,流式细胞仪检测发现该内抑素可诱导ECV 30 4细胞凋亡 ,且与半胱天冬酶 3活性增强有关 ,但对原代培养的兔主动脉内皮细胞增殖并未产生明显的作用。结论　内抑素可明显抑制ECV 30 4细胞增殖并诱导其发生凋亡 ,但对原代培养的兔主动脉内皮细胞增殖没有明显的影响 ,这将有利于与血管新生有关的疾病如癌症等的治疗。     

鲁斯可皂苷元对HL-60与EC V304细胞黏附的影响

目的考察麦冬中主要皂苷元鲁斯可皂苷元(Rusco-gen in)抑制细胞黏附的作用,为深入研究其抗炎作用机制提供依据。方法采用MTT比色法检测Ruscogen in对人原髓性白血病细胞株HL-60细胞与正常或肿瘤坏死因子-α(TNF-α)活化的人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞黏附的影响及其对ECV304与HL-60细胞增殖的影响。结果Ruscogen in 0.1,1.0μmol.L-1预处理ECV304细胞后,均抑制TNF-α诱导的ECV304细胞与HL-60细胞黏附的增加,Ruscogen in 0.001,0.01,0.1μmol.L-1预处理HL-60后,亦抑制TNF-α诱导的ECV304细胞与HL-60细胞黏附的增加;同时Ruscogen in在实验浓度范围内不影响ECV304细胞与HL-60细胞的增殖及二者之间的正常黏附。结论Ruscoge-n in可通过抑制HL-60细胞与活化的ECV304细胞之间的黏附作用,发挥抗炎活性。