主动脉平滑肌细胞的三维培养研究

目的：研究主动脉平滑肌细胞（aortic smooth muscle cell,ASMC)在三维培养中是否仍能产生弹性蛋白。方法：取一周龄SD大鼠胸主动脉，经原代、传代培养后，和胶原、血清及培养 液混合形成ASMC胶原凝胶，进行三维培养；培养2周后用Gomori醛复红弹性纤维染色和弹性蛋白免疫组织化学染色，检测细胞胶原凝胶中所产生的弹性纤维，并进行电镜观察。结果：传代细胞经α肌动蛋白免疫组织化学染色鉴定，98％以上为ASMC。培养2周的ASMC胶原凝胶切片用二种染色方法均可显示有弹性纤维存在，电镜观察细胞超微结构呈典型的合成表型。结论：ASMC在三难培养中能够产生弹性蛋白，并形成弹性纤维。     

免疫组织化学与弹力纤维组合双染对肺癌的诊断价值

目的 探讨免疫组织化学染色与弹力纤维染色组合双染在判断肺癌细胞是否突破胸膜方面的应用价值。方法 对37例常规切片加免疫组织化学单染与弹力纤维单染难于判断肺癌细胞是否突破胸膜弹力纤维层的病例,进行免疫组织化学染色与弹力纤维染色组合双染,探讨其判读结果,并统计分析弹力纤维单染切片与双染切片病理诊断所需的阅片时间。结果 免疫组织化学细胞角蛋白（CK）单染仅显示肺癌细胞为棕黄色;弹力纤维染色仅将弹力纤维染成蓝紫色;免疫组织化学CK+弹力纤维双染：肺癌细胞呈棕黄色,弹力纤维呈蓝紫色,肺癌细胞与弹力纤维层的关系得以明显显示。37例原通过常规切片加免疫组织化学单染与弹力纤维单染难以判断肺癌细胞是否突破胸膜的病例,经免疫组织化学CK+弹力纤维双染后均得以确诊,22例明确肺癌细胞突破胸膜弹力纤维,15例明确肺癌细胞未突破胸膜。免疫组织化学CK+弹力纤维双染切片平均阅片时间为（18.8±1.0）s,短于弹力纤维单染切片（33.4±1.0）s(t=10.46,P<0.01)。结论 免疫组织化学CK+弹力纤维双染可降低判断肺癌细胞是否突破胸膜的难度,提高诊断准确率与工作效率。     

脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞共同培养建立血脑屏障模型

目的：建立能够模拟在体血脑屏障的体外模型。方法：培养大鼠脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞，用免疫组织化学染色的方法鉴定细胞，分别接种两种细胞于多聚酯多孔膜的两面，相关显微镜及HE染色观察细胞在多聚酯膜上的生长情况。结果：培养的脑微血管内皮细胞多数为梭形铺路石样外观，而星形胶质细胞呈具有多个突起的典型形态，免疫组织化学染色鉴定细胞的纯度分别在90％和95％以上，两种细胞能够以单层细胞的形式生长于多聚酯多孔膜的两面。结论：通过脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞共同培养能够形成与在体血脑屏蔽类似的结构，是一种建立血脑屏障模型的可行方法。     

乳腺癌前哨淋巴结微转移的检测

目的探讨检测乳腺癌前哨淋巴结（SLN）微转移的有效手段。方法以^99mTc标记的硫胶体作为前哨淋巴结示踪剂，使用7探测仪进行前哨淋巴结定位，对41例临床腋淋巴结阴性的乳腺癌患者实施前哨淋巴结活检（SLNB）。收集常规病理检查无转移的SLN行多层次连续切片，分别行HE染色和细胞角蛋白免疫组织化学染色。结果39例乳腺癌检出SLN，SLN检出成功率为95．1％（39／41例）。在常规病理学检查SLN无转移的20例中，连续切片H—E染色发现4例SLN微转移，免疫组织化学染色发现7例SLN微小转移癌。连续切片免疫组织化学染色对SLN微转移的检出率高于常规病理学检查（P〈0．05）。结论连续切片免疫组织化学染色是检测乳腺癌前哨淋巴结微转移的有效方法，可提高SLNB的准确性。     

淋巴组织免疫组织化学染色方法的探讨

目的:鉴于病理淋巴组织的切片常见组织较硬、细胞脆性大,免疫组织化学染色显色模糊,甚至出现假阴性现象,探讨淋巴组织制片与免疫组化染色的新方法与新思路。方法:采用B-5固定液、软化剂的处理进行石蜡切片、免疫组织化学染色方法进行染色。结果:制出背景清晰、定位准确、反差分明、效果较好的免疫组化染色淋巴组织切片。结论:经B-5固定液固定、软化剂处理过的淋巴组织免疫组化切片能为淋巴组织疾病诊断提供定位准确、阳性明显的抗原表达信息。     

大鼠视网膜Müller细胞的培养与鉴定

目的：仿照前人建立的方法，优化SD大鼠视网膜Müller细胞体外培养的技术和方法，为后续相关研究建立实验室条件。方法：使用胰蛋白酶消化的方法分离新生SD大鼠视网膜Müller细胞，以DMEM为培养基体外培养，光镜观察。采用电镜观察及荧光免疫组织化学染色的方法进行鉴定。结果：培养的细胞贴壁生长，原代细胞胞体狭长，细胞质丰富，折光性好。电镜下可见特征性的中间丝（直径8～10nm），细胞器丰富；荧光免疫组织化学显示细胞呈神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和谷氨酰胺合成酶（GS）阳性。结论：酶消化法培养SD大鼠视网膜Müller细胞是一种稳定、可靠的方法。     

兔视网膜色素上皮细胞培养和鉴定

目的：进行兔视网膜色素上皮细胞(RPE)细胞的体外培养，探讨RPE培养与鉴定方法，为研究其生理功能、生化特征和病理过程提供细胞模型。方法：用改良的眼杯固定法，将其固定在眼球托上，用胰酶直接消化视网膜色素上皮面，收取RPE细胞。作细胞形态学、免疫组织化学、免疫荧光鉴定。结果：RPE细胞培养早期生长活跃、胞核透明、胞浆含丰富黑色素颗粒，多巴氧化酶呈阳性反应．免疫组织化学染色和免疫荧光染色提示角蛋白表达强阳性。结论：培养的大量细胞可用于RPE的体外实验研究，多巴染色是鉴定RPE细胞一种较好的方法。     

人脑不同发育期vimentin阳性细胞的分布

目的：研究不同发育时期人脑vimentin阳性细胞的形态特征及其分布情况。方法：计划生育流产或引产的胚胎（9，13及28wk）大脑经多聚甲醛固定，石蜡包埋并连续切片，免疫组织化学染色，光镜下观察。结果：免疫组织化学染色结果发现vimentin阳性细胞形态多样，大小不一，多呈圆形，分布广泛，特别是嗅球，海马，纹状体以及脑上区均可见到vimentin阳性的细胞，并且随发育时期及部位不同，细胞形态及突起情况各异，结论：vimentin阳性细胞形态及分布不同可能与发育阶段有关。     

品管圈在提高免疫组织化学切片染色优良率中的应用

目的研究品管圈活动在提高免疫组织化学切片染色优良率中的应用。方法该院病理科4名医生4名技师自发组成品管圈小组。把品管圈活动前后的数据资料进行比较分析,以便解决免疫组织化学切片染色中存在的问题。结果应用品管圈活动后,免疫组织化学切片染色优良率由95.5%提高到98.9%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论品管圈的应用可以有效提高免疫组织化学切片染色的优良率,可以为高质量的免疫组织化学染色切片提供保障。     

反复胰蛋白酶消化法培养SD大鼠视网膜Muller细胞

目的：通过反复胰蛋白酶消化法，建立Muller细胞的培养和纯化方法。方法：采用新生7天的SD大鼠，解剖镜下取视网膜，反复胰蛋白酶消化法消化贴壁后的细胞，细胞形态一致后行免疫组织化学和形态学检查。结果：所得细胞的90％左右谷氨酰胺合成酶（GS）免疫组化染色阳性；荧光显微镜下可见细胞胞体巨大，足突明显，证明是Muller细胞。结论：反复胰蛋白酶消化法是一种简单、可靠的Muller细胞培养方法。     

神经膜细胞与人发角蛋白复合培养构建人工神经桥接体的实验研究

目的探索神经膜（旧称许旺细胞）与人发角蛋白复合培养构建人工神经桥接体。方法用10μmol／ml BrdU标记体外培养纯化的许旺细胞与ECM凝胶修饰的人发角蛋白进行三维方向的共培养而构建成人T神经桥接体，移植入SD大鼠坐骨神经缺损处、皮下、骨骼肌中。S-100蛋门免疫组化染色鉴定许旺细胞，倒置显微镜和扫描电镜下观察许旺细胞与人发角蛋白的共培养．石蜡切片抗BrdU免疫组化染色观察体外培养纯化的许旺细胞在体内的生长情况。结果体外培养的许旺细胞能黏附于人发角蛋白上进行良好的生长，移植入神经缺损处4周后，坐骨神经缺损处、皮下、骨骼肌中的桥接体内的人发角蛋白开始降解．黏附于该人发角蛋白上的许旺细胞均见成活并分裂增殖。结论许旺细胞可与人发角蛋白进行三维培养．构建成人工神经桥接体．填补神经缺损。     

人视网膜色素上皮细胞的培养

目的 :培养人视网膜色素上皮细胞 ,为采用视网膜色素上皮移植治疗色素变性奠定基础。方法 :用胰酶消化法获取人胎儿视网膜色素上皮细胞进行原代及传代培养。角蛋白抗体免疫细胞化学染色鉴定细胞。结果 :视网膜色素上皮细胞在体外生长良好 ,胞浆内含有丰富的色素颗粒。抗角蛋白反应阳性。结论 :体外培养视网膜色素上皮细胞成功为细胞移植提供了一个良好的来源     

兔角膜缘干细胞的体外培养、鉴定及形态学特点

目的 体外培养兔角膜缘干细胞(limbal stem cells,LSCs),观察其生物学特性.方法 用含20%胎牛血清DMEM:F12(1:1)培养基对兔LSCs进行体外培养,倒置显微镜及HE染色观察培养细胞体外生长的形态,免疫细胞化学AE5和P63染色鉴定并进行图像分析,透射电镜观察超微结构特点.结果 培养2～3 d细胞从组织块游出,6～8 d形成良好的单层,细胞多呈圆形或卵圆形.电镜观察,培养7 d LSCs呈卵圆形,表面有少量微绒毛突起;胞质内细胞器少,核大,核仁明显,核浆比例大,部分细胞可见双核现象.免疫组化观察,培养第7天,大量细胞AE5免疫反应染色呈阴性,阳性细胞数量较少,大量细胞P63免疫反应染色呈阳性;培养第14天,AE5阳性细胞数明显增多,免疫反应染色增强,阳性细胞的平均灰度值显著降低(7 d:184.30±9.85,14 d:133.36±25.00,P<0.01).P63免疫反应阳性细胞数第14天与第7天相比明显减少,而阳性细胞的平均灰度值显著增高(7 d:108.13±17.96,14 d:177.59±7.86,P<0.01).结论 应用组织培养方法获得的原始细胞具有与体内正常LSCs相一致的形态特征;培养第7天为LSCs生长的峰值期.     

神经膜细胞与人发角蛋白复合培养构建人工神经桥接体的实验研究

目的 探索神经膜(旧称许旺细胞)与人发角蛋白复合培养构建人工神经桥接体。方法 用10μmol/mlBrdU标记体外培养纯化的许旺细胞与ECM凝胶修饰的人发角蛋白进行三维方向的共培养而构建成人工神经桥接体,移植入SD大鼠坐骨神经缺损处、皮下、骨骼肌中。S-100蛋白免疫组化染色鉴定许旺细胞,倒置显微镜和扫描电镜下观察许旺细胞与人发角蛋白的共培养,石蜡切片抗BrdU免疫组化染色观察体外培养纯化的许旺细胞在体内的生长情况。结果 体外培养的许旺细胞能黏附于人发角蛋白上进行良好的生长,移植入神经缺损处4周后,坐骨神经缺损处、皮下、骨骼肌中的桥接体内的人发角蛋白开始降解,黏附于该人发角蛋白上的许旺细胞均见成活并分裂增殖。结论 许旺细胞可与人发角蛋白进行三维培养,构建成人工神经桥接体,填补神经缺损。     

胚胎大鼠海马源性神经干细胞的分离、培养、分化和鉴定

目的:探讨胚胎大鼠海马源性神经干细胞(N SC)的分离、培养、分化和鉴定的方法。方法:机械分离出胚胎大鼠海马区细胞,以无血清培养基培养,再以血清培养基诱导其分化;在显微镜下观察其形态学特征,逆转录PCR(RT-PCR)和免疫荧光化学法检测神经干细胞和其诱导后细胞的表面标志物。结果:无血清培养基条件下培养的细胞在光镜下可见呈悬浮生长,易聚集成神经球,RT-PCR和免疫荧光化学法可检测到N SC表面标志物N estin的表达;经血清培养基诱导分化后,光镜下可见细胞呈贴壁生长,可见胞体呈树突状突起或呈梭形,RT-PCR和免疫荧光化学法可检测到星形胶质细胞的表面标志物GFAP和神经元细胞的表面标志物N SE的表达。结论:胚胎大鼠海马区分离的细胞具有N SC的特性,并能在含特定生长因子的无血清培养基保持其分化潜能,为进一步针对N SC的研究奠定了基础。     

组织块法培养人胃成纤维细胞及其结缔组织生长因子的表达

[目的]探索人胃成纤维细胞体外培养的技术方法及其结缔组织生长因子表达情况。[方法]采用组织块贴壁培养法进行人胃成纤维细胞体外培养并传代,倒置相差显微镜下观察成纤维细胞形态,并用免疫细胞化学法检测培养细胞的波形蛋白与角蛋白表达。用RT-PCR法检测人胃成纤维细胞结缔组织生长因子(CTGF)mRNA表达,免疫细胞荧光染色法检测人胃成纤维细胞CTGF蛋白表达情况。[结果]人胃成纤维细胞培养成功传代,表现为长梭形或星形细胞,免疫细胞化学鉴定细胞波形蛋白阳性,角蛋白阴性。RT-PCR法与免疫细胞荧光染色法证实体外培养的人胃纤维细胞表达CTGF。[结论]组织块法培养的人胃成纤维细胞可在体外稳定培养、传代,人胃成纤维细胞能合成CTGF。     

豚鼠小肠EC细胞的免疫细胞化学和银染法的比较研究

本实验利用同一切片标本，在光镜水平上，对豚鼠小肠ＥＣ细胞进行了免疫细胞化学和不同银染法的比较研究。实验结果显示，全部Ｍａｓｓｏｎ－Ｆｏｎｔａｎａ亲银染色阳性细胞均呈ＰＡＰ染色阳性；另一方面，小部分（１５％）Ｇｒｉｍｅｌｉｕｓ嗜银染色阳性细胞却表现为亲银染色和ＰＡＰ染色双阴性。以上结果表明，在显示ＥＣ细胞上，亲银染色具有很高的特异性，因此仍不失为一种经济和实用的方法；嗜银染色显示ＥＣ细胞，尽管其敏感性稍高于亲银染色法，但不具有免疫细胞化学与亲银染色技术那样明显的特异性。     

骨髓间充质干细胞诱导为成骨细胞的初步研究

目的观察兔骨髓间充质干细胞的生长特点及诱导条件下的成骨能力。方法抽取兔骨髓组织,梯度离心后,保留贴壁细胞传代,稳定传代后改用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的诱导培养液,通过倒置显微镜观察,碱性磷酸酶染色,骨连接素、骨桥素免疫细胞化学染色等方法进行观测。结果原代兔骨髓间充质干细胞7～8d左右即可长满,并可稳定传代,传代细胞5～6d即可传代。诱导培养细胞碱性磷酸酶染色,骨连接素、骨桥素免疫细胞化学染色阳性。结论兔骨髓间充质干细胞经合理的体外诱导培养后,符合成骨细胞的形态特征和生物学特性,可为体外构建组织工程化骨提供自体种子细胞。     

改良人牙龈上皮细胞原代培养方法

目的：建立稳定的人牙龈上皮细胞的原代培养方法,为牙周组织的细胞学研究提供可靠的细胞来源,对原有的原代培养方法进行了改良,期望达到培养成功率高、原代培养时间短且操作简便的效果。方法： 选择行“冠延长术”的牙周相对健康者9人,取冠延长术切除的领圈牙龈组织进行牙龈上皮细胞的原代培养,培养方法包括改良酶消化法和组织块法。改良酶消化法使用2.5 g/L DispaseⅡ酶（Ⅱ型分离酶）浸泡组织块过夜,将上皮与结缔组织分离,再用0.025%（质量分数）不含EDTA（乙二胺四乙酸）的胰蛋白酶静置消化上皮碎片10 min,不弃去上皮碎片直接离心并重悬细胞,不仅降低了酶的消化浓度,减少了消化时间,还简化了重悬细胞的过程;组织块法相对以往方法并无改良。观察两种方法所培养原代细胞的生长过程,在培养成功后对细胞进行免疫细胞化学染色鉴定,并比较两种方法的成功率和培养时间。结果： 改良后的酶消化法能够比较快地培养出细胞特征明确的人牙龈上皮细胞,成功率达88.9%,且细胞成片状生长,10~14 d后可传代,传至3代后细胞形态逐渐不规则直至凋亡,而组织块法原代培养成功率虽然相同,但时间更长,17~22 d后才可传代。经免疫细胞化学染色,角蛋白染色阳性。结论： 改良酶消化法能够快速培养出原代人牙龈上皮细胞并传代,可作为细胞学研究的稳定细胞来源。     

成年大鼠侧脑室下区星形胶质细胞的培养与纯化

目的:探讨SD大鼠侧脑室下区星形胶质细胞(AST)的体外培养与纯化方法。方法:将差速贴壁后SD大鼠侧脑室下区AST置于含有B27添加剂的DMEM/F12中培养,采用低浓度血清(2.5～5ml/L)调整法对AST进行纯化。观察AST生长变化,采用形态学和GFAP免疫细胞化学染色进行细胞和纯度鉴定。结果:体外培养的大鼠侧脑室下区星形胶质细胞呈纤维状聚集或类圆形散在生长,GFAP染色呈阳性反应,细胞胞浆着色较深,高倍视野下细胞骨架形态清晰可见,细胞核不着色。在体外培养14～15d时可以获得91%的AST。结论:差速贴壁结合低浓度血清调整法是一种简单实用的AST体外培养纯化方法。