低氧依赖低氧诱导因子-1α增强卵巢癌细胞SKOV3中乙酰肝素酶的表达及其侵袭力

目的研究低氧条件下卵巢癌细胞株SKOV3中乙酰肝素酶(HPA)的表达及其侵袭力的变化,探讨低氧诱导因子-1α(HIF-1α)与SKOV3细胞侵袭力变化的关系。方法将SKOV3细胞分为常氧组、低氧组和低氧加雷帕霉素组。低氧组细胞在5%CO2 1%O2的条件下培养;在低氧培养前30min,向低氧加雷帕霉素组细胞培养基中加入终浓度为10ng/ml的雷帕霉素。分别于低氧培养12、24、36h收集细胞,采用Western bloting和RT-PCR方法检测HIF-1α和HPA的表达,基质凝胶侵袭实验检测细胞侵袭力。结果低氧条件下,HIF-1α的蛋白表达显著高于常氧组(P<0.05),而HIF-1αmRNA的表达不随氧浓度的降低而改变。低氧组HPAmRNA和蛋白质的表达量均显著高于常氧组(P<0.05)。雷帕霉素能抑制低氧导致的HPA mRNA和蛋白质表达的升高,HPA mRNA和蛋白质的表达均显著低于低氧组(P<0.05)。低氧组细胞的侵袭力显著高于常氧组(P<0.05)。SKOV3细胞HPA的表达与细胞侵袭力呈正相关(r=0.9863,P<0.01)。结论低氧可能依赖HIF-1α途径显著增强SKOV3细胞HPA的表达及其细胞的侵袭力。     

在缺氧微环境中姜黄素对PANC-1中HIF-1α基因表达的影响

目的探讨体外缺氧条件下姜黄素对人胰腺癌细胞PANC-1中缺氧诱导因子-1α（HIF-1α的抑制作用和机制。方法缺氧条件下体外培养PANC-1,RT～PCR检测不同剂量的姜黄素作用24h后HIF-1αmRNA表达的变化;ELISA检测处理后PANC-1细胞中HIF-1α蛋白的表达水平。结果PANC-1细胞在O．1、1、10、100gmol／L姜黄素处理后,HIF-1α蛋白水平与对照组比较明显降低（F=138．43,P〈0．01）,且有明显的剂量依赖性,随剂量的增大而降低,但各剂量组HIF-1α的mRNA水平与对照组比较无显著性差异。结论缺氧条件下,姜黄素抑制人胰腺癌PANC-1细胞HIF-1α的转录活性,是通过抑制HIF-1α蛋白的合成来调控的。     

模拟低氧对舌鳞癌SCC-15细胞系中SOX2和OCT4表达的影响

目的 研究模拟低氧条件对舌鳞癌SCC-15细胞增殖、周期、凋亡的影响,及SOX2和OCT4蛋白、mRNA的表达变化.方法 体外培养舌鳞癌SCC-15细胞,加入模拟低氧物去铁胺(desferrioxamine,DFO)模拟低氧环境,为模拟低氧组,同时设置不加DFO的常氧组为对照,采用CCK-8法检测SCC-15细胞的增殖率;流式细胞技术检测SCC-15细胞的周期和细胞凋亡率;蛋白质印迹法检测常氧组和模拟低氧组SCC-15细胞中低氧诱导因子1α(HIF-1α)、SOX2及OCT4蛋白的表达;qPCR检测常氧组和模拟低氧组SCC-15细胞中HIF-1α、SOX2及OCT4mRNA的表达.结果 与常氧组相比,模拟低氧组SCC-15细胞的增殖受到抑制(P＜0.05),G1期细胞所占比例上升、S+G2期细胞所占比例下降(P＜0.05),细胞凋亡率未见明显变化(P＞0.05);蛋白质印迹法结果显示,与常氧组比较,模拟低氧组SCC-15细胞中HIF-1α、SOX2、OCT4蛋白的表达均升高,且HIF-1α、OCT4蛋白的升高幅度大于SOX2蛋白,差异有统计学意义(P＜0.05,P＜o.01);qPCR结果显示,两组SCC-15细胞中HIF-1α mRNA水平差异无统计学意义(P＞0.05),而模拟低氧组SCC-15细胞中SOX2、OCT4 mRNA的表达水平高于常氧组(P＜0.05).结论 DFO可以有效模拟低氧环境,促进SOX2和OCT4的蛋白和mRNA表达水平升高.     

曲古抑菌素A体外对结肠癌细胞凋亡及低氧状态下其缺氧诱导因子-1α表达的影响

目的:观察曲古抑菌素A(TSA)体外对结肠癌HT-29细胞凋亡及低氧状态下其缺氧诱导因子(HIF)-1α表达的影响.方法:体外培养结肠癌HT-29细胞,给予TSA 100、200、400、600、800 nmol/L分别处理12、24、48、72h,对照组加入同等体积的DMSO.MTT法检测各组HT-29细胞的存活率;Annexin V、TUNEL法检测HT-29细胞凋亡率;RT-PCR、免疫印迹法分别检测低氧状态下(37℃、1%O2)HT-29细胞HIF-1α mRNA及蛋白的表达.结果:MTT法检测结果发现,与对照组相比,TSA处理组HT-29细胞活力明显降低(P＜0.05),随着浓度的增大、时间的延长,其抑制作用逐渐增强.Annexin V、TUNEL法检测结果发现,TSA能诱导HT-29细胞的早期凋亡,TSA(200、400、600、800 nmol/L)处理组凋亡率明显高于对照组(P＜0.05).低氧条件下,TSA抑制HT-29细胞HIF-1α蛋白的表达,随着浓度的增大,其抑制作用逐渐增强;而对HIF-1α mRNA的表达无影响.结论:TSA体外可能通过抑制低氧条件下HT-29细胞HIF-1α蛋白的表达,诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖.     

低氧培养的肝癌细胞中低氧诱导因子1的表达与血管生成和细胞凋亡相关蛋白的关系

目的:观察低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)在低氧培养的肝癌细胞中的表达变化,并初步探讨其与血管生成和细胞凋亡的关系.方法:将终浓度为125 μmol/L的氯化钴加入HepG2肝癌细胞培养液中模拟低氧环境,并设培养不同时间(0、1、2、4、6、8 h)组.(1)采用RT-PCR技术检测低氧培养不同时间的肝癌细胞中HIF-1α、VEGF、Caspase-3、bcl-2和bax mRNA的表达;(2)应用Western印迹方法及酶标免疫测量仪分别检测了各培养组细胞Caspase-3蛋白表达及Caspase-3酶活性.结果:(1)HepG2细胞在低氧培养1～2 h后,其HIF-1α、VEGF、bcl-2 mRNA的表达逐渐增加,在4 h达到高峰,随后下降,但仍高于低氧处理前水平;而bax mRNA表达无明显变化,bcl-2/bax比值与上述变化趋势一致.(2)Caspase-3 mRNA及蛋白的表达及酶活性变化趋势与HIF-1α正好相反.结论:HIF-1α可能通过调节VEGF、bcl-2、bax和Caspase-3的表达而抑制肝癌细胞凋亡,且这种抑制作用与缺氧程度有关.     

低氧微环境下siRNA靶向沉默HIF 2α基因对前列腺癌PC 3细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察体外低氧条件下缺氧诱导因子-2α(HIF-2α)在人前列腺癌细胞PC-3中的表达情况,并研究siRNA沉默HIF-2α基因对前列腺癌PC-3细胞生长及凋亡的影响.方法 在体外培养的PC-3细胞中加入化学诱导剂CoCl2建立低氧模型,采用逆转录PCR(RT-PCR)和Western印迹法检测CoCl2诱导HIF-2αmRNA和蛋白表达的时-效和量-效关系.合成HIF-2αsiRNA片段并转染前列腺癌PC-3细胞,采用RT-PCR及Western印迹法检测HIF-2αsiRNA对HIF-2α基因表达的影响,采用MTT法检测转染HIF-2αsiRNA后对PC-3细胞生长的抑制情况,采用流式细胞仪检测RNA干扰对PC-3细胞凋亡的影响.结果 (1)低氧可诱导PC-3细胞的HIF-2αmRNA表达,与常氧组比较,低氧12,24及48 h组的HIF-2αmRNA和蛋白表达量逐渐升高(P<0.05).100μmol/L的CoCl2作用48 h可作为最佳前列腺癌细胞PC-3低氧模型.(2)低氧+HIF-2αsiRNA干扰组的HIF-2αmRNA和蛋白表达水平明显低于低氧+阴性对照组和低氧组(P<0.05),而低氧+阴性对照组与低氧组的HIF-2αmRNA和蛋白表达水平无显著性差异(P>0.05).低氧+HIF-2αsiRNA干扰组细胞增殖受抑制、细胞凋亡增加(P<0.05),而常氧组、低氧组、低氧+阴性对照组细胞增殖活力和凋亡差别均无统计学意义(P>0.05).     

低氧微环境对脑胶质瘤细胞增殖、凋亡及HIF-1α表达的影响

目的观察低氧微环境对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响;探索不同时间梯度和细胞密度在低氧微环境下对HIF-1α表达的影响。方法 (1)构建脑胶质瘤细胞(T98G)生长的缺氧微环境,将细胞设为低氧组(1%氧气含量)和常氧组(21%氧气含量),在不同氧浓度下培养4～72 h后观察细胞生长情况;利用western blot印迹法检测低氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达情况;(2)将低氧组T98G细胞设计为四组不同细胞密度,在1%O2的低氧浓度下培养24 h,通过Western blot检测四组细胞HIF-1α表达情况。结果 (1)倒置显微镜和Hoechest染色均未见低氧组和常氧组细胞发生明显的细胞凋亡,MTT法检测二组细胞均呈增殖状态。与常氧组相比,低氧组细胞HIF-1α蛋白明显高表达(P <0.001)。低氧组细胞在4、6、12、24 h (<24 h) HIF-1α蛋白表达量快速升高(P <0.05),24、48、72 h (> 24 h) HIF-1α蛋白表达量逐渐下降;(2)低氧微环境下四组不同细胞密度中,24 h后高密度组(8.5万个细胞/cm2)细胞的HIF-... 更多     

车叶草苷通过内质网应激促进胰腺癌细胞凋亡的机制研究

目的:探讨车叶草苷(ASP)通过内质网应激(ERS)诱导胰腺癌(PC)细胞凋亡的机制。方法:选取人胰腺癌PANC-1细胞作为研究对象。将PANC-1细胞按照随机数字表法分为4组，分别为对照组、ASP组、ERS抑制剂4-苯基丁酸(4-Phenylbutyric acid, 4-PBA)组和ASP+4-PBA组。采用CCK-8检测细胞增殖情况，采用流式细胞术检测细胞凋亡情况，Transwell法检测细胞迁移，蛋白质印迹法检测细胞中活化转录因子6(ATF6)、C/BEP环腺苷酸反应元件结合转录因子同源蛋白(CHOP)、活化的半胱氨酸蛋白酶3(cleaved-caspase 3)、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)及肌醇依赖性激酶1α磷酸化蛋白(p-IRE1α)相对表达水平。结果:随着ASP浓度的增加，PANC-1细胞增殖率呈下降趋势。与对照组相比，ASP组迁移细胞数量降低，细胞凋亡率增加，ATF6、CHOP、cleaved-caspase-3、PERK及p-IRE1α蛋白相对表达水平上升，差异均有统计学意义(P<0.05)。与ASP组相比，ASP+4-PBA组细胞迁移数量增多、细胞凋亡...     

低氧诱导胰腺癌细胞通过外泌体途径分泌高迁移率族蛋白1

目的: 研究低氧诱导条件下胰腺癌细胞中高迁移率族蛋白1(high mobility group box 1 protein,HMGB1)的分泌途径。方法: 经GEO和TCGA数据库分析HMGB1在胰腺癌样本中的表达;低氧处理胰腺癌PaTu8988细胞0,6,12,24,48 h,免疫印迹法检测培养上清液中HMGB1的含量;采用外泌体提取试剂盒分离常氧和低氧培养液中的外泌体,运用透射电镜观察外泌体膜结构,运用免疫印迹法检测外泌体中的HMGB1以及外泌体标志蛋白CD9、CD63、CD81以及HSP70的表达;利用免疫荧光法和激光扫描共聚焦显微镜观察HMGB1在PaTu8988细胞中的定位情况。结果： 数据库分析结果表明,与健康胰腺组织相比,HMGB1在胰腺癌组织中呈高表达(P<0.01),且高表达者生存期明显短于低表达者(P<0.05)。低氧处理48 h,细胞培养上清液中的HMGB1含量最多,明显高于6,12,24 h。透射电镜观察到培养上清液中有微囊泡结构,直径在100 nm左右,蛋白质免疫印迹法检测到外泌体膜标志蛋白CD9,CD63,CD81,HSP70的表达和外泌体中HMGB1的表达。免疫荧光结果显示,低氧情况下HMGB1和外泌体共定位增多。 结论： 低氧处理条件下,胰腺癌细胞中HMGB1可通过外泌体途径释放到细胞外。     

低氧诱导因子-1α诱导鼠胚成骨细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的实验研究

目的:观察低氧诱导因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)在化学诱导的低氧状态下培养的原代鼠胚成骨细胞中的表达变化,并初步探讨在低氧条件下HIF-1α对成骨细胞VEGF表达的影响及与血管生成的关系。方法:在无菌条件下取妊娠19天左右的KM胎鼠颅骨,进行原代鼠胚成骨细胞的培养,并对细胞进行纯化及鉴定。将终浓度为125umol/L的氯化钴加入成骨细胞培养液中模拟缺氧状态,并设培养不同时间(0,3,6,9,12小时),采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测低氧培养不同时间的成骨细胞中HIF-1α和VEGF的表达情况。结果:成骨细胞在低氧培养后,其HIF-1αmRNA和VEGFmRNA的表达水平逐渐增加,在9小时达到高峰,随后下降,但仍高于低氧处理前水平。结论:HIF-1α可能通过调节VEGF表达水平而促进血管生成,并且这种促进作用可能和缺氧程度有关。     

配对盒基因2对正常肾小管上皮细胞间充质转分化的诱导作用

［摘 要］ 目的:观察体外转染配对盒基因2（PAX2）对肾小管上皮细胞表型标志物的影响,探讨PAX2诱导转分化的作用,为肾纤维化治疗提供依据。方法:正常肾小管上皮细胞株NRK52E分为对照组、空载组(转染pGC-Fu空质粒)和转染组(采用脂质体转染法将pGC-FU-GFP-PAX2质粒转染至细胞中)。转染72 h后应用倒置相差显微镜观察各组细胞形态,应用Western blotting法和Real-time PCR法检测PAX2蛋白和mRNA表达水平;转染72 h后应用免疫组织化学法、Western blotting法和Real-time PCR法检测各组细胞E-钙黏蛋白(E-cadherin) 和α-肌动蛋白(α-SMA)及其mRNA表达水平。结果：pGC-FU-GFP-PAX2转染72 h后,转染组细胞绿色荧光强度较对照组明显增强,且肾小管上皮细胞的形态伸长; Western blotting法检测,转染组PAX2蛋白表达水平明显高于空载组和对照组（P<0.05）;Real-time PCR检测,转染组细胞的PAX2mRNA表达水平明显高于空载组和对照组（P<0.05）;转染组细胞中的E-cadherin染色较空载组和对照组明显减弱;α-SMA染色较空载组和对照组明显增强。Western blotting法检测,转染组细胞中E-cadherin表达水平明显低于空载组和对照组（P<0.05）;α-SMA表达水平明显高于空载组和对照组（P<0.05）;Real-time PCR检测,转染组细胞中E-cadherin mRNA表达水平明显低于空载组和对照组（P<0.05）;α-SMA mRNA表达水平明显高于空载组和对照组（P<0.05）。结论：PAX2转染正常肾小管上皮细胞后E-cadherin表达减少,α-SMA表达增加,PAX2可能在体外诱导正常肾小管上皮细胞间充质转分化。     

WNT4基因沉默对PAX2诱导肾小管上皮细胞间充质转分化的影响

目的：观察体外转染配对盒基因2（PAX2）对WNT4通路的激活作用及WNT4通路对PAX2诱导转分化的作用,探讨PAX2转分化机制。方法：应用脂质体介导将重组质粒pEGFP-PAX2转染入体外培养的大鼠肾小管上皮细胞,经G418 筛选,建立稳定表达PAX2细胞系。细胞分为稳定转染PAX2组、空载组和对照组。Western blotting法和实时荧光定量(Real-time)PCR法检测各组细胞WNT4和β-catenin表达。应用靶向WNT4基因的siRNA沉默稳定转染PAX2细胞的WNT4,应用荧光显微镜观察转染效率,进行沉默鉴定筛选出最佳干扰链。将最佳干扰链WNT4 siRNA转染至稳定转染PAX2细胞。在沉默24、48、72和96 h应用Western blotting法和Real-time PCR法检测β-catenin、正常肾小管上皮细胞表型标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)和成纤维细胞表型标志物α-肌动蛋白（α-SMA）表达,同时筛选出沉默最佳时间点。应用免疫组织化学染色法检测沉默最佳时间点组E-cadherin和α-SMA蛋白表达。结果：Western blotting和Real-time PCR检测,稳定转染PAX2细胞组WNT4 和β-catenin蛋白及mRNA表达水平较空载组和对照组明显增加（P<0.05）。阴性siRNA转染入稳定转染PAX2细胞24 h 后荧光显微镜观察,转染效率为47.46％±4.48％。3条WNT4干扰链分别转染至稳定转染PAX2细胞,Real-time PCR和Western blotting结果显示第3干扰链沉默效果最佳,WNT4 mRNA 表达抑制率为66.9 ％±3.8％（P<0.05）; WNT4 蛋白表达抑制率为63.7％±2.5％（P<0.05）。将最佳干扰链转染至稳定转染PAX2细胞,干扰24、48、72和96 h后,各时间点细胞中的β-catenin mRNA及蛋白表达水平较对照组下调,72 h组下调明显（P<0.05）;各时间点细胞中E-cadherin mRNA及蛋白表达水平较对照组明显上调,72 h组上调明显（P<0.05）;各时间点细胞中α-SMA mRNA及蛋白表达水平较对照组明显下调,72 h下调明显（P<0.05）。结论：PAX2转染至肾小管上皮细胞后激活了WNT4通路,PAX2在体外诱导正常肾小管上皮细胞间充质转分化可能是通过WNT4/β-catenin通路完成。     

CD155依赖m6A修饰调控宫颈癌细胞的恶性行为

目的:探究CD155在宫颈癌中的作用和依赖m6A修饰的调控机制。方法:应用数据库预测宫颈癌细胞中CD155（PVR）的表达情况，CD155对患者预后的影响，运用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法测定宫颈癌细胞HeLa和宫颈永生细胞S12中CD155的表达水平。分别运用MTT、平板克隆、迁移侵袭等实验评估CD155对宫颈癌细胞HeLa生长、增殖、迁移和侵袭的影响。应用Western印迹法测定E-钙黏蛋白（E-cad）和波形蛋白（Vimentin）的表达水平并评价CD155对EMT的影响。MeRIP-RT-qPCR检测CD155是否受m6A 调控，Western印迹法和qRT-PCR测定METTL3是否影响CD155蛋白和RNA的表达水平。放线菌素D处理细胞后检测METTL3对CD155RNA半衰期的作用，利用预测网站m6ATaget预测CD155RNA甲基化位点的识别者（Reader），运用Western印迹法和qRT-PCR分析YTHDF1是否影响CD155蛋白和RNA的表达水平，放线菌素D处理细胞后检测YTHDF1对CD155RNA半衰期的作用，RIP-RT-qPCR实验进一步确定YTHDF1和YTHDF1-mut对CD155RNA下拉能力。结果: CD155在宫颈癌组织和细胞中表达较高，体内高表达CD155的患者生存率较低。相比S12细胞，HeLa细胞中CD155的表达增加（t=3.749，P<0.05）。CD155的高表达促进了体外宫颈癌细胞的生长（t=3.152，P<0.05）、增殖（t=3.706，P<0.05）、迁移（t=5.422，P<0.01）和侵袭（t=3.599，P<0.05），抑制E-cad的表达促进了Vimentin的表达。MeRIP-RT-qPCR结果显示CD155RNA受m6A调控，METTL3促进了CD155蛋白和RNA（t=6.725，P<0.05）的表达，敲降METTL3之后CD155RNA半衰期降低（t=5.622、6.063、5.857，均P<0.05）。敲降YTHDF1之后CD155的蛋白水平降低，CD155RNA半衰期降低（t=10.93、5.602、4.359，均P<0.05）。在YTHDF1高表达的细胞中，CD155RNA被有效免疫沉淀（t=4.686，P<0.01），但在YTHDF1-mut转染的细胞中，免疫沉淀结果显示下拉的CD155RNA水平明显降低（t=4.462，P<0.05）。结论:CD155RNA在m6A修饰的情况下，被YTHDF1特异性识别，进而稳定性增强和翻译增加，CD155表达增加促进了宫颈癌细胞的恶性行为。     

直接肾素抑制剂阿利吉仑对肾纤维化小鼠上皮-间质转化的调节作用

目的：探讨直接肾素抑制剂阿利吉仑对单侧输尿管结扎引起的小鼠肾纤维化中上皮-间质转化（EMT）的调节作用,阐明阿利吉仑抗肾纤维化的作用机制。方法：24只雄性ICR小鼠分为假手术组、模型组和阿利吉仑干预组,采用单侧输尿管结扎方法制作小鼠肾纤维化模型。HE染色观察小鼠肾间质纤维化的病理组织形态,Masson染色观察小鼠肾间质纤维化中胶原蛋白的表达情况,免疫组织化学染色法观察胞浆中α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达,免疫印迹法检测小鼠肾组织中E钙黏蛋白（E-cad）、α-SMA和Ⅰ型胶原（Col Ⅰ）的表达水平。结果：通过单侧输尿管结扎方法成功制备小鼠肾纤维化模型。HE染色和Masson染色,与模型组比较,阿利吉仑干预组小鼠肾纤维化程度明显降低,胶原蛋白表达明显减少。免疫组织化学染色,阿利吉仑干预组小鼠肾小管间质纤维化区域胞浆内α-SMA阳性显色较模型组明显减少。免疫印迹法,模型组小鼠肾组织中α-SMA和Col Ⅰ蛋白表达水平升高,分别是假手术组的1.79倍和1.95倍;E-cad蛋白表达水平降低,为假手术组的37.23%,组间比较差异有统计学意义（P<0.05）;阿利吉仑干预组小鼠肾组织中α-SMA和Col Ⅰ蛋白表达水平降低,E-cad蛋白表达水平升高,分别是模型组的63.72%、65.54%和2.1倍,组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：阿利吉仑能够通过上调E-cad的表达同时下调α-SMA、Col Ⅰ的表达抑制小鼠肾纤维化中EMT,进而发挥抗纤维化的作用。     

糖原合成酶激酶-3β磷酸化 促进人腹膜间皮细胞转分化的实验研究

目的：探讨糖原合成酶激酶（GSK）-3β磷酸化在人腹膜间皮细胞(HPMC)转分化中的作用。方法：从人腹膜组织中分离和培养人原代腹膜间皮细胞。观察GSK-3β抑制剂氯化锂（LiCl）对HPMC GSK-3β磷酸化的影响,在不同时间点（0,1,3,6,12 h）和不同浓度（0,5,10,20,40 mmol/L）LiCl下Western 印迹检测p-GSK-3β和总GSK-3β表达水平的变化。Western 印迹检测20 mmol/L LiCl作用HPMC不同时间,α-SMA和E-cadherin蛋白的表达。间接免疫荧光染色方法检测α-SMA的表达和分布。结果：LiCl促进HPMC GSK-3β磷酸化在一定范围内呈浓度依赖性和时间依赖性（P＜0.05）,但总GSK-3β水平不变（P＞0.05）。20 mmol/L LiCl干预HPMC 24 h后,α-SMA表达显著增高（P＜0.05）,E-cadherin表达显著下调（P＜0.05）。间接免疫荧光结果显示20 mmol/L LiCl作用24 h后α-SMA表达显著增高（P＜0.05）。结论：GSK-3β磷酸化能诱导HPMC发生上皮-间质细胞转分化,为治疗腹膜纤维化提供了新的思路。     

KIF3A在单侧输尿管梗阻小鼠肾脏中的表达及意义

目的 通过研究KIF3A在单侧输尿管梗阻（UUO）小鼠和TGF-β1诱导的NRK-52E细胞中的表达情况,探讨KIF3A在肾间质纤维化中的作用。方法 将36只C57BL/6J小鼠随机分为假手术组（Sham, n=18）和单侧输尿管梗阻组（UUO, n=18）,分别于术后7、14、21 d 处死小鼠。苏木素-伊红（HE）染色、马松（Masson）三色法染色和天狼星红（Sirius Red）染色观察小鼠肾间质纤维化程度,RT-PCR、免疫组织化学（IHC）和免疫印迹（Western blot）检测小鼠肾组织KIF3A的表达和分布。免疫印迹检测小鼠肾组织KIF3A、E-cadherin 和α-SMA 蛋白的表达。TGF-β1诱导NRK-52E细胞转分化后,免疫印迹检测KIF3A、E-cadherin 、α-SMA、Wnt4和β-catenin 蛋白的表达。结果 与Sham组相比,UUO小鼠肾间质纤维化程度随着梗阻时间延长而增加,表明造模成功。同时,KIF3A mRNA和蛋白表达均增高,于21 d达到高峰,α-SMA蛋白表达显著上调,E-cadherin蛋白表达明显降低。NRK-52E细胞发生转分化时,KIF3A蛋白的表达增多（P<0.001）,同时wnt/β-catenin信号通路中Wnt4和β-catenin蛋白表达增加（P<0.05,P<0.0001）。结论 KIF3A可能通过wnt/β-catenin信号通路介导的上皮细胞-间充质转化参与肾纤维化的发生发展过程。     

miR-506通过靶向Slug调节上皮间充质转化对乳腺癌细胞侵袭和转移的抑制作用

目的 探讨miR-506通过靶向Slug调节上皮间充质转化对乳腺癌细胞侵袭和转移的抑制作用.方法 采用实时荧光定量PCR检测8株乳腺癌细胞系(MCF7、BT474、SK-BR-3、MDA-MB-453、MDA-MB-468、HCC1937、BT549和MDA -MB -231)中miR-506的表达量,以正常乳腺上皮细胞MCF10A为对照.通过脂质体转染的方法在MDA-MB-231和BT549细胞系中瞬时过表达miR-606模拟物(设阴性对照),通过划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验观察细胞运动能力的变化;观察MDA-MB-231和BT549细胞系转染miR-506前后细胞形态学变化;Western blotting法检测E-cadherin、Vimemin和Slug蛋白表达的变化.荧光素酶报告基因分析实验检测M DA-MB-231细胞中miR-506过表达对野生型荧光素酶活性的影响.结果 miR-506在各乳腺癌细胞中的表达量相对于正常乳腺上皮细胞MCF10A显著降低(P＜0.01).miR-506过表达显著抑制MDA-MB-231和BT549细胞的迁移和侵袭能力,与阴性对照的差异有统计学意义(P＜0.01).MDA-MB-231和BT549细胞瞬时转染miR-506 48 h后发生明显的形态学改变;Western blotting结果显示miR-506过表达在MDA-MB-231和BT549细胞中均上调E-cadherin的表达,下调Vimentin的表达.Western blotting检测结果显示MDA-MB-231细胞转染miR-506后Slug蛋白水平明显低于阴性对照;荧光素酶报告基因分析结果显示miR-506过表达显著抑制野生型荧光素酶的活性.结论 在乳腺癌中,miR-506可以通过靶向转录因子Slug诱导细胞发生上皮间充质转化,进而抑制细胞的侵袭和转移能力,这是miR-506参与乳腺癌发生和发展的可能途径之一.     

脐带间充质干细胞外泌体对大鼠肾间质纤维化的抑制作用

目的: 探讨人脐带间充质干细胞来源的外泌体（human umbilical cord mesenchymal stem cell derived exosomes,hucMSC-Ex）对单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction, UUO）所致大鼠肾小管间质纤维化的修复作用。方法: 分离培养hucMSC并从培养上清液中提取hucMSC-Ex。采用单侧输尿管结扎法构建肾间质纤维化模型,将大鼠随机分为假手术组、UUO组和hucMSC-Ex组,每组6只,hucMSC-Ex组大鼠在术后24 h 尾静脉注射250 μg hucMSC-Ex。7 d后收集肾脏组织,观察各组肾脏大体观。蛋白质印迹检测肾组织纤维化相关蛋白TGF-β1、E-钙黏蛋白和波形蛋白,并对肾脏组织切片进行HE染色、Masson染色和免疫组织化学染色,观察大鼠梗阻侧肾脏病理结构变化、炎症细胞浸润情况及肾纤维化程度,综合评价hucMSC-Ex对大鼠肾脏纤维化的抑制效果。结果： 与假手术组相比,UUO组大鼠肾脏炎性细胞浸润显著增加,组织结构严重破坏,广泛胶原沉积;hucMSC-Ex干预后组织形态结构部分恢复,胶原沉积减少,炎性细胞浸润减少。同时,UUO组大鼠肾脏α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、TGF-β1和波形蛋白表达升高,E-钙黏蛋白表达降低;但hucMSC-Ex输注后能够抑制α-SMA和TGF-β1的表达,逆转上皮间质转化。结论： hucMSC-Ex可以减轻大鼠肾组织病理损伤,延缓大鼠肾间质纤维化的进程。     

特异性沉默α-catulin基因的表达对舌鳞状细胞癌TSCCA细胞增殖和凋亡的影响

目的: 探讨α-catulin基因对人舌鳞状细胞癌(TSCC)TSCCA细胞增殖和凋亡的影响,阐明α-catulin在TSCCA细胞生物学行为中的作用。方法: 取对数生长期的TSCCA细胞,分为α-catulin-siRNA转染组、空质粒转染组和空白对照组。RT-PCR法检测各组TSCCA细胞中α-catulinmRNA相对表达水平;Western blotting法检测各组TSCCA细胞中α-catulin蛋白的相对表达水平,MTT法检测细胞生长抑制率,流式细胞术检测各组TSCCA细胞凋亡率。结果: RT-PCR检测,与空质粒转染组和空白对照组比较,α-catulin-siRNA转染组TSCCA细胞中α-catulinmRNA相对表达水平降低(P<0.01),且随着时间的相对延长,α-catulinmRNA相对表达水平逐渐降低,72h时其相对表达水平低于24和48h时(P<0.01)。Western blotting法检测,与空质粒转染组和空白对照组比较,α-catulin-siRNA转染组TSCCA细胞中α-catulin蛋白相对表达水平降低(P<0.05)。MTT法检测,与空质粒转染组和空白对照组比较,α-catulin-siRNA转染组TSCCA细胞生长抑制率升高(P<0.001)。流式细胞术检测,与空质粒对照组和空白对照组比较,α-catulin-siRNA转染组TSCCA细胞凋亡率升高(P<0.001)。结论: 特异性沉默α-catulin基因的表达可抑制TSCC的TSCCA细胞的增殖,促进其凋亡。