糖尿病大鼠主动脉自噬水平的变化及雷帕霉素的干预作用

目的观察糖尿病大鼠主动脉自噬水平的变化及雷帕霉素的干预作用,探讨雷帕霉素是否通过调节自噬、内质网应激和细胞凋亡对糖尿病大鼠主动脉产生保护作用。方法雄性SD大鼠用随机数字表法分为正常对照组、糖尿病组和雷帕霉素干预组。采用链脲佐菌素制备1型糖尿病大鼠模型。雷帕霉素干预组给予雷帕霉素2mg/(kg·d)灌胃。于实验第8周留取血标本,用于血生物化学指标和脂联素水平检测,然后处死动物并迅速取出胸主动脉和腹主动脉,测定主动脉Beclin1、微管相关蛋白轻链3(LC3)、p62、C/EBP同源蛋白(CHOP)、Caspase-12、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、Bax和Bcl-2的mRNA和蛋白表达。结果与正常对照组比较,糖尿病组大鼠血清脂联素水平显著降低(P0.05),主动脉壁增厚,内皮严重受损,主动脉Beclin1、LC3的mRNA和蛋白表达水平及Bcl-2mRNA表达水平显著降低(P 0. 05),主动脉p62、CHOP、Caspase-12和GRP78的mRNA和蛋白表达水平及Bax mRNA表达水平显著升高(P0.05)。与糖尿病组比较,雷帕霉素干预组大鼠血清脂联素水平显著升高(P0.05),主动脉组织病理改变显著减轻,主动脉Beclin1、LC3的mRNA和蛋白表达水平及Bcl-2 mRNA表达水平显著升高(P0.05),主动脉p62、CHOP、Caspase-12和GRP78的mRNA和蛋白表达水平及Bax mRNA表达水平显著降低(P0.05)。结论糖尿病大鼠主动脉组织自噬水平降低,雷帕霉素可能通过激活自噬和减轻内质网应激和细胞凋亡水平对糖尿病大鼠主动脉产生保护作用。     

抑制CK2增加Sorbitol引起的肺癌细胞凋亡

目的探讨抑制CK2对雷帕霉素引起的肺癌细胞凋亡的影响。方法选用人肺癌A549细胞,MTT方法检测单独利用山梨醇(Sorbitol)或者联合CK2抑制剂TBB对A549细胞活性的影响,Western印迹检测单独利用Sorbitol或者联合CK2抑制剂TBB凋亡相关蛋白caspase-3和PARP,以及线粒体凋亡相关蛋白细胞色素C表达水平的影响。结果 MTT结果显示,Sorbitol可以显著引起A549细胞活性下降,并呈现时间依赖性和剂量依赖性。Western印迹结果显示,Sorbitol可以引起凋亡相关蛋白Cleaved PARP、Cleaved caspase-3以及细胞色素C表达水平明显上升。MTT结果显示,联合应用CK2抑制剂可以明显增加Sorbitol,引起细胞活性降低。Western印迹显示,与单独给予Sorbitol比较,联合应用CK2抑制剂TBB,凋亡相关蛋白Cleaved PARP、Cleaved caspase-3进一步增加。结论 CK2抑制剂TBB可提高人肺癌A549细胞对Sorbitol的敏感性。     

雷帕霉素对肺癌SPC-A-1细胞增殖和凋亡的影响

目的 分析不同浓度的雷帕霉素体外处理人肺癌SPC-A-1细胞后,对细胞的增殖及凋亡的影响,并探讨其可能的作用机制。方法 采用CCK-8法测定雷帕霉素(5 ng/mL,10 ng/mL,15 ng/mL)处理人肺癌SPC-A-1细胞48 h后对细胞增殖的影响。运用FITC-Annexin V/PI双染色法,测定雷帕霉素处理SPC-A-1细胞48 h后对细胞凋亡的影响。使用Western Blot技术测定雷帕霉素作用SPC-A-1细胞48h后的p53、Bcl-2和Bax等凋亡蛋白表达情况。结果 雷帕霉素可以抑制SPC-A-1细胞增殖并可诱导其发生凋亡,其增殖抑制率与凋亡率变化存在剂量依赖性关系(P<0.05)。与对照组(雷帕霉素,0 ng/mL)比较,各浓度(5 ng/mL,10ng/mL,15 ng/mL)雷帕霉素处理对SPC-A-1细胞的凋亡率上升(P<0.05),且p53与Bax蛋白水平增加(P<0.05),而Bcl-2蛋白水平下降(P<0.05)。15 ng/mL雷帕霉素处理组细胞p53、Bax蛋白表达水平均与细胞凋亡率呈正相关(r=0.906,P<0...     

雷帕霉素诱导大鼠肝星状细胞凋亡的研究

目的观察雷帕霉素(RAPA)对大鼠肝星状细胞系rHSCs-99增殖、凋亡的影响。方法将rHSCs-99分成4组:对照组(A组),RAPA 50 nmol/L组(B组),RAPA 100 nmol/L组(C组),RAPA 150 nmol/L组(D组)。RAPA作用72 h后,分别用MTT法检测rHSCs-99增殖,ELISA法检测I型胶原表达,流式细胞仪Annexin-V FICT/PI法检测细胞凋亡情况,Wright-Giemsa染色法观察细胞形态学改变,细胞免疫组化法检测Fas、P53与Bcl-2的表达变化。结果 RAPA作用后,rHSCs-99增殖受到抑制,I型胶原含量降低,凋亡率增高,Fas、P53表达增多,Bcl-2表达减少。结论 RAPA能抑制rHSCs-99的增殖及I型胶原合成。促进rHSCs-99凋亡,其机制可能是通过开启Fas/FasL凋亡途径及上调凋亡相关基因P53、下调Bcl-2的表达来实现。     

重复异丙酚麻醉通过mTOR通路诱导大鼠海马细胞凋亡及自噬

目的 探究重复异丙酚麻醉对大鼠海马神经细胞凋亡和自噬的影响及雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路的影响。方法 将72只SPF级7 d龄大鼠随机分为4组,每组18只：对照组(A组)腹腔注射脂肪乳剂7.5 ml/kg, 1次/d,连续7 d;单次注射异丙酚组(B组)腹腔注射脂肪乳剂7.5 ml/kg, 1次/d,连续6 d,第7天注射异丙酚75 mg/kg;重复注射异丙酚组(C组)腹腔注射异丙酚75 mg/kg, 1次/d,连续7 d;异丙酚+雷帕霉素组(D组,雷帕霉素为mTOR抑制剂)腹腔注射雷帕霉素2.0 mg/kg和异丙酚75 mg/kg, 1次/d,连续7 d。第7天麻醉后每组随机选取12只大鼠于苏醒后抽取动脉血进行血气分析;苏木素-伊红(HE)染色观察大鼠海马组织病理学变化;原位末端标记技术(Tunel)检测海马组织神经细胞凋亡;Western印迹法检测海马组织mTOR、自噬相关蛋白Beclin-1和微管相关蛋白轻链(LC3)-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62及凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤(Bcl)-2/Bcl-2相关X蛋白(Bax)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3的表达。结果...     

细胞自噬与肺癌关系研究进展

多细胞生物生命过程中细胞死亡有程序性和非程序性之分,后者即坏死。程序性细胞死亡按其发生机制不同可以分为凋亡、自噬性细胞死亡、Paraptosis、细胞胀亡等[1]。自噬（autophagy）现象是一种高度保守的细胞行为,几乎存在于所有的物种,构成了从简单的单细胞生物、植物到哺乳动物细胞中广泛存在着的降解-再循环系统的重要组成部分,     

雷帕霉素通过下调微小RNA-27a介导的雷帕霉素靶分子信号通路调控糖尿病肾脏疾病大鼠足细胞自噬的影响研究

目的 探讨微小RNA-27a(miR-27a)介导的雷帕霉素靶分子（mTOR）信号通路调控DKD大鼠足细胞自噬的作用。方法 将30只SD大鼠随机分为正常对照组（NC,n=10）、糖尿病模型组（DKD,n=10）和雷帕霉素治疗组（Rap,n=10）。检测各组肾功能相关指标和细胞凋亡率,HE染色及免疫组化评估肾组织形态学变化。Western blot法检测各组肾组织中自噬相关指标Beclin1、微管相关蛋白1A/1B-轻链3(LC3)及mTOC蛋白表达,qRT-PCR检测足细胞特异性蛋白miR-27a、Podocalyxin、Nephrin、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Bax、Beclinl mRNA表达量。结果 与NC组比较,DKD组第6、12周FPG、24 hUAlb、BUN、血肌酐（Scr）、肾脏指数（KI）表达升高（P<0.05）。与NC组比较,DKD组细胞凋亡、mTOC蛋白、miR-27a、mTOR、Bax mRNA表达升高（P<0.05）,Beclinl、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin1、Podocalyxin、Nephrin mRNA...     

抑制自噬可以增加mTOR抑制剂AZD8055引起的喉癌细胞株Hep-2的凋亡

目的探讨抑制自噬是否可以增加哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)抑制剂(AZD8055)引起的喉癌细胞株Hep-2的凋亡。方法选用人喉癌细胞株Hep-2细胞系,应用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测m TOR抑制剂AZD8055和(或)自噬抑制剂3-甲基嘌呤(3-MA)对Hep-2细胞活性的影响。Western印迹检测AZD8055和(或)3-MA对Hep-2细胞凋亡通路相关蛋白〔Cleaved多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)、Cleaved Caspase-3、细胞色素C〕的作用。结果 AZD8055作用Hep-2细胞24 h后,细胞生存率显著下降,具有浓度依赖性。AZD8055浓度依赖性地增加Hep-2细胞凋亡相关蛋白Cleaved PARP、Cleaved Caspase-3及细胞色素C表达。当3-MA与AZD8055联用时,二者联用与单用AZD8055组相比,细胞活性显著降低,显著下调凋亡通路相关蛋白Cleaved PARP、Cleaved Caspase-3、细胞色素C表达。结论抑制自噬可以增加m TOR抑制剂AZD8055引起的喉癌细胞株Hep-2的凋亡。     

中晚期骨关节炎患者软骨细胞自噬相关因子表达变化及雷帕霉素对其软骨细胞自噬的影响

目的 比较中晚期骨关节炎(OA)患者软骨细胞自噬相关因子ULK1、Beclin1及LC3表达,并观察雷帕霉素对中晚期OA患者软骨细胞自噬的影响.方法 收集膝关节正常软骨标本5例份(正常对照组)、中期OA软骨标本10例份(中期OA组)、晚期OA软骨标本10例份(晚期OA组),体外分离、培养软骨细胞,分别采用实时荧光定量P...     

自噬在非小细胞肺癌治疗耐药中的研究进展

非小细胞肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,其进展迅速,预后差。大多数进展期的非小细胞肺癌患者在接受放化疗及靶向治疗等过程中因出现耐药现象而影响疗效。细胞自噬是真核细胞内广泛存在的现象,对细胞的生长分化、功能发挥以及死亡具有重要的调节作用。自噬功能失调与非小细胞肺癌的治疗耐药关系密切,因此合理调节自噬可能为非小细胞肺癌治疗提供新的治疗策略。     

自体凋亡细胞静脉回输联合雷帕霉素对恒河猴体内调节性T细胞的影响

目的观察凋亡细胞联合雷帕霉素对恒河猴体内调节性T细胞(Treg)的影响,探讨减少雷帕霉素用量,降低免疫抑制剂副作用的方法。材料及方法以CD4+FOXP3+调节性T细胞比例为观察对象,分组对比实验,4只雄性恒河猴8～10岁龄,体重7～8kg,随机分成实验组和对照组,每组2只。实验组采用低剂量雷帕霉素加凋亡细胞输注的方法,每天给予口服0.4mg雷帕霉素,同时静脉输注凋亡细胞一次;对照组每天给予同样剂量的雷帕霉素,同时静脉注射PBS。定期检测各组恒河猴外周血中CD4+Foxp3+Treg,并计算Treg占CD4+T细胞的比例。对比两组恒河猴Treg变化曲线的异同。结果单纯口服雷帕霉素的恒河猴,Treg/CD4+T比例在1只猴未见明显增加,在第38天为6.92%,另1只仅在4周后明显增加,在第38d为13.7%;而注射凋亡细胞联合雷帕霉素组的恒河猴,其Treg/CD4+T的比例在输注凋亡细胞后2～3周即有明显增加,2只猴在第38d Treg/CD4+T细胞比例升至16.67%和21.56%。结论凋亡细胞联合雷帕霉素有可能升高恒河猴体内Treg的比例。     

中性粒细胞对非小细胞肺癌自噬和凋亡的影响及机制

目的 探究中性粒细胞(PMN)共培养对非小细胞肺癌细胞增殖、凋亡和自噬活性的影响.方法 分离小鼠骨髓PMN并培养24 h,获得PMN条件培养基,并与A549细胞共培养;用CCK-8法检测细胞增殖活性,用膜联蛋白(Annexin)V/碘化丙啶(PI)双染法检测细胞凋亡水平;用免疫荧光染色法分析细胞LC3的定位和表达;用蛋...     

蛋白酶体抑制剂MG132联合顺铂诱导肺癌A549细胞凋亡的机制

目的探讨蛋白酶体抑制剂(MG132)与顺铂(DDP)联合诱导肺癌A549细胞凋亡的机制及作用。方法采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同浓度MG132、DDP对肺癌A549细胞的最适作用时间以及抑制率;通过Hochest33342染色法检测细胞形态变化;应用流式细胞术(FCW)检测MG132、DDP及两药联合作用于肺癌A549细胞的凋亡率;采用Western印迹检测药物干预前后细胞中促凋亡蛋白半胱氨酸蛋白酶(caspase)9、核转录因子(NF-κB)的表达情况。结果 MTT结果显示MG132、DDP能有效抑制细胞的增殖,呈浓度及时间依赖性;FCW结果显示MG132与DDP联合用药组作用于肺癌A549细胞凋亡率为(68.27±0.31)%,与MG132(22.13±0.36)%、DDP(25.76±0.25)%单用药组相比,细胞凋亡率明显提高(P<0.05)。Western印迹结果显示,与单用药组相比较,联合用药组凋亡相关蛋白caspase9表达明显增强,NF-κB表达显著减少。结论 MG132与DDP联合应用可明显提高细胞凋亡率,其机制可能是通过提高促凋亡蛋白caspase9的表达,并降低细胞NF-κB的表达而实现的。     

雷帕霉素对1型糖尿病小鼠免疫功能的影响及其分子机制

目的研究雷帕霉素对1型糖尿病（T1DM）小鼠的影响及其分子机制。方法40mg／kg的STZ腹腔注射C57BL／6小鼠连续5d建立T1DM模型,正常和T1DM小鼠按2mg／kg腹腔注射RAPA连续两周。监测血糖、体重、进食量和饮水量;观测胰岛炎、主要脏器的超微结构和凋亡和自噬的发生;检测脾脏Th1／Th2分群和调节性T细胞。结果RAPA对正常小鼠一般特性及主要脏器的超微结构无明显影响。但可使T1DM小鼠血糖升高、体重下降、采食和饮水量增加（P〈0．05）,并加重其胰岛炎程度;诱导其胰腺、肾脏、脾脏和胸腺细胞自噬或凋亡,并使LC3、Beclin1、Caspase-3的表达增加;减少正常和T1DM小鼠的Th1细胞,增加Th2细胞,并上调CD4^＋CD25%＋T细胞的数量。结论RAPA既可诱导免疫耐受,发挥免疫抑制作用,又可通过自噬直接破坏胰岛从而加重T1DM代谢紊乱和并发症。     

自噬在贝伐单抗诱导非小细胞肺癌凋亡中的作用

目的研究血管抑制药物贝伐单抗与自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)联用对于肺癌A549细胞增殖的抑制作用。方法四甲基偶氮唑盐(MTT)法分别描绘贝伐单抗与3-MA作用于肺癌A549细胞时的细胞生长曲线,并计算贝伐单抗对A549细胞的半数抑制浓度(Ic50)及3-MA对于A549细胞的抑制浓度Ic10;AnnexinV-FITC/PI双染色流式细胞术检测A549细胞凋亡率;吖啶橙(AO)与单丹磺酰尸胺(MDC)染色对照组、贝伐单抗组、3-MA组及联合用药组细胞后,在荧光显微镜下观察细胞自噬与凋亡状态;蛋白免疫印迹杂交(Western印迹)检测微管相关蛋白(LC)-3的表达变化〔1〕。结果流式细胞仪测得贝伐单抗组、3-MA组及联合用药组细胞凋亡率分别为(21.82±0.41)%、(3.54±0.11)%、(37.36±0.87)%;贝伐单抗组细胞分别经MDC及3-MA染色后,细胞中出现大量自噬空泡,而在加入3-MA联合作用后,自噬空泡现象被不同程度抑制;Western印迹结果显示LC-3在贝伐单抗组中的表达较对照组明显增加,在单用3-MA组中,二者表达明显减少,在联合用药组中的表达均介于贝伐单抗组及3-MA组之间。结论贝伐单抗可诱导肺癌A549细胞凋亡,同时增强细胞自噬;当与3-MA联用时,贝伐单抗的促细胞凋亡作用增加。     

选择性环氧化酶2抑制剂对肺癌A549细胞增殖与凋亡的影响

肺癌是我国最常见的恶性肿瘤,患者5年生存率仅15％。因此,新的治疗方法的探讨对肺癌防治具有重要意义。流行病学资料表明,非甾体类抗炎药物(NSAIDS)阿司     

自噬在厄洛替尼诱导的肺腺癌细胞A549凋亡中的作用

目的探讨自噬对厄洛替尼(Erlotinib,特罗凯)诱导的肺腺癌细胞A549凋亡中的影响。方法用厄洛替尼和(或)自噬抑制剂3甲级腺嘌呤(3-MA)处理人肺腺癌A549细胞系,AnnexinV-FITC/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡率;吖啶橙(AO)染色荧光显微镜观察细胞酸性自噬泡的变化;Western印迹法检测自噬相关蛋白Beclin1及凋亡相关蛋白Caspase9的表达。结果流式细胞仪检测示厄洛替尼组、3-MA组、厄洛替尼+3-MA组细胞凋亡率为(56.35±0.71)%、(9.47±0.15)%、(78.40±0.52)%。厄洛替尼组经吖啶橙染色后,细胞内酸性自噬泡明显增加,呈明亮的红色荧光,而加入3-MA联合作用后,则上述现象被抑制。Western印迹结果示对照组、厄洛替尼组、3-MA组、厄洛替尼+3-MA组Beclin1和Caspase9相对灰度值分别为0.54±0.03、0.86±0.03、0.37±0.02、0.70±0.04和0.43±0.03、0.77±0.03、0.57±0.04、0.90±0.02。结论厄洛替尼可以诱导肺腺癌细胞A549细胞系凋亡,并可激活其自噬;3-MA可能通过抑制自噬且上调Caspase9的表达增强厄洛替尼对肺腺癌细胞的杀伤作用。     

细胞自噬与肝脏疾病

自噬又称细胞的自体溶解,是指隔离膜包裹胞质蛋白和细胞器形成自噬体,然后与溶酶体融合成自噬溶酶体并在其中降解的过程。自噬现象普遍存在于大部分真核细胞中,通过对细胞内变性蛋白或受损细胞器进行降解,以维持细胞内物质循环及代谢调节的稳定,在细胞生长、分化、功能执行、自我更新、衰老及死亡中发挥着重要调控功能。     

雷帕霉素对人树突状细胞功能的影响

目的　研究雷帕霉素 (RPM)对人树突状细胞 (DC)功能的影响。方法　分离外周血单个核细胞 (PBMC) ,在含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 (GM CSF)、白介素 4 (IL 4 )以及有或无RPM的培养条件下制备DC。用流式细胞仪检测DC表面共刺激分子CD86 (B7 2 )的表达 ;混合淋巴细胞反应(MLR)检测DC对同种异体T淋巴细胞的刺激能力 ;ELISA法测定MLR上清液中的细胞因子。结果　与对照组比较 ,经RPM处理的DC表面CD86的表达明显降低 ;对T淋巴细胞刺激的能力下降 ;MLR中致炎细胞因子 (IL 1β ,IL 6 ,TNF a)浓度降低。RPM的这些作用呈浓度依赖性。 结论　雷帕霉素对人树突状细胞功能有明显的抑制作用 ,可能是其防止支架术后再狭窄的机制之一     

苦瓜药用有效成分的提取及诱导肺癌细胞凋亡的作用

目的探讨苦瓜药物有效成分的提取及诱导肺癌细胞凋亡的作用。方法提取新鲜苦瓜蛋白,配置成不同浓度梯度溶液5、10、15、20、50μg/ml(干预组),分别干预A549细胞不同时间6、12、24、48、36 h,凋零组只加培养液、对照组(0μg/ml)不干预,操作步骤与干预组均相同,四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)测定细胞抑制率,TUNEL法测定细胞凋亡率,倒置显微镜下观察细胞凋亡形态。结果干预24、36、48 h时,浓度为5~50μg/ml。不同浓度梯度细胞OD值分别与相应的对照组相比,差异均具有统计学意义(P0.05);苦瓜蛋白与细胞抑制率间存在明显剂量-反应关系(r=0.453,P0.05);选择细胞抑制率在50%以下的浓度梯度分别为0、5、10、15、20μg/ml,对A549细胞干预24 h,细胞凋亡率分别为(2.69±0.35)%、(12.30±0.28)%、(42.23±2.31)%、(31.67±1.25)%、(35.25±2.41)%,其中苦瓜蛋白在10μg/ml时细胞凋亡率最高。结论苦瓜蛋白对于肺癌细胞具有明显的抑制作用,并且促进细胞凋亡率。