野生型p53cDNA真核表达载体的构建

ｐ５３基因是癌症研究和肿瘤基因治疗中最引人注目的抑癌基因之一，据报道，大约一半左右癌症的起因是由于ｐ５３基因突变。在所有的抑癌基因中，ｐ５３基因是突变率极高的一种，它的失活会阻止细胞进入凋亡，从而使之处于持续分裂状态而增加突变及恶性转化的概率［１］。因此，研究野生型ｐ５３基因在肿瘤的基因治疗中有普遍性意义。１材料和方法１．１材料ｐＧＥＭ－Ｔ载体（Ｐｒｏｍｅｇｅ公司）；真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１（本室保存）；野生型ｐ５３ｃＤＮＡ由南京军事医学研究所朱敏生教授惠赠；限制性内切酶、ＴａｑＤＮＡ聚合酶…     

含野生型p53cDNA重组逆转录病毒的制备

目的：制备野生型p53cDNA重组体的复制缺陷型逆转录病毒。方法：设计引物PCR扩增野生型p53cDNA，用T－A克隆的方法克隆入质粒载体pGEM-T,转化JM109，提取pGEM-T/p53重组体，双酶切得到野生型p53cDNA,然后再克隆人逆转录病毒表达载体pLXSN,转化感受态大肠杆菌 JM109，筛选pL(p53cDNA)SN重组体，脂质体法转染包装细胞AM12，G－418（geneticin)筛选，收集病毒液。结果：通过PCR和重组质粒酶切筛选出重组阳性克隆，收集含pL(p53cDNA)SN重组体的逆转录病毒。结论：含pL(p53cDNA)SN重组体的复制缺陷逆转录病毒可用于转染真核细胞等进一步研究。     

野生型p53基因转染对卵巢癌细胞株端粒酶活性的影响

目的 :探讨野生型 p5 3(wt- p5 3)基因转染对卵巢癌细胞端粒酶活性的影响。方法 :利用脂质体介导 ,将含有人全长 wt- p5 3基因 c DNA的真核表达载体质粒 p CEP4 / p5 3和空载体质粒 p CEP4分别转染人卵巢浆液性乳头状囊腺癌 SKOV3细胞株 ,分别命名为 SKOV3- p CEP4 / p5 3细胞 (C组 )、SKOV3- p CEP4细胞 (B组 ) ,另设 SKOV3细胞为空白对照组 (A组 ) ,观察 3组细胞周期和端粒酶活性变化。结果 :外源性 wt- p5 3基因在 C组细胞中获表达 ,而 A、B组细胞中无 wt- p5 3基因的表达。流式细胞仪检测示 C组细胞 G0 ～ G1 期百分比 (5 7.79% )及凋亡细胞率 (13.91% )均高于 B组 (46 .0 2 %、2 .0 8% )和 A组 (43.6 2 %、0 ) ,差异有显著性 (P <0 .0 1) ,A、B、C3组细胞中端粒酶活性均呈阳性 ,但 3组细胞端粒酶活性无显著性差异 (P =0 .6 5 )。结论 :wt- P5 3基因转染可介导 SKOV3细胞 G0 ～ G1 期停滞和诱导细胞凋亡 ,但对 SKOV3细胞内端粒酶活性无影响     

p53重组腺病毒载体的构建

目的　构建 p5 3重组腺病毒载体以研究 p5 3过度表达与腺病毒感染对细胞生长的影响 .方法　将 p5 3c DNA克隆到转移载体 p Ad CMV/ p5 3重组质粒 ,用该重组质粒及p JM1 7质粒共转染 2 93细胞获得重组腺病毒 ,PCR法筛选含p5 3c DNA的重组病毒 .结果　在挑选的 5个空斑中 ,有 4个含 p5 3c DNA阳性重组腺病毒 .p5 3重组腺病毒可感染 2 93细胞并在 2 93细胞内进行有效的复制 .结论　成功构建了 p5 3重组腺病毒 ,为进一步研究 p5 3重组腺病毒的功能提供了条件     

野生型p53基因转移对心肌细胞生长的抑制作用

为了探讨野生型ｐ５３基因对心肌细胞生长的抑制作用及应用于高血压和肥厚型心肌病等疾病所致心肌肥厚的基因治疗可能性,本实验将野生型ｐ５３基因重组腺病毒转染体外培养的乳兔心肌细胞。应用生化染色方法,免疫组化法及聚合酶链反应技术,检测了野生型ｐ５３基因的转染效率及表达效果。采用ＭＴＴ方法及光镜技术进一步观察了野生型ｐ５３基因对心肌细胞生长的调节作用。结果显示,腺病毒载体能有效地将外源基因导入心肌细胞中并使     

p53基因导致心肌细胞凋亡及其机制探讨

目的 探讨野生型ｐ５３基因与心肌细胞凋亡的关系及其可能的发生机制。方法 把野生型ｐ５３基因重组腺病毒转入体外培养的心肌细胞中,采用流式细胞计数仪（ＦＣＭ）,透射电镜等实验方法检测细胞凋亡并分析其作用机制。结果 重组腺病毒能有效地将ｐ５３基因转入心肌细胞中;转入的ｐ５３基因可以导致心肌细胞体积变小、胞浆浓缩、核固缩、染色质边集,引起细胞Ｇ１期阻滞。结论 野生型ｐ５３基因可以导致心肌细胞凋亡。并能影响细胞周期,以上结果为进一步研究心肌疾病的发病机制及其治疗提供了重要实验依据。     

野生型p53基因转移对心肌细胞形态的影响

目的 :探讨腺病毒介导的野生型 p5 3基因转移对心肌细胞形态的影响及 p5 3基因用于心肌疾病基因治疗的可能性。方法 :将腺病毒介导的野生型 p5 3基因转入体外培养的乳兔心肌细胞 ,应用生化染色方法、Western blotting技术检测野生型 p5 3基因的转染效率及其表达效果 ,采用相差显微镜、透射电镜等实验方法观察心肌细胞的形态学改变。结果 :重组腺病毒载体有效地将 p5 3基因转入心肌细胞中并使其得以表达 ;转入的 p5 3基因可以导致心肌细胞收缩、体积变小、胞浆浓缩、核固缩、染色质边集等改变。结论 :野生型 p5 3基因转移可以影响心肌细胞的形态 ,并能导致细胞凋亡     

携带野生型p53基因的重组腺病毒载体的构建

应用同源重组方法成功地构建了携带野生型Ｐ５３基因的复制缺陷型重组腺病毒，通过光镜电镜、酶切、ＰＣＲ共扩增等方法证实了构建载体的正确性，并使常规的同源重组方法进一步改进，简化了载体构建的操作程序，结果准确，成功率高。本结果可用于以腺病毒为载体进行肿瘤、心血管疾病等基因治疗的研究。     

p53RFP 表达载体的构建及其对HEK293A细胞增殖的抑制作用

  目的 构建p53RFP 表达载体,观察p53RFP 表达上调对HEK293A细胞生长的影响。方法 利用DNA克隆技术,将人p53RFP基因的编码序列克隆至质粒pcDNA 4/Myc-HisA,经限制性酶切、DNA测序鉴定重组载体。质粒扩增提取,经脂质体介导法转染HEK293A细胞,实时定量RT-PCR、Western blot检测转染后p53RFP mRNA及蛋白的表达水平。采用CCK-8检测p53RFP 表达上调对HEK293A细胞增殖的影响。结果 p53RFP转染后其mRNA及蛋白表达水平均显著上调;p53RFP转染后72 h、96 h细胞增殖受到显著抑制（P<0.01)。结论 成功构建p53RFP表达载体pcDNA 4/-p53RFP,并可在HEK293A细胞有效表达,其表达可抑制HEK293A细胞增殖。     

p53RFP基因启动子荧光素酶报告基因载体的构建及鉴定

目的 构建人p53RFP基因启动子序列不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,研究启动子的转录活性.方法 PCR扩增人p53RFP基因启动子区域不同长度的目的片段,克隆到pGL3-Basic中,构建启动子区域3个不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,经双酶切和基因测序鉴定正确后,转染HEK293细胞,双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性.结果 成功构建了p53RFP启动子不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,经双荧光素酶报告基因检测分析,3个启动子片段均具有转录活性.结论 成功构建了人p53RFP基因启动子荧光素酶报告基因载体,为研究p53RFP基因的转录调控机制提供了实验基础.     

双荧光素酶报告基因系统验证hsa-miR-1291对ARHGAP29基因的调控作用

目的 验证hsa-miR-1291对ARHGAP29基因的靶向调控作用。方法 利用PCR方法,根据目的基因ARHGAP29的3'非编码区(3' untranslated region,3'UTR)序列信息设计扩增引物,以293T细胞基因组DNA为模板,扩增ARHGAP29基因的野生型3'UTR片段(ARHGAP29-WT 3'UTR)及突变型3'UTR片段(ARHGAP29-MUT 3'UTR),并将其分别克隆到双荧光素酶报告pmiR-RB-Report载体中,构建双荧光素酶基因报告载体,即野生型载体ARHGAP29-WT 3'UTR pmiR-RB-Report和突变型载体ARHGAP29-MUT 3'UTR pmiR-RB-Report。将hsa-miR-1291 mimic、阴性对照(non-target control,NC组)同野生型载体、突变型载体载体分别共转染于293T细胞中,进一步检测相对荧光值。结果 成功构建ARHGAP29-WT 3'UTR pmiR-RB-Report载体(野生型载体)、ARHGAP29- MUT 3'UTR pmiR-RB-Report载体(突变型载体)。荧光检测结果显示,野生型载体转染hsa-miR-1291 mimic后,其荧光表达较NC组明显下降(0.67±0.04 vs 1.00±0.08, P=0.014);转染hsa-miR-1291 mimic后,突变型载体的荧光表达相对于野生型载体的荧光表达有所上升(1.20±0.05 vs 0.67±0.04, P<0.001)。结论 初步证实hsa-miR-1291很可能对ARHGAP29 3'UTR上的该位点有靶向调控作用。     

Gluc-Fluc双荧光素酶质粒转染MB49细胞后荧光表达特性

目的利用生物发光成像技术对Gluc-Fluc双荧光素酶质粒转染MB49膀胱癌细胞后双荧光表达量变化特性进行研究。方法用pAAV2neo-Gluc和pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc分别转染MB49细胞,利用荧光照度计来研究双荧光素酶质粒中Gluc、Fluc的特性;利用体外活体成像系统对双荧光素酶质粒Gluc-Fluc转染MB49膀胱癌细胞后荧光表达情况的检测。结果荧光照度计检测结果显示:Gluc随着细胞数的增多或时间的延长,荧光表达量呈相应的增加。Fluc随细胞数目的增多,荧光表达量增加;但随时间的延长,荧光表达量变化不大。体外活体成像结果显示:Gluc-Fluc双荧光素酶质粒已转染入MB49膀胱癌细胞,经过G418加压筛选获得稳定表达的细胞株。结论双荧光素酶基因的构建并未改变Gluc的自身荧光表达特性。转染双荧光素酶质粒的MB49膀胱癌细胞,由于其Fluc在活体成像时的定位优势和Gluc易分泌、检测灵敏度高的定量优势,为后期动态检测肿瘤生长变化以及评价药物治疗效果提供了一个可靠的基石和平台。     

稳定表达人BACE1启动子及荧光素酶报告基因HEK293细胞株的建立

目的 对人β位点裂解酶-1(BACE1)基因核心启动子进行克隆,构建携带BACEI基因启动子的荧光素酶报告载体,筛选稳定表达细胞株并分析其转录活性.方法 提取人胚肾HEK293细胞基因组DNA,以其为模板,PCR扩增BACE1核心启动子(-691～+67)并克隆至荧光素酶报告载体pGL4.21中,构建BACE1基因启动子荧光素酶报告载体pGL4.21-BACE1,将其转染HEK293细胞(无启动子的pGL4.21载体作阴性对照),利用嘌呤霉素筛选稳定表达株后检测其转录活性.结果 成功扩增到758 bp的BACE1核心启动子,pGL4.21-BACE1载体经双酶切鉴定正确;HEK293细胞被该载体转染后经嘌呤霉素筛选得到6株稳定表达BACE1启动子的细胞株,其转录活性分别是对照组(HEK293/pGL4.21)的(134.7±22.3)、(634.0±13.9)、(437.6±6.1)、(805.5±5.5)、(492.8±59.1)、(1 021.1±46.6)倍(P=0.001).结论 成功构建了人BACE1基因启动子荧光素酶报告载体.     

ALB启动子基因报告质粒的构建及VEGF对肝前体细胞诱导分化作用的初步研究

目的:构建白蛋白(ALB)启动子调控的荧光素酶报告质粒,以方便检测ALB的表达.并用该方法初步检测血管内皮生长因子(VEGF)对肝前体细胞分化诱导的影响.方法:PCR扩增ALB的启动子及增强子片段,插入pBGLuc载体,构建pBGLuc-ALB荧光素酶报告质粒,并经经酶切、测序及荧光素酶活性检测验证.包装成逆转录病毒感染肝前体细胞株E14.5d,构建稳定细胞株E14.5-ALB-LUC.以重组腺病毒载体Ad-VEGF感染E14.5-ALB-LUC细胞株,通过荧光素酶活性检测观察其分化程度,并用RT-PCR、PAS染色验证其结果.结果:构建pBGLuc-ALB重组质粒,经酶切、测序及荧光素酶活性检测证实其正确效性.建立稳定细胞株E14.5-ALB-LUC.Ad-VEGF感染后,与对照组相比,荧光素酶的表达明显升高.RT-PCR证实肝前体细胞分化早期指标DLK,CK19降低,晚期指标ALB升高.PAS染色可见阳性细胞明显增加.结论:成功构建pBGLuc-ALB荧光素酶报告质粒,为进一步研究肝前体细胞分化打下基础,并在此基础上发现VEGF能诱导肝前体细胞分化为类肝细胞.     

p53截短突变群的建立及其在HeLa细胞的表达

目的:建立一组p53截短突变群,分析缺失突变对P53蛋白质功能的影响.方法:以野生型p53基因为模板,采用PCR定点突变技术,建立一组P53蛋白质N端和(或)C端缺失的截短突变群,构建真核表达载体,基因转移HeLa细胞,分析转移基因表达及p53下游相关基因表达.结果:构建的p53截短突变群在HeLa细胞中表达,并对p53下游相关基因的表达模式产生一定的影响.结论:p53截短突变群可以作为一个研究p53与下游基因相互作用的良好工具,对于研究p53的功能调节机制有重要的价值.     

利用荧光素酶报告基因在体观察移植的人胚胎干细胞的动向

目的利用慢病毒载体携带荧光素酶报告基因并转导人胚胎干细胞,以实现在体观察移植细胞的增殖情况。方法酶切pGL3base质粒获得荧光素酶基因序列,酶切LTBR-GIP获得载体骨架,经过酶切产物热失活、平末端处理、CIP处理、胶纯化和连接,所构建慢病毒载体命名为ULIP,包括UBC启动子和IRES连接,能同时表达荧光素酶基因和Puromycin抗性基因。以ULIP转导人胚胎干细胞H9,并以Puromycin筛选稳定转导的细胞。随后移植于BALB／c小鼠和RAG^-/- γC^-/-小鼠,在XenogenIVIS（r）50成像系统进行荧光信号检测。结果稳定转导ULIP或LTBR—GIP的H9移植到BALB／c小鼠,ULIP组3d后荧光信号明显减弱,5d后基本上不能检出。而移植到RAG^-/-γC^-/-小鼠后,ULIP组的荧光信号在第3天稍有下降,随后荧光信号逐渐增强。LTBR-GIP-H9在移植BALB／c小鼠和RAG^-/-γC^-/-小鼠后均未能检测到荧光信号。结论荧光素酶报告基因可以用于观察移植细胞在体内的动向,实现实时观察移植细胞的存活情况。     

虫荧光色素酶报告基因重组腺病毒表达载体的构建与鉴定

目的:构建表达虫荧光色素酶报告基因重组腺病毒载体,为腺病毒中和抗体流行水平的定量检测奠定基础?方法:采用腺病毒表达系统(ViraPower Adenoviral Expression System)构建重组腺病毒表达载体?首先利用PCR的方法扩增虫荧光色素酶基因使其具备特定的CACC接头,以连接?转化?提取质粒等方法克隆入载体pENTR/D-TOPO以获得入门克隆,经PCR及测序鉴定正确后,用重组酶(LR ClonaseTMⅡ Enzyme Mix)进行入门克隆与表达载体(pAd-CMV/V5-DEST)间的重组反应,以获得表达克隆rAd-Luci?表达克隆鉴定后,用限制性内切酶PacⅠ线性化后转染HEK293A包装细胞得到重组腺病毒?经过扩增后,用极限稀释法检测病毒滴度,用Western blot法检测rAd-Luci载体是否能正确表达虫荧光色素酶蛋白,并检测此酶蛋白的功能活性?结果:用PCR的方法扩增到具有CACC接头的虫荧光色素酶基因,其重组入门和腺病毒表达克隆经PCR和测序鉴定构建正确,重组表达克隆转染HEK293A细胞并扩增后获得的病毒滴度为1.8×1011 pfu/ml,此病毒能正确表达虫荧光色素酶蛋白,并且具有较强的功能活性?结论:成功构建了虫荧光色素酶报告基因重组腺病毒载体,为此重组载体用于腺病毒中和抗体的定量检测奠定基础?     

Id1启动子的荧光素酶报告基因载体的构建及其在肝癌HepG2细胞中的活性检测

目的:扩增Id1启动子基因,构建Id1启动子的报告基因载体. 方法:通过PCR及双酶切方法,从HepG2细胞基因组DNA中获得Id1基因编码序列上游包含不同长度碱基的两段Id1启动子序列;分别克隆到报告基因pGL3-enhancer载体上,构建包含两段不同长度Id1启动子的报告基因载体;用脂质体转染法将两报告基因载体分别转染至肝癌HepG2细胞系;采用双荧光素酶报告基因系统评估Id1启动子活性. 结果:经PCR方法扩增出大小分别为1096 bp和266 bp的两段不同长度的Id1启动子片段,序列测定其编码序列及读框正确,酶切鉴定亚克隆序列正确. 瞬时转染HepG2后经报告基因检测,两段启动子均具有转录活性. 结论:成功构建了Id1启动子的报告基因载体,为进一步研究Id1启动子和肝癌的关系奠定了实验基础.