运用TaqMan探针实时荧光PCR技术检测AKAPIO基因2073A／G单核苷酸多态性

目的建立一套以TaqMan探针实时荧光PCR技术为基础的单核苷酸多态性（SNP）检测平台,并用于AKAPIO基因2073A／GSNP的检测。方法设计一对TaqMan探针加入到PCR反应系统中,并设立阴阳对照,对AKAPIO基因2073A／GSNP进行分型。同时验证部分样本PCR产物的直接测序结果。结果运用TaqMan探针实时荧光PCR技术对AKAPIO基因2073A／GSNP检测结果准确,与PCR产物的直接测序结果完全一致。AKAPIO基因2073A／G多态性分布与性别年龄无关（P〉0．05）。非条件logistic回归分析提示,AKAP10基因2073A／G突变型（AG＋GG）与野生型AA相比增加结直肠癌的发生风险（OR=1．52,95％CI：1．07～2．15。P=0．019）。结论通过合理设计TaqMan探针,设立阴阳性对照,应用TaqMan探针实时荧光PCR技术成功建立起一套SNP检测平台。AKAP10基因2073A／G多态性与结直肠癌发病存在显著相关性。     

无标记探针技术检测IL-6基因启动子单核苷酸多态性

目的：探讨无标记探针技术检测IL-6基因启动子单核苷酸多态性（SNP）的实用性．方法：采用新型荧光染料EvaGreen和无标记探针技术对IL-6基因启动子SNP进行基因分型．以其-597G〉A位点为例设计PCR扩增引物和无标记探针,按PCR扩增效率和产物特异性进行Mg^2＋浓度、不对称PCR引物比例以及模板浓度等条件的优化．并用此优化体系基因分型100例临床标本,杂合型与突变型以测序验证．结果：结果显示EvaGreen荧光PCR检测体系是最适Mg^2＋浓度为2．5mmol／L,不对称PCR引物比例为0．1／0．5umol／L,模板浓度为10ng／10uL的两步法不对称PCR．该体系对100例样本进行IL-6基因～597G〉A位点基因分型,发现7例杂合型和1例突变型,经测序与检测结果一致．结论：无标记探针技术检测基因SNP是一种值得推广的简便易行、低成本、常规化的基因分型方法．     

基于AllgloTM探针检测IL-1单核苷酸多态性检测方法的建立

目的：探讨AllgloTM探针检测IL-1单核苷酸多态性的实用性。方法：采用AllgloTM 探针实时荧光PCR对IL-1β基因SNP进行基因分型。设计其3954C＆gt;T位点AllgloTM探针序列和PCR扩增引物,按照PCR产物特异性和扩增效率,对退火温度、引物浓度等条件进行优化。结果：结果显示AllgloTM探针实时荧光PCR检测体系最适引物浓度为0.4μM,退化温度为58.9℃两步法PCR。在同一条件体系下,检测100例健康体检者IL-1β基因3954C＆gt;T位点,并进行基因分型,测序验证其分型结果。结论：AllgloTM探针实时荧光PCR检测IL-1β基因SNP是一种值得推广的高通量、低成本、常规化的基因分型方法。     

ACACB基因rs2268388多态性检测的实验条件

［摘要］目的　建立一种快速、准确、特异的定量检测ACACB基因rs2268388多态性的方法．方法　针对ACACB基因序列设计引物和Taqman探针,探索实时荧光定量PCR技术检测ACACB基因rs2268388多态性的最佳条件,设立不同浓度,并检测其灵敏度和特异性．结果　 PCR反应预变性时间为10 min,退火、延伸时间为1 min时扩增产物效果理想． Taqman实时荧光定量PCR探针及引物浓度 0.5 μL （ 0.2 μM）,TaqMan Genotyping Master Mix 5 μL ,dH2O 2.5 μL总体系为10 μL时扩增产物效果理想并节约了实验费用,检测特异性良好．结论　优化Taqman探针法的实验条件能够灵敏、特异、稳定地对ACACB基因rs2268388多态性进行定量检测,并有效节约了实验成本.     

HMGB1基因SNP位点实时荧光PCR检测方法的建立

目的建立基于Taq Man探针实时荧光PCR技术的高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)检测方法。方法收集2014年4月在深圳口岸医院体检的健康人群样本20份,选择HMGB1基因上的2个SNP位点设计常规PCR和实时荧光PCR扩增引物和Taq Man探针,采用基因测序和实时荧光PCR方法对样本进行SNP分型。结果实时荧光PCR方法SNP分型结果显示,在20份样本中的HMGB1基因rs1412125位点检测到TT基因型11例,CC基因型1例,TC基因型8例;HMGB1基因rs3742305位点检测到GG基因型15例,GC基因型5例,未发现CC基因型。这一结果与基因测序方法结论完全一致。结论基于Taq Man探针技术的实时荧光PCR方法进行HMGB1基因SNP分型简单、快速、高效,可用于人群大规模样本的SNP筛查,具有广泛应用的价值。     

分子信标实时PCR检测瘢痕相关p53基因SNP方法的建立

目的建立分子信标实时PCR检测病理性瘢痕相关p53基因第72密码子单核苷酸多态性的新方法。方法采集瘢痕疙瘩患者外周血28例,提取DNA并用分子信标PCR检测p53基因多态性。设计一对p53基因第72密码子单核苷酸多态性荧光分子信标探针,荧光定量PCR检测该位点单核苷酸(SNP),并与反向斑点杂交法,DNA直接测序等方法比较。结果定量荧光PCR荧光分子信标检测的结果与测序结果吻合率达到100%,高于反向斑点杂交法且简便快捷。结论分子信标实时PCR检测技术适合临床p53基因第72密码子单核苷酸多态性快速诊断。     

结直肠癌PINCH基因单核苷酸多态性的小样本检测

目的 筛选结直肠癌患者PINCH基因单核苷酸多态性(SNP)位点,初步探讨PINCH基因SNP与结直肠癌相关性,为后续结直肠癌风险预测提供参考.方法 抽提36例结直肠癌患者和30例非结直肠癌人群外周血单个核细胞DNA;同时对术中采集的配对的36例正常黏膜组织匀浆后提取DNA.对PINCH基因外显子区进行PCR扩增并对产物进行测序分析.结果 PINCH基因外显子区域内共筛查出10个SNP,其中rs74632558的SNP基因型在结直肠癌和非结直肠癌人群之间有差异,但无统计学意义,同时发现了3个未登陆的SNP.结论 PINCH基因外显子区rs74632558 SNP可能与结直肠癌发生有一定关系.     

二氢嘧啶脱氢酶基因单核苷酸多态性与结直肠癌患者5-FU化疗毒副作用的关系

目的:探讨二氢嘧啶脱氢酶基因(DPYD)单核苷酸多态性(SNP)与5—氟尿嘧啶(5-FU)化疗毒性反应的相关性,为结直肠癌的个体化治疗提供依据.方法:对60份结直肠癌患者的EDTA抗凝外周血提取基因组DNA后进行实时定量PCR,测定DPYD的14G1A、G2194A、T85C、G1156T和T464A等位点的SNP,并...     

实时荧光PCR探针法和DNA测序法应用于CYP2C9和VKORC1基因检测的对比研究

目的:比较实时荧光PCR探针法和DNA测序法检测细胞色素氧化酶P450(CYP2C9)和维生素K环氧化物还原酶复合体1(VKORC1)基因多态性的一致性,建立适用于临床推广的华法林基因多态性检测的方法。方法:本研究随机收集清远市人民医院20例就诊患者的全血标本,应用实时荧光PCR探针法和DNA测序法检测其CYP2C9和VKORC1基因的多态性,结果运用Excel软件统计并进行比较分析。结果:两种方法对CYP2C9和VKORC1基因多态性的检测结果一致,且实时荧光PCR探针法比DNA测序法更简易、经济、快捷。结论:与DNA测序法相比,应用实时荧光PCR探针法检测CYP2C9和VKORC1基因的突变具有较高的临床应用价值,比较适用于临床检测。     

白细胞介素-7基因中1047A/G和2157A/G多态性与HCV感染易感性的研究

目的 探究白细胞介素-7基因中1047A/G和2157A/G多态性与HCV感染易感性的关系.方法 应用Taqman SNP探针和DNA测序技术分别对112例健康对照组和235例丙型肝炎患者的白细胞介素-7基因的1047A/G和2157A/G进行基因型检测.结果 HCV患病组和健康对照组白细胞介素-7基因中1047A/G和2157A/G多态性具有显著性差异;结论白细胞介素-7基因的1047和2157位点多态性与慢性HCV感染存在相关性.     

CAR菌TaqMan MGB探针法实时荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用

目的建立特异、敏感、快速检测CAR菌的TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法。方法针对CAR菌16S rRNA基因序列设计特异性引物和探针,建立MGB探针荧光定量PCR方法,验证方法的特异性、敏感性和稳定性。对2008～2012年期间采集的1 344份临床标本中的CAR菌进行检测,同时进行普通PCR检测作为对照。结果 CAR菌TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有高度特异性,与肺炎支原体、侵肺巴斯德菌、支气管鲍特杆菌、肺炎克雷伯杆菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌间无交叉反应,检测灵敏度达2.7拷贝。标准曲线显示各浓度范围内具有良好线性关系,相关系数为0.999,斜率为-3.22,TaqMan MGB探针荧光定量PCR效率为104.432%。对1 344份标本进行检测,结果 TaqMan MGB探针荧光定量PCR检出510份CAR菌阳性样本。TaqMan MGB探针荧光定量PCR能够直接从标本中检出CAR菌DNA,检测时间仅为40 min。结论 TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有可靠、特异、敏感的特点,适用于CAR菌的快速检测。     

Development of Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction for the Detection of Vibrio vulnificus Based on Hemolysin （vvhA） Coding System

Objective To establish a TaqMan real-time fluorescent quantitative PCR to detect Vibrio vulnificus based on the hemolysin gene （vvhA） coding cytolysin. Methods Primers and probes in the conserved region of the vvhA gene sequence were designed for the TaqMan real-time PCR to detect 100 bp amplicon from V. vulnificus DNA. Recombinant plasmid pMD19-vvhA100 was constructed and used as a positive control during the detection. Minimal amplification cycles （Ct value） and fluorescence intensity enhancement （ARn value） were used as observing indexes to optimize the reaction conditions of TaqMan real-time PCR. The TaqMan assay for the detection of Vbirio vulnificus was evaluated in pure culture, mice tissue which artificially contaminated Vibrio vulnificus and clinical samples. Results The established TaqMan real-time PCR showed positive results only for Vibrio vulnificus DNA and pMD19-vvhA100. The standard curve was plotted and the minimum level of the vvhA target from the recombinant plasmid DNA was 103 copies with a Ct value of 37.94±0.19, as the equivalent of 0.01 ng purified genomic DNA of Vibrio vulnificus. The results detected by TaqMan PCR were positive for the 16 clinical samples and all the specimens of peripheral blood and subcutaneous tissue of mice which were infected with Vibrio vulnificus. Conclusion TaqMan real-time PCR is a rapid, effective, and quantitative tool to detect Vibro vulnificus, and can be used in clinical laboratory diagnosis of septicemia and wound infection caused by Vibrio vulnificus.     

鸭疱疹病毒1型实时荧光定量PCR方法的建立

目的建立检测鸭疱疹病毒1型(鸭瘟病毒)的实时荧光定量PCR方法,为快速诊断、致病机理研究及抗病毒药物筛选等奠定基础。方法根据病毒DNA聚合酶基因的序列,设计引物和探针,采用TaqMan探针技术进行实时荧光定量PCR,用含有125bp扩增产物的pMD18-T载体质粒为阳性对照,构建标准曲线,对该方法的特异性、可重复性、敏感性进行评价,同时与传统PCR方法进行比较研究。结果标准曲线表明在2.3×105~2.3×10拷贝数之间有很好的线性关系(r=0.999);实时荧光定量PCR最少可检测到23个阳性质粒,说明有很好的敏感性;试验内及试验间变异系数分别为1.22~6.69以及2.09~8.84,说明有较好的重复性;对非鸭瘟病毒DNA无扩增,说明有很好的特异性;在对病毒DNA的检测方面,比传统PCR的敏感性高出104倍。结论成功建立了针对鸭瘟病毒的特异、敏感、重复性强且可准确定量的实时荧光定量PCR方法。     

华北地区CYP1A2基因常见SNP位点的分布

目的 建立CYP1A2基因-3860G >A、-3113G >A、-2467delT、-739T >G、-163C >A、2321G >C、5347C >T等7个SNP位点的检测方法,探讨7个SNP位点在华北地区人群中的分布。方法 选取健康受试者,提取全血样本DNA,以Primer Premier 5软件自设计引物及探针,采用扩增阻滞突变系统（ARMS）结合TaqMan探针技术（ARMS-TaqMan法）建立CYP1A2基因7个SNP位点基因分型方法。结果 -3860G >A、-3113G >A、-2467delT、-739T >G、-163C >A、2321G >C、5347C >T7个SNP位点的突变等位基因频率分别为0.292、0.078、0.524、0.078、0.657、0.148、0.127。结论 成功建立7个SNP位点的ARMS-TaqMan基因分型方法,该方法具有准确、操作简单、高通量等优势。     

检测痕量单纯疱疹病毒Ⅱ型荧光定量PCR方法的建立

目的 建立一种高敏感度的检测痕量单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)DNA的实时荧光定量PCR方法,为针对HSV-2潜伏感染的治疗性疫苗和抗病毒药物疗效提供一个评价方法。方法 依据HSV-2糖蛋白D(gD)基因序列,使用序列比对软件,选取其保守区序列设计引物及TaqMan探针并进行筛选;以gD基因重组质粒pcDNA3-HSV-2 gD作为标准模板,对该检测方法的反应条件进行优化,提高其检测特异性、敏感度和重现性。结果 该检测方法特异性好,检测的最低拷贝数可达到2个拷贝,线性范围为2×10⁰~2×10⁸拷贝/反应,是普通PCR敏感度的10³倍。该检测方法组间和组内变异系数均低于5%,说明该检测方法具有良好稳定性。结论 本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法用于检测痕量HSV-2 DNA具有特异、敏感、定量和重现性好的优点。     

Taqman PCR检测人博卡病毒的阳性率

目的：建立核酸特异、快速、敏感的Taqman探针实时定量PCR检测方法筛选疑似人博卡病毒（HBoV）感染者鼻咽拭子临床样本中的阳性样本。方法：比对编码HBoV—sh9的基因序列,选取保守区序列设计引物和探针,建立Taqman PCR检测人博卡病毒的阳性率的方法,进行特异性实验,检测214例临床样本。结果：所建立的Taqman PCR方法可以用于检测人博卡病毒的阳性率,对所收集得到的214例急性上呼吸道感染者的咽拭子标本进行检测,结果显示,荧光定量PCR检测出8例阳性,其阳性率为3．74％。结论：建立了HBoV TaqMan探针实时定量PCR检测方法,可以快速灵敏的检测出阳性人博卡病毒,为临床治疗提供快速可靠的诊断依据。     

xCT基因rs13120371位点单核苷酸多态性与肺结核易感性的相关性

目的 通过大样本病例与对照研究明确xCT基因功能性SNP与结核病易感性的相关性,明确其调控结核病发生发展的分子机制。方法 从健康对照和结核患者的全血样本中提取基因组DNA,采用TaqMan探针技术对xCT基因rs13120371位点进行基因分型并对基因频率进行关联性分析,结核菌特异性抗原IFN-γ斑点形成细胞的数量和放射影像学分数反应不同基因型与临床指标的相关性,Real-time PCR方法检测健康对照和结核患者外周血单个核细胞中xCT基因及其相关的CXCL1、CXCL2、IL1B基因的表达水平。结果 等位基因位点基因频率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(χ²=0.678,P>0.05),选择的样本具有群体代表性。rs13120371位点的单核苷酸多态性与结核病的易感性相关,其中结核患者组等位基因A的基因频率为70.2%,等位基因G的基因频率为29.8%;健康对照组等位基因A的基因频率为66.8%,等位基因G的基因频率为33.2%,两组之间的等率基因频率差异具有统计学意义(P=0.02,OR=0.86)。AA基因型患者的结核菌特异性刺激分泌的IFN-r斑点形成细胞数量及炎症反应指标明显高于基因型GG的患者,基因型AA的细胞xCT基因的表达水平也明显上调。结论 xCT基因rs13120371位点的单核苷酸多态性与汉族人群结核感染的易感性相关,并且rs13120371位点是功能性SNP,等位基因A可能增加结核菌感染的风险。     

孕妇血清中DAZ基因含量在21三体产前筛查中的应用

目的：探讨检测孕妇血清中胎儿DNA含量在临床产前诊断21三体综合征的可行性.方法：采用70例孕早期（8～12wk）的妇女作为研究对象,其中10例为孕21三体男胎的妇女,30例为孕正常男胎的妇女,30例为孕正常女胎的妇女,提取其外周血血清中游离DNA,应用TaqMAN探针实时定量PCR技术检测Y染色体上无精症基因DAZ和代表母体及胎儿总游离DNA的β-actin基因的含量.结果：定量PCR检出孕21三体组血清中的胎儿游离DNA含量是正常男胎组的2.2倍.孕正常女胎组血清中未检测到DAZ基因.结论：定量PCR技术检测胎儿游离DNA可以作为产前筛查男胎21三体的重要指标.     

锁核酸结合分子信标技术检测乙型肝炎病毒DNA G1896A点突变研究

目的研究和评估乙型肝炎病毒(HBV)DNA G1896A点突变的实时荧光PCR检测方法。方法收集经测序验证HBV DNA G1896A未突变的野生型样本150例和已发生突变的突变型样本58例,在突变区域设计分子信标探针,点突变处进行锁核酸处理,利用荧光PCR方法检测HBV前C区G1896A点突变;再从临床标本中随机抽取18例、8例和19例荧光PCR结果分别显示为G1896A突变的标本、杂合的标本以及野生型的标本的PCR产物进行序列测定。结果突变型质粒和野生型质粒的检测灵敏度均可以达到100copies/ml;突变型探针检测高浓度的野生型质粒时无检测信号,野生型探针检测高浓度突变型质粒时无检测信号;突变型模板在总杂合模板中的比例达到5%时则都可以将突变型检测出来;序列测定的8例G1896A突变标本、6例杂合标本和19例野生型标本的PCR产物结果和荧光PCR检测结果完全吻合。结论实时荧光PCR检测方法可以快速、简便、准确地检测HBVDNAG1896A点突变,是检测点突变的重要方法,具有重要的临床应用价值。