白细胞介素-2基因转导对卵巢癌细胞SKOV3形态及增殖的影响

OBJECTIVE: To study the effect of interleukin-2 (IL-2) gene transfer on the proliferation and morphology of ovarian cancer cell line SKOV3. METHOD: IL-2 gene was introduced into ovarian cancer cell line SKOV3. The morphologic changes, mitosis, proliferation curve, 3H-uptaking and cell cycle were studied. RESULTS: IL-2 cDNA, 490 bp, was transduced. IL-2 gene expression was detected. IL-2 activity was 30-318 U/10(6) cells/24hr. IL-2 gene modified cell is squamas like with smaller nucleus/cytoplasm ratio, larger cell area and more homogeneous. The ultrastructural study showed that the cytoplasma of IL-2 gene modified cells is markedly vacuolized and the chromatin is condensed. There was less mitosis found in SKOV3/IL-2 cells. SKOV3/IL-2 cell proliferate more slowly, the doubling time prolonged from 38.40 hr to 65.36 hr, 3H-uptaking decreased 52.3% of the parent cell. The cell cycle study showed that SKOV3/IL-2 cell was blocked to phase G1/G0. CONCLUSIONS: The retrovirous vector can transduce Il-2 gene into ovarian cancer cell line SKOV3 effectly. IL-2 gene transfer can induce morphologic changes of SKOV3 cells, which may indicate the biologic behavior changes of the targets. IL-2 gene transfer can induce the proliferation inhibition of SKOV3 cells.     

CO_2对人卵巢癌细胞SKOV3转移因子表达的影响

目的:探讨二氧化碳(CO_2)对卵巢恶性肿瘤细胞转移能力的影响。方法:体外培养人卵巢浆液性乳头状腺癌SKOV3细胞株,分为CO_2组、N_2组和对照组,分别在CO_2及N_2处理后2h,置于常规条件下培养12、24、48h通过RT-PCR和Western Blot检测不同时相血管内皮生长因子C(VEGF-C)和基质金属蛋白酶9(MMP9)的表达。结果:CO_2处理后,SKOV3细胞VEGF-C和MMP9的mRNA和蛋白质表达显著增加(P＜0．05);N_2处理后,SKOV3细胞VEGF-C和MMP9的mRNA和蛋白质表达较对照组增加(P＜0．05)。结论:CO_2促进了SKOV3 VEGF-C和MMP9的表达,对SKOV3的转移能力有增强作用。     

丹参酮ⅡA诱导人卵巢癌SKOV3细胞凋亡及机制的研究

目的:观察中药丹参有效提取成分之一丹参酮ⅡA(Tan ⅡA)对人卵巢癌细胞株SKOV3的增殖和凋亡的诱导作用,及对基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响,探讨其可能的抗肿瘤作用机制.方法:体外培养卵巢癌SKOV3细胞,随机分组,实验组给予不同浓度Tan ⅡA处理细胞,倒置显微镜及四甲基...     

丹参酮ⅡA诱导人卵巢癌SKOV3细胞凋亡及机制的研究

目的：观察中药丹参有效提取成分之一丹参酮ⅡA（TanⅡA）对人卵巢癌细胞株SKOV3的增殖和凋亡的诱导作用,及对基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响,探讨其可能的抗肿瘤作用机制。方法：体外培养卵巢癌SKOV3细胞,随机分组,实验组给予不同浓度TanⅡA处理细胞,倒置显微镜及四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法观察实验组与对照组细胞增殖抑制情况;流式细胞术检测凋亡率及细胞周期变化;免疫荧光细胞化学法检测细胞MMP-2、VEGF蛋白表达改变;实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测MMP-2、VEGFmRNA表达水平。结果：TanⅡA对人卵巢癌SKOV3细胞的增殖具有抑制作用,呈时间-剂量依赖性;实验组较对照组G0/G1期细胞数量增多,而S期细胞数量减少;MMP-2、VEGF蛋白表达及基因表达明显下调,与对照组相比差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：TanⅡA对卵巢癌SKOV3细胞有明显的增殖抑制及诱导凋亡作用;TanⅡA可下调细胞MMP-2、VEGF的表达,这可能是其抗肿瘤作用机制之一。     

血管内皮生长因子在卵巢癌细胞浸润转移中的作用

目的 :探讨血管内皮生长因子 (VEGF)在卵巢癌浸润转移中的作用。方法 :阳离子脂质体介导VEGF165质粒转染 2株卵巢癌细胞CaOV 3、COC1,并经逆转录聚合酶链式反应 (RT PCR)、Western免疫印迹检测转染VEGF165质粒前后癌细胞VEGFmRNA及其蛋白表达水平 ;用Boyden小室体外侵袭实验比较VEGF165质粒转染前后以及单克隆抗体作用后 2株癌细胞通过人工重组基底膜的能力强弱变化。结果 :VEGF165质粒转染后 ,2株细胞mRNA和蛋白表达水平均较转染前明显增强 (P <0 .0 5 )。VEGF165质粒转染的癌细胞CaOV 3、COC1穿过人工重组基底膜的相对百分率分别为 4 2 .5± 4 .1、2 6 .8± 2 .4 ,明显高于对照组穿膜细胞相对百分率 (2 4 .7± 1.9、8.6± 1.1) (P <0 .0 5 ) ;而在VEGF单克隆抗体存在时 ,2株癌细胞穿膜细胞相对百分率 (10 .2± 0 .7、5 .4± 0 .3)较处理前均有不同程度的下降 (P <0 .0 5 )。结论 :VEGF参与了卵巢癌转移的侵袭、浸润阶段 ,应用VEGF单克隆抗体可针对性地抑制VEGF介导的卵巢癌侵袭、浸润。     

IL-2基因转移对卵巢癌细胞系SKOV3粘附性的影响

目的：研究ＩＬ－２基因转移对卵巢癌ＳＫＯＶ３细胞系粘附性的影响。方法：细胞对塑料基质、细胞基底膜成分的粘附实验,流式细胞术测定ＣＤ４４Ｈ的表达。结果：ＥＤＴＡ介导的细胞分离实验表明,ＳＫＯＶ３／ＩＬ－２细胞对塑料基质的粘附能力明显下降（Ｐ＜０．０１）;对基质及基底膜成分的粘附实验表明,ＳＫＯＶ３／ＩＬ－２细胞对Ⅳ型胶原和ｍａｔｒｉｇｅｌ的粘附能力下降,但对ＬＮ、ＦＮ的粘附能力无明显改变;粘附分子ＣＤ４４Ｈ的表达：ＳＫＯＶ３、ＳＫＯＶ３／Ｎｅｏ、ＳＫＯＶ３／ＩＬ－２组细胞粘附分子ＣＤ４４Ｈ阳性细胞百分率分别为７６．２％、６６．７％和３７．８％,ＳＫＯＶ３／ＩＬ－２组明显降低（Ｐ＜０．００１）。结论：ＩＬ－２基因修饰可使卵巢癌细胞系ＳＫＯＶ３粘附能力下降。     

缺氧对滋养细胞sFlt-1及VEGF基因及蛋白表达的影响

目的:探讨缺氧对滋养细胞可溶性血管内皮生长因子受体1(soluble fims-like tyrosine kinase receptor-1,sFlt-1)及血管内皮生长因子(vascular epithelial growth factor,VEGF)表达的影响。方法:CoCl2诱导人早孕绒毛滋养细胞系TEV-1化学缺氧,分别于0h、24h、48h、72h、96h、120h用Real-time RT-PCR法检测滋养细胞中sFlt-1及VEGF mRNA表达,ELISA法检测细胞培养上清液中sFlt-1及VEGF蛋白表达。结果:滋养细胞缺氧72h后,胞质内可见明显空泡。滋养细胞sFlt-1mRNA及蛋白表达随缺氧时间的延长逐渐升高,且与缺氧72h、96h、120h间差异有显著性(P<0.05)。而滋养细胞VEGF mRNA及蛋白表达随缺氧时间的延长呈现出先上升后下降的趋势,并于缺氧48h升高达到峰值(P<0.05)。结论:不同的缺氧时间对滋养细胞VEGF及sFlt-1表达具有重要的调控作用。慢性缺氧可能导致滋养细胞sFlt-1及VEGF表达平衡失调,从而参与子痫前期的发生、发展。     

IL-2基因转染的人卵巢癌细胞对人外周血淋巴细胞杀瘤功能的影响

目的研究白介素-2(interleukin-2,IL-2)基因转染的人卵巢癌细胞对人外周血淋巴细胞(peripheral blood iymphocytes,PBL)杀瘤活性的影响.方法采用脂质体携带IL-2基因转染人卵巢癌细胞系3AO细胞,与正常人PBL混合培养,利用MTT法测定混合培养后PBL对已转染IL-2基因的3AO细胞抑制率.结果基因转染后3AO细胞生长良好,光镜形态下未观察到凋亡改变;转染后的3AO细胞转录并产生IL-2mRNA;PBL对转基因3AO细胞的抑制率明显高于无基因转染的3AO细胞的抑制率(P＜0.01).结论IL-2基因修饰的卵巢癌细胞能够改变淋巴细胞的功能而发挥其抗肿瘤作用.     

肌钙蛋白的克隆表达及对卵巢癌SKOV3裸鼠移植瘤的抑制作用

目的:研究肌钙蛋白（Troponin,TnI）对卵巢癌的治疗作用。方法:将TnI构建于原核表达载体PTrc99A并转化到大肠杆菌JM109中。细胞在LB培养基中培养到对数生长期后,加IPTG至终浓度为5mmol/L诱导。离心收集菌体,超声破菌。包涵体纯化并复性后在体内、体外抑制血管生成,并用于治疗荷有卵巢癌SKOV3的裸鼠,肿瘤体积每周测2次。结果:TnI能在体内和体外抑制血管生成。TnI治疗组肿瘤生长明显受到抑制,生存率升高。结论:TnI可抑制荷瘤小鼠的卵巢癌生长,延长其生存率。     

胰岛素样生长因子-Ⅱ对卵巢癌细胞SKOV3中MMP-9表达的调节作用

目的探讨胰岛素样生长因子-Ⅱ(IGF-Ⅱ)对卵巢癌细胞SKOV3的基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)表达的影响.方法细胞(1.5×105/ml)培养48h后,加入不同浓度的IGF-Ⅱ,再培养18h.用RT-PCR法测定MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA水平,用明胶酶谱法半定量测定MMP-9蛋白水平的变化.结果IGF-Ⅱ可刺激MMP-9蛋白的分泌.随着IGF-Ⅱ浓度增加,诱导作用增强;浓度较高时,MMP-9的分泌量轻度下降.但IGF-Ⅱ不影响MMP-9和TIMP-1的基因表达水平.结论IGF-Ⅱ可刺激卵巢癌细胞SKOV3中MMP-9的分泌,在卵巢癌的侵袭转移方面可能起重要作用.     

IL-2基因转导对卵巢癌细胞化疗药物敏感性的影响

目的:探讨IL-2基因转导能否改变卵巢癌细胞对化疗药物的敏感性。方法:用MTT法测定导入人IL-2基因的卵巢癌细胞对化学治疗药物顺铂、阿霉素、泰素及足叶乙甙治疗的敏感性及IC_50,以导入新霉素基因的卵巢癌细胞系及野生型卵巢癌细胞系为对照。结果:IL-2基因转移使SKOV3细胞对上述化疗药物治疗的敏感性有所提高,但仅对VP-16治疗敏感性的提高差异有显著性（P<0.05）。结论:IL-2基因导入SKOV3细胞没有降低其对实验药物治疗的敏感性。     

白细胞介素12转染树突状细胞后与新建卵巢上皮性癌细胞融合的免疫原性研究

目的研究白细胞介素（IL）12转染入树突状细胞（DC）后,与新建卵巢上皮性癌细胞融合形成融合细胞,分析融合细胞的体外免疫杀伤效应。方法以新鲜卵巢上皮性癌组织建立卵巢上皮性癌细胞系,并进行鉴定。体外诱导产生人脐血DC。将IL-12与pcDNA3．1（＋）质粒连接后,分别通过脂质体法和电穿孔法将IL-12-pcDNA3．1（＋）质粒转染DC,再使用聚乙二酸法将新建卵巢上皮性癌细胞与转染IL-12的DC融合,用四甲基偶氮唑蓝法检测融合细胞的体外免疫杀伤效应。结果（1）形态学观察和免疫组化法检测结果均证实,新建卵巢上皮性癌细胞系为原代卵巢上皮性癌细胞。（2）人脐血培养7-10d,贴壁细胞出现大量毛刺状突起;免疫荧光染色显示,脐血DC主要组织相容性复合物Ⅱ类分子人白细胞抗原（HLA）-DR的阳性表达率为99％,共刺激分子B7-2的阳性表达率为50％。（3）RT—PCR技术检测结果证实IL—12转染DC成功。将转染IL—12的DC与新建卵巢上皮性癌细胞融合,RT—PCR技术和免疫荧光染色分析结果均证实融合细胞形成。（4）将转染IL—12的DC和新建卵巢上皮性癌的融合细胞、DC和新建卵巢上皮性癌的融合细胞分别与患者的外周血单个核细胞共同培养,激活T淋巴细胞,结果显示,两种活化后的T淋巴细胞均能杀伤新建卵巢上皮性癌细胞,且前者作用更强。结论转染IL—12后的DC与新建卵巢上皮性癌细胞融合后形成的融合细胞能激活T淋巴细胞,且其体外免疫杀伤效应更强。     

IL-2基因转移对卵巢癌细胞系SKOV3致瘤性的影响

目的：探讨ＩＬ－２基因转移对卵巢癌细胞系ＳＫＯＶ３致瘤性的影响。方法：通过贴壁集落形成检查、软琼脂集落形成检查和裸鼠皮下成瘤试验，测定ＩＬ－２基因转移对卵巢癌细胞系ＳＫＯＶ３致瘤性的影响。结果：ＳＫＯＶ３、ＳＫＯＶ３／Ｎｅｏ和ＳＫＯＶ３／ＩＬ－２细胞贴壁集落形成率、软琼脂集落形成率分别为５２％、４５％、０．７％和３１．４％、２８．５％、２．４％，ＳＫＯＶ３／ＩＬ－２细胞所形成的集落内细胞少，结构松散；裸鼠皮下成瘤实验显示，３组细胞皮下成瘤率分别为１００％（１２／１２）、９１．７％（１１／１２）及５６．３％（９／１６）；成瘤潜伏期平均分别为６．７±０．９ｄ、１１．４±４．０ｄ、１５．１±６．４ｄ，肿瘤终体积平均分别为１６０４．３±１４６９．４ｍｍ３、１１３０．３±１１５９．７ｍｍ３及２３３．３±１２６．４ｍｍ３；ＳＫＯＶ３／ＩＬ－２细胞皮下瘤增殖较ＳＫＯＶ３／Ｎｅｏ和ＳＫＯＶ３细胞明显缓慢（Ｐ＜０．００１）。镜下见ＳＫＯＶ３及ＳＫＯＶ３／Ｎｅｏ组肿瘤呈浸润性生长，并于皮下和肌肉间形成转移病灶，ＳＫＯＶ３／ＩＬ－２组肿瘤呈假包膜状生长，瘤内见大量单个核细胞浸润。结论：ＩＬ－２基因转移可降低细胞系ＳＫＯＶ３的致瘤?     

上皮性卵巢癌组织中血管内皮生长因子的表达及其临床意义

目的：探讨上皮性卵巢癌组织中血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）的表达及其临床意义。方法：以ＳＡＢＣ免疫组化分析法检测３７例上皮性卵巢癌组织中ＶＥＧＦ的表达。结果：上皮性卵巢癌、交界性卵巢肿瘤及良性肿瘤组织中ＶＥＧＦ阳性表达率分别为７２．９７％、６２．５０％及３８．４６％,恶性肿瘤及交界性肿瘤组织中ＶＥＧＦ表达率较良性肿瘤者明显增高（Ｐ＜０．０５）,且前两者的ＶＥＧＦ强阳性表达率也较良性肿瘤者明显增高（Ｐ＜０．０５）。上皮性卵巢癌中ＶＥＧＦ阳性表达率与有淋巴结转移者密切相关（Ｐ＜０．０５）。ＶＥＧＦ表达率与卵巢癌的临床分期及病理分级未见显著相关性。结论：ＶＥＧＦ在上皮性卵巢癌的生长及转移中可能起着重要作用。     

VEGF和SDF-1/CXCR4在促进卵巢癌细胞侵袭与增殖中的相关作用

目的:研究血管内皮生长因子(VEGF)和趋化因子受体(Cys-X-Cysreceptor4,CXCR4)/配体基质细胞衍生因子-1(stromalcell-derivedfactor1,SDF-1)在卵巢上皮性癌细胞中的表达及其在促进卵巢癌细胞侵袭和增殖中的相关作用,进而探讨SDF-1/CX-CR4信号参与卵巢癌发生发展的相关机制。方法:(1)用Real-timeRT-PCR检测卵巢癌细胞株SKOV3中VEGF及其单克隆抗体anti-VEGF作用前后SDF-1/CXCR4mRNA表达水平的变化;(2)通过transwell小室体外侵袭实验检测VEGF和SDF-1以及anti-VEGF和CXCR4特异性抗体(AMD3100)对SKOV3细胞趋化活性的影响;(3)用MTT法测定VEGF和SDF-1以及anti-VEGF和AMD3100作用前后SKOV3细胞增殖率的变化。结果:(1)VEGF可以上调SDF-1和CXCR4的表达且有明显的剂量依赖性。(2)VEGF和SDF-1均有促进卵巢癌细胞侵袭的作用。VEGF的促侵袭作用具有一定的剂量依赖性且可以被40μg/mlanti-VEGF阻断,SDF-1的作用没有明显剂量依赖性;CXCR4的特异性受体抑制剂AMD3100有阻断VEGF和SDF-1的促侵袭作用。(3)VEGF和SDF-1均有促进卵巢癌细胞增殖的作用。VEGF的作用具有剂量依赖性,其效应可被anti-VEGF阻断,但不被AMD3100阻断,SDF-1的促增殖作用无明显剂量依赖性,其效应可被AMD3100阻断。结论:VEGF和SDF-1对卵巢癌细胞的侵袭和增殖有直接促进作用,并且VEGF可以上调SDF-1/CXCR4的表达。两者与卵巢癌的发生和生物学行为关系密切并协同促进卵巢癌细胞的转移。     

卵巢上皮性癌组织中缺氧诱导因子1α的表达及其与血管内皮生长因子的相关性

目的　探讨卵巢上皮性癌组织中缺氧诱导因子 (HIF) 1α与血管内皮生长因子 (VEGF)及微血管密度 (MVD)的相关性。方法　用卵巢癌细胞株SKOV3种植于裸鼠背部皮下形成移植瘤。对移植瘤组织给予生理盐水 2 0 0 μl为对照组 ;给予HIF 1α抑制剂 (西罗莫司 ) 4mg/kg ,为西罗莫司组 ;给予VEGF抑制剂 (舒林酸 ) 10 0mg ,为舒林酸组。用免疫组化及RT PCR的方法 ,检测 3组肿瘤组织中HIF 1α、VEGF的表达以及MVD。结果　对照组HIF 1α及VEGF蛋白的表达为中、强阳性 ;西罗莫司组HIF 1α和VEGFmRNA表达均显著下降 ,为无表达或弱表达 ,两组比较 ,差异有显著性(P <0 0 5 )。经统计学检验 ,对照组与西罗莫司组HIF 1α和VEGFmRNA表达密切相关 (相关系数为 0 82 6 4 ,P <0 0 1) ;对照组HIF 1α靶基因 (肿瘤组织葡萄糖转运蛋白 1)的mRNA值为 0 8333,MVD为 31± 8,西罗莫司组HIF 1α肿瘤组织葡萄糖转运蛋白 1的mRNA值为 0 4 6 6 7,MVD为 13±5 ,两组具有相关性 (相关系数为 0 4 84 2 ,P <0 0 5 )。舒林酸组HIF 1α蛋白表达无改变 ,MVD表达为2 2± 6。结论　当HIF 1α的表达受到抑制时 ,VEGF的表达随之下降 ;HIF 1α对VEGF蛋白及mRNA的表达具有调节作用 ,从而使MVD降低。     

mdr1启动子调控双自杀基因对卵巢癌SKOV3耐药细胞的靶向杀伤作用

目的观察多药耐药基因1(mdr1)启动子调控腺病毒介导的胞嘧啶脱氨酶∷尿嘧啶磷酸核糖转移酶(CD∷UPP)融合基因系统对人卵巢癌紫杉醇耐药细胞的靶向杀伤作用。方法2004年10月至2005年5月于华中科技大学附属协和医院,将重组腺病毒(Admdr1-CD∷UPP)转染卵巢癌紫杉醇耐药细胞(SKOV3/Taxol)及非耐药细胞(SKOV3),荧光显微镜下观察转染效率,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测目的基因CD∷UPP的表达,并给予不同浓度的5-氟胞嘧啶(5-FC),用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测二组的细胞存活率及旁观者效应。结果重组腺病毒对SKOV3/Taxol的转染率随腺病毒滴度的递增而增加,感染复数(MOI)为50时,感染率约100%;CD∷UPP基因仅在SKOV3/Taxol中稳定表达;5-FC对耐药细胞转基因组的杀伤作用显著高于非耐药细胞转基因组,前者表现出明显的旁观者效应。结论mdr1启动子调控的CD∷UPP融合自杀基因系统对人卵巢癌紫杉醇耐药细胞有靶向杀伤作用。