双靶区反义RNA抑制乙型肝炎病毒

目的:研究双靶区反义RNA的逆转录病毒载体的转染、表达及其抗乙肝病毒(HBV) 的作用.方法:合成互补于HBV X区(1400-1430)的X片段、互补于HBV P区(2375-2405) 的P片段,分别构建表达单靶区反义X或P的重组逆转录病毒载体质粒和表达双靶区正义、反义 X 和 P 重组逆转录病毒载体质粒 ,转染PA317细胞,NIH3T3 细胞扩增法测假病毒颗粒的滴度.用假病毒颗粒感染2.2.15细胞,用酶标法检测2.2.15细胞上清 HBsAg和HBeAg含量.结果:对HBsAg的抑制率在感染后第3、5、7、9天时分别为 pLXSN:5%, 4%, 6%, 4%; pLXSN+Xpos/Ppos:1%, 5%, 5%, 11%; pLXSN+X:16%, 45%, 44%, 38%; pLXSN+P :34%, 59%, 55%,51%; pLXSN+X/P:73%, 83%, 81%, 79%.对HBeAg的抑制率在感染后第3 、5、7、9天时分别为pLXSN:2%, 6%, 4%, 3%; pLXSN+Xpos/Ppos:6%, 0, 0, 0; pLXSN+ X: 13%, 53%, 52%, 45%; pLXSN+P: 21%, 57%, 56%, 49%; pLXSN+X/P :62%, 87%, 84%,79%.结论:细胞内表达HBV反义RNA有明显抗乙肝病毒复制和表达的作用 ,而且双靶区反义RNA抗乙肝病毒的作用较单靶区反义RNA更明显.     

逆转录病毒载体介导HBV前C/C反义RNA的体外抗HBV作用

目的：了解反义乙型肝炎病毒(HBV)基因转移、表达的抗HBV作用。方法：BamH Ⅰ酶切HBV质粒获取1504bp前C／C基因片段，将其正、反向插入逆转录病毒载体pDOR构建了正、反义前C／C重组体。将重组体转染逆转录病毒包装细胞PA317，G418筛选获取抗性细胞及假逆转录病毒。RT-PCR检测了反义HBV基因表达的反义RNA。将重组假逆转录病毒感染2．2．15细胞，ELISA及斑点杂交法分别检测被感染细胞培养上清中HBsAg、HBeAg及HBV DNA。结果：反义前C／C重组逆转录病毒载体在细胞内能转录HBV反义RNA。反义前C／C重组假病毒感染的2．2．15细胞HBsAg、HBEAg的合成分别降低了55．5％、78％；HBV DNA水平也明显低于空白对照组。该抑制具有一定特异性。增加假病毒感染次数在一定范围内能提高抑制作用。正义假逆转录病毒感染对2．2．15细胞HBV DNA水平及抗原合成无影响。结论：逆转录病毒载体介导反义HBV基因转移表达的反义RNA能抑制HBV复制及抗原合成，具有潜在应用价值。     

双靶区反义RNA对乙型肝炎病毒转基因小鼠抗病毒疗效的研究

目的探讨针对乙型肝炎病毒（HBV） X、P双靶区反义RNA对乙型肝炎转基因小鼠HBV复制和表达的影响.方法构建表达HBV X、P双靶区正、反义RNA的重组载体质粒,与脂质体混合,经尾静脉注入小鼠体内,用酶联免疫法检测血清HBsAg;用荧光聚合酶链反应定量法检测血清HBV DNA含量;用免疫组化法检测肝细胞HBsAg、HBcAg的表达;小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏常规病理切片,观察反义RNA对小鼠脏器的影响.结果小鼠血清HBsAg表达,pLXSN-asX组和pLXSN-asXP组均于第四周明显低于给药前,最高抑制率分别达24%、27%;其余组未出现明显变化.与给药前相比,小鼠血清HBV DNA的复制,在pLXSN-asX组和pLXSN-asP组分别于第2周、第8周达到抑制高峰,抑制率均为58%;在pLXSN-asXP组于第1周、第8周出现两次抑制高峰,抑制率分别为66%、77%;其余组未出现明显变化.8周后,pLXSN-asX组、pLXSN-asP组和pLXSN-asXP组小鼠肝细胞HBsAg、HBcAg的表达显著低于其他组.小鼠脏器组织学观察未见异常.结论 HBV X、P双靶区反义RNA对乙型肝炎病毒转基因鼠有显著抗HBV作用,且在作用效率和作用时间上优于单靶区反义RNA.     

靶向HBVX基因的shRNA表达质粒对HBV复制的抑制作用

目的 观察靶向HBVX基因的RNA干扰(RNAi)对HBV复制的抑制作用.方法 选择HBV基因组X区的Nt1681-1708作为靶序列,合成相应的正、反义寡核苷酸,退火后形成双链,克隆入shRNA表达质粒,将得到的质粒与HBV质粒共转染HepG2细胞,观察HepG2细胞中HBsAg、HBeAg、HBV DNA和pgRNA的受抑制情况.结果 HBsAg、HBeAg的表达、HBV DNA和pgRNA的拷贝数均明显受到抑制.结论 所选靶区通过RNAi可有效抑制HBV复制.     

双靶区反义RNA抗乙型肝炎病毒的实验研究

目的 研究双靶区反义RNA重组载体质粒的转染、表达及抗乙型肝炎病毒的作用。方法 构建表达乙型肝炎病毒X、P双靶区正、反义RNA的重组载体质粒与脂质体混合,经尾静脉注入小鼠体内,用荧光聚合酶链反应定量法检测血清乙型肝炎病毒DNA含量,用Nested—PCR法检测血清乙型肝炎病毒DNA转阴率。结果 与给药前相比,小鼠血清乙型肝炎病毒DNA的复制,在逆转录病毒载体-asX组和逆转录病毒载体-asP组分别于第2、第8周达到抑制高峰,抑制率均为58％;在逆转录病毒载体-asXP组于第1、第8周出现两次抑制高峰,抑制率分别为66％、77%;其余组未出现明显变化。给药后8周,小鼠血清乙型肝炎病毒DNA,在逆转录病毒载体-asX组、逆转录病毒载体-asP和逆转录病毒载体-asXP分别有2只、1只,1只转阴,转阴率分别为25.0％、12．5％、16．7％。结论 乙型肝炎病毒X、P双靶区反义RNA对乙型肝炎病毒转基因鼠乙型肝炎病毒DNA的抑制作用优于单靶区反义RNA,但其对血清乙型肝炎病毒DNA的转阴率与单靶区反义RNA无显著性差异。     

反义X区RNA和反义P区RNA小鼠体内抗HBV的比较

目的:探讨针对乙型肝炎病毒(HBV)X区反义RNA和P区反义RNA对乙型肝炎转基因小鼠HBV复制和表达的影响.方法:构建表达HBV X区反义RNA和P区反义RNA的重组载体质粒,与脂质体混合,经尾静脉注入小鼠体内,用荧光聚合酶链反应定量法检测血清HBV DNA含量,用Nested-PCR法检测血清HBV DNA转阴率.结果:PLXSN-asX小鼠血清HBV DNA的复制于给药后2 d被抑制,至给药后8周抑制依然存在;PLXSN-asP小鼠血清HBV DNA的复制于给药后4 wk被抑制,至给药后8周抑制处于上升趋势. 与给药前相比,小鼠血清HBV DNA的复制,在PLXSN-asX组和PLXSN-asP组分别于2和8 wk达到抑制高峰,抑制率均为58%; 8周后小鼠血清HBV DNA转阴率PLXSN-asX组和PLXSN-asP组分别为25.0%(2/8), 12.5%(1/8).结论:HBV X区反义RNA与HBV P区反义RNA对乙型肝炎病毒转基因鼠抗HBV作用效率无显著差异,但X区反义RNA的起效时间明显早于P区反义RNA.     

外源性microRNA介导的RNA干扰抑制HBV复制和表达

目的 设计并构建靶向HBV的外源性microRNA表达载体,观察其对HBV表达和复制的抑制作用.方法 以HBV P基因和X基因为靶基因,根据pcDNA6.2-G/W-miR载体要求,设计靶向HBV的microRNA序列,进行直接合成获得目的 片段并克隆到载体中,测序正确的载体通过脂质体方法转染HepG2.2.15细胞,RT-PCR、乙肝五项定量和荧光定量PCR检测其对HBV mRNA和HBV DNA的抑制作用.结果 质粒的转染效率为50%～60%,在这种状态下,外源性microRNA表达载体在HBV mRNA和HBsAg、HBeAg和HBV DNA水平上均能显著抑制HepG2.2.15细胞中HBV的复制和表达(P＜0.05).结论 外源性microRNA表达载体构建成功,并能抑制HBV靶基因的表达,为其在慢性HBV感染基因治疗中的应用奠定了基础.     

靶向核定位序列siRNA对乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA复制的抑制作用

目的 针对乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白羧基端核定位信号(NLS)区设计并化学合成2条小干扰RNA(siRNA),观察其对共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)水平的影响.方法 将siRNA转染可稳定分泌HBV颗粒的HepG2.2.15细胞,转染后72 h,采用ELISA方法检测上清液中HBsAg、HBeAg的含量,采用Real-time PCR定量检测细胞内cccDNA及细胞培养上清HBV DNA拷贝数.RT-PCR检测靶基因mRNA的抑制效果.结果 靶向NLS区的2条siRNA均能不同程度地降低HepG2.2.15细胞cccDNA水平,抑制HBV DNA的复制及HBeAg的分泌,对cccDNA的抑制率分别为93.30％和85.00％(P＜0.01),对HBV mRNA抑制率分别为62.80％和48.90％,对HBV DNA抑制率分别为76.56％和66.41％(P＜0.01),对HBeAg抑制率分别为57.25％、43.48％(P＜0.01).而无关序列对HBV DNA与cccDNA的复制和HBeAg表达几乎无干扰作用.结论 靶向HBV核心蛋白C末端核定位序列的siRNA可特异、高效、稳定地显著降低HBV cccDNA水平,抑制HBV DNA复制及HBeAg分泌,为应用RNA干扰治疗HBV感染奠定了一定基础.     

RNA干涉对乙型肝炎病毒复制和表达的影响

目的：观察HBV S区和C区特异性的小发夹RNA（shRNA）表达载体对HepG2.2.15细胞中HBV复制和表达的影响。方法：采用含有pol Ⅲ启动子的真核表达载体pSilenceCircle-U6构建针对HBV S区和C区的特异性shRNA表达质粒SC-S和SC-C。实验设立SC-S组、SC-C组、无关对照SC-N组和空白对照组,采用不同浓度的重组载体转染HepG2.2.15细胞,并作用不同时间。应用ELISA方法检测细胞上清液中的HBeAg和HBsAg,用斑点杂交方法检测细胞上清中的HBV DNA。结果：成功构建了含目的序列的重组质粒SC-S和SC-C。SC-S对HBeAg和HBsAg表达的抑制率明显高于SC-C;随着给药浓度的增加,SC-S对HBeAg和HBsAg表达的抑制率逐渐增强;SC-S转染HepG2.2.15细胞后第3天产生明显抑制效应,对HBeAg及HBsAg表达的抑制率在第6天达高峰,第9天抑制率仍较高。斑点杂交结果显示,SC-S对HBV复制的抑制效应强于SC-C。结论：构建的HBV S区和C区特异性shRNA表达质粒有明显、高效抑制HBV复制和表达的作用。     

反义寡聚脱氧核苷酸体外对乙型肝炎病毒基因表达的抑制作用

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)C基因翻译起始区和C基因区反义寡聚脱氧核苷酸对HBV表达的序列性抑制作用.方法以乙型肝炎病毒基因组(HBV DNA)转染人肝癌细胞系HepG2而建立起来的转染细胞系2.2.15作为实验对象,设计了一系列互补于HBV mRNA编码核心蛋白基因区(C区)15聚反义硫代寡聚核苷酸(ASON),通过脂质体介导将这些合成的外源基因导入2.2.15细胞中,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测作用细胞培养上清液中乙型肝炎病毒E抗原(HBeAg)和乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)含量,提取细胞中的HBV DNA经PCR扩增后,用Southern blotting方法对PCR产物进行半定量分析.结果与HBV mRNA C基因起始区互补的反义硫代寡核苷酸序列特异性地抑制乙型肝炎病毒基因表达,而正义硫代寡核苷酸未见有抑制效应,与HBV mRNA C基因内部互补的序列很少或无抗病毒活性.ASON作用24 h后的细胞培养上清液及细胞内HBV DNA量比对照组明显减少.另外,ASON对细胞生长无毒性作用.结论反义硫代寡核苷酸能够在细胞水平有效地抑制乙型肝炎病毒基因的表达.     

反义基因转移表达及抗乙型肝炎病毒的作用

目的观察重组逆转录病毒载体－包装细胞系统介导反义基因转移表达和抗乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的作用。方法将ＨＢＶａｙｗ１４０２－２９０６片段和２８３９－１９８６片段反向插入重组逆转录病毒载体质粒，分别转染ＰＡ３１７包装细胞，分别感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞和２．２．１５细胞。结果转导的ＮＩＨ３Ｔ３细胞内有ＨＢＶ反义ＲＮＡ转录表达。ＨＢＶ反义基因重组逆转录病毒感染２．２．１５细胞后第３天，表面抗原（ＨＢｓＡｇ）和ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）表达量减少，感染后第５天，ＨＢＶ抗原表达抑制率达高峰。ｐｒｅＳ／Ｓ片段反义基因转移后，ＨＢｓＡｇ表达抑制率为７１％，ＨＢｅＡｇ抑制率为２３％；ｐｒｅＣ／Ｃ片段反义基因转移后，ＨＢ－ｓＡｇ表达抑制率为２３％，ＨＢｅＡｇ抑制率为５９％。结论逆转录病毒载体－包装细胞系统能够介导ＨＢＶ反义基因在真核细胞内转移和表达，并对ＨＢＶ复制和表达均有抑制作用。     

核酶对乙型肝炎病毒基因表达的抑制作用

目的 探讨核酶在细胞内抑制乙型肝炎病毒基因表达的作用。方法 计算机设计针对Ｃ基因的三个切点的核酶Ｒｚ１,Ｒｚ２,Ｒｚ３,合成核酶基因并将三个核酶基因两两组合克隆入ｐＧＥＭ７ｚｆ（一）质粒中,经体外转 录后切割靶ＲＮＡ;选择Ｒｚ２和Ｒｚ３串联的双位点核酶基因构建入逆转录病毒载体ｐＢＢＳ２１２中,重组质粒转染２．２．１５细胞,ＥＬＩＳＡ方法惭型肝炎病毒基因表达的抑制作用。结果 三种不同组合的核酶均可有     

瞬时转染和稳定转染对RNAi抑制乙型肝炎病毒S基因表达的影响

目的:构建针对乙型肝炎病毒(HBV)S基因的siRNA表达载体Psuper-S1和Psuper-S2,观察瞬时转染及稳定转染对RNAi抑制HBV基因表达作用的影响.方法:设计并合成针对HBV S基因的siRNA寡核苷酸,经退火形成双链后克隆入Psuper载体,构建成功的siRNA表达载体分别瞬时转染和稳定转染表达HBV的2.2.15细胞,对所得细胞上清中的HBsAg和HBeAg进行定量检测,RT-PCR检测siRNA对靶基因Mrna的抑制效果,并比较两种转染方式对RNAi抑制HBV基因表达作用的影响.结果:在稳定转染并经潮霉素筛选所得的单克隆细胞株中,Psuper-S1和Psuper-S2均能明显抑制HBsAg及HBeAg的分泌(P<0.01),抑制率分别为83%和78%,RT-PCR结果证实HBV的Mrna明显降低,而瞬时转染细胞在蛋白质水平上及Mrna水平上的结果则比稳定转染的结果逊色.结论:针对HBV S基因的siRNA能稳定、高效、特异地抑制HBV基因的表达,转染效率对于靶基因的RNA干涉作用有明显的影响.     

siRNA抑制乙型肝炎病毒在HepG2.2.15细胞中的复制与表达

目的 探讨靶向HBV S基因的siRNA表达质粒在HepG2.2.15细胞中对HBV病毒的复制与表达的抑制效应及其抗病毒活性.方法 设计并构建了两个靶向HBV S基因的siRNA表达质粒S1和S2,随机设计的用于对照的非同源siRNA表达质粒S3.首先在HepG2.2.15细胞中通过实时荧光定量PCR评估该siRNA表达质粒对HBV mRNA表达的抑制效应,接着在HepG2.2.15细胞中通过ELISA方法进一步枪测它们的抗病毒活性细胞上清液中HBV标志性蛋白HBsAg、HBeAg的表达水平.结果 在siRNA表达质粒转染HepG2.2.15细胞后48 h,HBV S基因mRNA表达量下降64%～88%,HBsAg和HBeAg的表达水平分别降低了60%～82%和56%～78%.S1+S2联合使用转染细胞中显著抑制HBV病毒的复制与表达的效率,而对照组S3无抑制效果.结论 发现靶向HBV S基因的siRNA表达质粒能够在HepG2.2.15细胞中有效的抑制HBV病毒的复制与表达,并能够降低细胞上清液中HBsAg和HBeAg的表达水平.S1+S2联合使用转染细胞中可以显著抑制HBV的复制与表达的效率.RNAi可能成为防治HBV感染有效的全新的抗病毒防御策略.     

Effect of preS2 antisense RNA on hepatocellular carcinoma with a novel delivery system

HepatitisBvirus (HBV)infectioniswidelyprevalentinChina ,andthereisnoefficientwaytocureit Antisensetechnique,blockingthetargetgeneandinhibitingitsexpressionatthemolecularlevel,hasshownpotentialantiviralandantitumoreffects 1 3 　Choosingthetargetsiteonthe 3 2kbHBVgenomeisthekeytotheantisensetechnique Inpreviousresearch ,wefoundthatanantisenseoligonucleotidecomplementarytopreS2 (as preS2 )hadthestrongestinhibitoryeffectonHBVantigenexpressioninvitroamongfourpiecesofHBVantisenseoligonucleoti…     

乙型肝炎病毒 P区RNA干扰抑制2.2.15细胞乙型肝炎病毒表面抗原和e抗原分泌的实验研究

目的观察针对乙型肝炎病毒（HBV）P区基因的RNA干扰（RNAi）表达载体pGE—HBVP在HepG2．2．15（2．2．15）细胞中抑制HBV表面抗原（HBsAg）和e抗原（HBeAg）的分泌效应,以阐明HBVP区小干扰RNA（siRNA）抑制HBV复制和蛋白表达的影响。方法构建并鉴定pGE—HBVP,将此载体转染至完整HBV复制模型2．2．15细胞,用化学发光免疫检测法检测并分析转染后不同时间段细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的含量变化,并用免疫细胞化学方法观察转染后细胞中HBsAg的表达变化。结果成功构建了5个针对HBVP区的RNAi表达载体pGE—HBVP1～pGE—HBVP5,其中pGE—HBVP1和pGE—HBVP2具有明显的HBsAg和HBeAg分泌抑制效应和表达抑制效应。抑制率最高的pGE—HBVP2在转染2．2．15细胞效率为30％～40％的基础上,转染后24、48、72和96h培养上清中的HBsAg分泌抑制率分别为28．88％、32．28％、29．10％和18．42％,HBeAg的分泌抑制率分别为38．33％、27．50％、33．41％和12．60％。细胞免疫细胞化学结果显示,pGE-1空载体转染后2．2．15细胞的HBsAg的表达阳性率约为82％,而pGE—HBVP2转染后2．2．15细胞的HBsAg的表达阳性率约为50％,和pGE-1空载体相比阳性率显著下降。结论针对HBVP区的RNAi可以抑制HBV病毒抗原的分泌和表达。