Notehl对人脐带问充质干细胞增殖、黏附及迁移影响的体外研究

目的探讨Notchl基因的重组腺病毒转染对人脐带间充质干细胞（humanumbilicalcordmesenchymalstemcells,hUCMSCs）增殖、黏附及迁移能力的影响。方法按照不同腺病毒感染hUCMSCs分为实验组（Ad-Notchl）、阴性对照组（Ad—GFP）与空白对照组。以最佳MOI转染hUCMSCs,观察细胞形态变化以及GFP蛋白的表达。比较3组细胞增殖能力、细胞周期、黏附能力及迁移能力。WesternBolt检测3组细胞Notchl蛋白的表达水平。结果荧光下观察腺病毒成功感染细胞,阴性对照组和实验组均出现了GFP的表达,且随培养时间的延长表达量增高,可见光下观察实验组细胞增殖速度较快。实验组细胞的增殖能力（48、72、96h）、黏附能力（12、16、20h）及迁移能力均较阴性对照组及空白对照组增强（P〈0．05）。WesternBolt检测实验组细胞Notchl蛋白的表达水平显著高于阴性对照组和空白对照组（P〈0．05）。结论Notchl能明显促进hUCMSCs的增殖、黏附和迁移。     

电磁场不同处理时间对人脐带间充质干细胞增殖与分化的影响

目的研究频率50 Hz强度1.8 m T下的不同处理时间正弦交变电磁场对体外培养人脐带间充质干细胞增殖与分化的影响。方法体外分离培养人脐带间充质干细胞,传代后随机分为6组,每天于倒置相差显微镜下观察细胞形态;MTT测定细胞增殖;10 d、12 d、14 d和16 d测定ALP活性;15 d行茜素红钙化结节染色以及17 d行vonkossa染色;第13 d ALP组织化学染色;在磁场处理后的4 d和6 d行Real-time RT-PCR检测Ⅰ型胶原(Collagen-Ⅰ)和骨形态发生蛋白(BMP-2)mRNA表达量的变化。结果 0.5 h组可促进细胞增殖;磁场处理10 d~12 d后细胞出现钙化趋势;2.5 h组在SEMFs处理16 d和18 d后ALP活性均高于对照组(P<0.05);1.5 h组、2.0 h组和2.5 h组钙化结节茜素红染色面积均高于对照组(P<0.01,P<0.05);1.5 h组Collagen-ⅠmRNA表达水平高于对照组(P<0.05),2.0 h和2.5 h组ALP组织化学染色面积、Collagen-Ⅰ、BMP-2 mRNA表达水平均高于对照组(P<0.05,P<0.01)。结论 50 Hz 1.8 m T的正弦交变磁场能促进体外培养人脐带间充质干细胞成骨性分化,尤以处理2.5 h促进人脐带间充质干细胞成骨性分化最为明显。     

脐带间充质干细胞对脐血单个核细胞增殖和凋亡的影响

目的：观察在低浓度血清培养下脐带间充质干细胞（UC—MSCs）对脐血单个核细胞（MNC）的增殖和凋亡的影响。方法：利用密度梯度法分离脐血单个核细胞，接种于脐带MSC建立的饲养层培养，通过计数细胞、半固体培养和流式细胞仪分别检测细胞的增殖和凋亡，以评价脐带MSC的支持造血功能和抗凋亡作用。结果：脐带间充质干细胞组单个核细胞总数及集落形成细胞（CFC）显著高于单培养组（P〈0．01），且单个核细胞凋亡率低于单培养组（P〈0．01）。结论：体外证实脐带MSC具有促进造血和抗凋亡作用。     

健康人皮肤间充质干细胞对HaCaT细胞增殖作用的研究

目的探讨健康人皮肤间充质干细胞(S-MSCs)对Ha Ca T细胞增殖的作用,为研究S-MSCs在病理状态下的作用提供理论依据。方法健康人皮肤20份,均取自我院整形和泌尿外科手术切除的多余新鲜皮肤组织。在体外无菌条件下进行真表皮分离、培养真皮MSCs,流式细胞术进行细胞鉴定,多向诱导分化及分化细胞的鉴定,将培养至第5代的S-MSCs与Ha Ca T细胞共培养,并与自然增殖组进行对照,采用实时动态细胞分析技术法进行Ha Ca T细胞增殖检测,培养72 h后用细胞计数法检测Ha Ca T细胞的数量。结果倒置相差显微镜下,健康人S-MSCs的细胞形态呈细长梭形,细胞表面抗原CD29、CD44、CD73、CD90、CD105呈高表达,而CD34、CD45及人类白细胞抗原(HLA)-DR表达阴性,并且可诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞。Ha Ca T细胞自然增殖组细胞数为(2.74±0.36)×105,与健康人S-MSCs共培养组细胞数为(2.24±0.28)×105,差异有统计学意义(P<0.001)。结论健康人皮肤来源的MSCs可在体外抑制Ha Ca T细胞的增殖。     

不同浓度地塞米松对人骨髓间充质干细胞体外增殖及凋亡的影响

目的观察地塞米松对体外培养人骨髓间充质干细胞增殖及凋亡的影响。方法利用1.073g/mLPercoll分离液以梯度密度分离法获取人骨髓间充质干细胞（hMSCs）,进行体外培养。成骨诱导组细胞用地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸钠处理,分别进行ALP染色和矿化结节染色。实验组细胞分别以10^-9mol/L、10^-8mol/L、10^-7mol/L和10^-6mol/L地塞米松加以干预,MTT法检测各组细胞的增殖率;流式细胞仪定量分析hMSCs的凋亡率。结果成骨诱导组细胞ALP染色和矿化结节染色均为阳性,对照组为阴性;低浓度（10^-9mol/L）地塞米松对细胞的体外增殖无明显影响（P〉0.05）,10^-8mol/L及以上浓度地塞米松可明显抑制细胞的增殖（P〈0.01）;hMSCs凋亡率随地塞米松浓度的增加而升高（P〈0.01）。结论地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸钠可促使hMSCs成骨分化,10^-8mol/L及以上浓度的地塞米松可明显抑制细胞的增殖,地塞米松能促进体外培养的人骨髓间充质干细胞凋亡。     

腺病毒介导血管内皮生长因子转染脐带间充质干细胞的实验研究

目的探讨腺病毒载体介导血管内皮生长因子(VEGF)转染脐带间充质干细胞(UCMSCs)的可行性,以及VEGF转染对UCMSCs功能的影响。方法构建VEGF165-EGFP基因重组腺病毒载体,分离和培养UCMSCs,携增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的腺病毒载体转染UCMSCs,倒置荧光显微镜下观察细胞转染效果,流式细胞仪检测细胞转染率,确定最佳病毒感染复数(MOI)。将细胞分为VEGF-EGFP转染组、EGFP空载组及对照组3组,依据最佳MOI值转染并收集细胞,采用蛋白印迹法(Western blotting)检测VEGF及Akt表达变化;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测VEGF蛋白表达情况。采用CCK-8法评价转染对UCMSCs增殖的影响。结果腺病毒介导的VEGF165-EGFP基因能够成功转染UCMSCs,且VEGF基因在细胞内能够转录和表达,并能分泌到细胞外。转染后48 h VEGF-EGFP转染组VEGF、Akt水平显著高于EGFP空载组和对照组(P<0.05);转染后48 h采用ELISA法在VEGF-EGFP转染组细胞培养上清中即检测到VEGF的表达和分泌,在转染后第4天达到高峰,且VEGF表达显著高于EGFP空载组及对照组(P<0.01),以后逐渐下降,并稳定表达一定时间。CCK-8法检测结果显示,介导VEGF基因转染的腺病毒对UCMSCs增殖无明显影响。结论腺病毒介导VEGF基因能够成功转染UCMSCs,保持其原有生物学特性,并能持续高效表达VEGF,为通过VEGF基因联合UCMSCs治疗获得糖尿病下肢血液循环重建的可行性提供理论依据。     

肝细胞生长因子在干细胞领域的研究进展

干细胞(stem cells,SC)是一类具有自我复制能力的多潜能细胞,在一定条件下,它可以分化成多种功能细胞.目前干细胞移植已广泛应用于造血系统、肾病、下肢缺血及脑瘫等疾病.但如何让干细胞更有效地动员并发挥作用仍然是干细胞治疗的难点.本文旨在就肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)对干细胞的影响综述如下.     

人脐带问充质干细胞体外培养、鉴定及其诱导分化的研究

目的通过体外分离、培养及鉴定人脐带间充质干细胞（humanumbilicalcordmesenchymalstemcells,hUCMSCs）,探讨其多向分化潜能。方法取正常足月新生儿脐带,采用组织贴壁培养法分离原代hUCMSCs,观察细胞生长形态。采用流式细胞仪技术检测hUCMSCs细胞表型及细胞周期。通过成神经细胞诱导和成脂肪细胞诱导,鉴定hUCMSCs的多向诱导分化能力。结果成功分离和培养hUCMSCs原代细胞,经流式细胞仪鉴定高表达间质细胞标志CD44和CDl05,阳性率为96．73％和96．10％,整合素受体CD29阳性率为99．53％;低表达造血系标志CD34和CD45阳性率为0．80％和1．91％,人白细胞抗原HLA-DR阳性率为1．41％。细胞周期检测hUCMSCs主要处于G0／G1期。hUCMSCs成神经细胞诱导,出现神经元样细胞;免疫组化检测神经巢蛋白（Nestin）呈阳性表达。hUCMSCs成脂肪细胞诱导,出现空泡样脂肪滴,油红O染色可见脂质沉积。结论hUCMSCs具有多向分化潜能,可跨胚层诱导分化为多种组织类型的细胞。     

血液病患者骨髓间充质干细胞的增殖分化特点

目的:研究血液病患者骨髓间充质干细胞(MSC)的体外增殖分化特点.方法:用H4434甲基纤维素半固体培养基培养168例血液病患者骨髓单个核细胞14 d,分析贴壁梭形细胞形态和生长等级特点;CD29、CD44、α-SMA、α-醋酸奈酚酯酶和碱性磷酸酶组化染色鉴定MSC特性和分化特点.结果:所有患者贴壁细胞为梭形,核圆或椭圆形,瑞氏染色胞浆淡蓝,核为紫红色;α-醋酸奈酚酯酶染色阳性.所有患者贴壁细胞的CD29和CD44阳性率在90%～95%之间,碱性磷酸酶和α-SMA阳性率分别为25%和30%.再生障碍性贫血、急性白血病、骨髓异常增生综合征和骨髓增殖性疾病4组患者贴壁细胞生长等级不同,再生障碍性贫血组分别高于其他3组(P<0.05).结论:血液病患者MSC非诱导体外培养广泛表达骨和肌型细胞标志;再生障碍性贫血患者MSC生长等级显著高于急性白血病、骨髓异常增生综合征和骨髓增殖性疾病.     

肝细胞生长因子与酸性成纤维细胞生长因子体外诱导胚胎肝干细胞抗原阳性细胞向肝细胞定向分化的研究

目的探讨肝细胞生长因子（HGF）与酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）体外诱导胚胎肝干细胞抗原阳性（Sca-1^＋）细胞向肝细胞或肝细胞前体分化的可行性。方法免疫磁珠分离法分离Sca-1^＋细胞,相差显微镜观察细胞形态,（RT-PCR半定量逆转录聚合酶链反应）法检测细胞自蛋白（ALB）、转甲状腺蛋白mRNA水平表达;免疫组织化学法检测ALB、AFP和CKS／18蛋白水平的表达,以及检测细胞糖原染色和尿素合成功能。结果分离后Sca-1^＋细胞活力为（94．24±1．04）％,纯度为（85．57±1．66）％,回收率为（62．31±1．85）％。Sca-1^＋细胞经HGF和aFGF诱导分化后,细胞形态变成不规则,明显向肝细胞变化,AFP蛋白表达消失、ALB和CK8／18蛋白表达升高,ALB、转甲状腺蛋白mRNA表达升高,且细胞糖原染色和尿素合成功能增强,逐渐向成熟肝细胞转化。结论HGF与aFGF可在体外诱导胚胎肝Sca-1^＋细胞向肝细胞或肝细胞前体分化。     

人脐带间充质干细胞冻存复苏后生物学性状研究

目的 观察冻存前与冻存复苏后人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)生物学特性的变化.方法 从我院产科健康剖宫产产妇捐献的脐带中分离得到hUCMSCs,观察其生长情况,检测其表面抗原,并将第3代hUCMSCs采用梯度冷冻技术冻存6个月,比较冻存前及冻存复苏后hUCMSCs的形态、增殖、染色体、免疫表型情况及多向分化能力.结果 冻存前及冻存复苏后,hUCMSCs形态无明显差异,均呈典型梭形,贴壁生长;荧光强度、平均存活率比较差异无统计学意义(P＞0.05);生长曲线、免疫表型相似.冻存复苏后的hUCMSCs染色体检查未见异常,有向脂肪细胞分化的能力.结论 hUCMSCs经冻存复苏后生物学特性仍保持稳定.     

脐带间充质干细胞治疗CIA大鼠的疗效观察

目的：观察间充质干细胞（MSC）治疗胶原诱导关节炎（CIA）大鼠的效果。方法：Ⅱ型胶原酶诱导关节炎大鼠,给予MSC尾静脉输注治疗,设MSC治疗组、甲氨蝶呤为阳性对照组、模型组与空白组,实验过程中每3天进行关节评分,实验结束后ELISA法测定各组大鼠血清中白介素-17（IL-17）、NF-κB 配位体受体活化剂(RANKL)、可溶性蛋白骨保护素(OPG)和转化生长因子-β（TGF-β）水平,HE染色法观察关节破坏情况。结果：MSC与甲氨蝶呤作用相似,均能够有效缓解胶原诱导的关节肿胀;与模型组相比,MSC能够显著降低RANKL、TGF-β的水平,升高OPG的水平（P<0.05）,而对IL-17影响不显著;组织学检验结果提示,MSC对CIA大鼠关节具有保护作用。结论：MSC能够提高通过抑制RANKL、TGF-β分泌,提高OPG水平,发挥对关节的保护作用,减轻CIA的关节肿胀程度,其治疗效果与甲氨蝶呤相似。     

环磷腺苷葡胺对人脐静脉血管内皮细胞增殖、迁移、管腔形成及凋亡的影响

目的 探索环磷腺苷葡胺（meglumine cyclic adenylate,MCA）对人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）增殖、迁移、管腔形成及凋亡的影响。方法 通过显微镜观察、MTT法、划痕修复试验、管腔形成试验、Western blotting观察不同浓度MCA对HUVEC细胞形态、增殖、迁移、管腔形成能力及凋亡相关蛋白表达的影响。结果 显微镜观察发现,随着MCA剂量增加,HUVEC细胞形态由多角形变为卵圆形。MCA可呈浓度依赖地抑制HUVEC增殖、迁移、管腔形成,并且高剂量的MCA还可诱导细胞凋亡,表现为细胞凋亡数目增加,Bax、Cleaved-PARP蛋白表达上调,PARP、Bcl-2蛋白表达下调。结论 MCA可抑制HUVEC细胞增殖、迁移、管腔形成,并诱导细胞凋亡。     

人脐带间充质干细胞和大鼠激活态雪旺细胞联合培养的实验研究

目的:探讨体外分层共培养条件下大鼠激活态雪旺细胞对人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)生长及分化的影响。方法:分离、培养人脐带间充质干细胞和大鼠激活态雪旺细胞,通过Millicell小室实现两者体外共培养,根据共培养与否分为共培养组与对照组,通过巢蛋白(Nestin)、神经丝蛋白200(NF200)免疫荧光染色分析干细胞分化情况。结果:共培养组两种细胞在Millicell小室分层共培养条件下,hUCMSCs逐渐出现类似神经细胞的形态,对照组形态无明显变化。共培养组中hUCMSCs表达神经干细胞标志物Nestin,共培养1d后逐渐降低,而对照组仅低表达Nestin,共培养8h~7d,两组间差异有统计学意义(P<0.01);共培养组细胞共培养1d后hUCMSCs表达神经元标志物NF200,而对照组始终不表达NF200。结论:人脐带间充质干细胞有向神经细胞分化的能力,分层培养条件下大鼠激活态雪旺细胞可促进其神经方向分化。     

携带人肝细胞生长因子基因重组腺病毒的构建与制备

构建一种携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒(AdHGF),并对其进行扩增、纯化与质量检测。首先构建携带人肝细胞生长因子基因的穿梭质粒pXCJL1CMV/pAHGF,然后用LipofectAMIN介导该质粒和含有E1、E3区及包装信号区缺失的复制缺陷型5型腺病毒基因组的质粒GT4050共转染293细胞,采用细胞内质粒DNA同源重组法构建重组腺病毒(AdHGF)。并以噬斑分析法筛选单克隆重组腺病毒,PCR法鉴定阳性重组腺病毒,氯化铯密度梯度离心法纯化病毒,紫外分光光度仪测定病毒颗粒数及纯度,快速CPE分析、噬斑分析法测定病毒感染滴度(pfu/ml)。采用敏感细胞病变法检测有复制能力的腺病毒。结果成功构建了重组腺病毒AdHGF,制备的病毒纯度好、滴度高,其效价比小于1∶100,并且未检测到有复制能力的腺病毒存在。研究构建制备的重组腺病毒AdHGF具有潜在的实际应用价值。     

血清肝细胞生长因子检测及分析

目的　探讨肝脏病患者血清肝细胞生长因子 (HGF)的变化并分析其临床意义。方法　采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测肝细胞癌(HCC)70例、肝硬化(HC)85例、重症肝炎 (SH)53例、慢性肝炎 (CH) 72例患者血清中的HGF水平, 并与 68名健康献血员进行对照;同时测定血清中转氨酶(ALT、AST)、胆红素 (TBil)。结果　HGF分别为:HCC组为 145. 4ng/L;HC组为 758. 8ng/L;CHH组为 2158. 2ng/L;CH组为 328. 5ng/L;正常对照组为12. 8ng/L。肝脏疾病患者与正常组相比,HGF有显著性差异 (P<0. 01 )。肝脏病患者组之间也存在显著性差异(P<0. 01)。结论　血清HGF的变化对肝脏疾病的诊断,了解肝脏损伤的程度及预后有一定意义。     

阿托伐他汀对低氧环境下人脐静脉内皮细胞增殖与细胞周期的影响

目的探讨阿托伐他汀对低氧环境下人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖和细胞周期的影响。方法将培养的HUVECs随机平均分为5组,每组8孔。正常对照组给予血清DMEM液培养12 h;低氧模型组置于低氧装置中用无血清DMEM液培养12 h;低、中、高浓度给药组均置于低氧装置中,分别用含0.05,0.10,0.20 mmol.L-1阿托伐他汀钙的无血清DMEM液培养12 h。采用MTT法测定细胞增殖情况,流式细胞术分析各组不同周期细胞所占比例。结果低氧模型组细胞增殖被明显抑制。在低氧环境下分别加入阿托伐他汀后,细胞增殖过程被明显促进,与低氧模型组相比,各浓度给药组差异有显著性或极显著性(P<0.05或P<0.01),但药物浓度与效应呈非线性关系,其中中浓度组促增殖作用最强,而高浓度组促增殖作用明显减弱。给予不同浓度阿托伐他汀干预后,HUVECs细胞周期中S期细胞显著增多,G0/G1期细胞所占比例下降。结论适当浓度的阿托伐他汀对低氧环境下HUVECs的增殖和DNA的合成有促进作用,阿托伐他汀在缺血心肌新生血管形成过程中可能具有一定作用。