高、低淋巴道转移能力小鼠肝癌细胞株抑制性消减杂交文库的构建

应用抑制性消减杂交（suppression subtracted hybridization,SSH）技术,分别构建2个不同淋巴道转移能力小鼠肝癌细胞株的SSH文库,高转移文库以高转移能力细胞株Hca-F为检测子（tester）,同源的低转移能力细胞株Hca-P为驱赶子（driver）;低转移文库则相反.随机筛选2个文库阳性克隆进行测序,并在GenBank数据库中进行同源性比较.成功构建高、低淋巴道转移能力小鼠肝癌细胞株SSH文库,高、低转移文库中分别包含995个及967个阳性克隆;其中,95%的阳性克隆含有300bp～1 000bp不等的插入片段;随机测序显示,文库中含有已知的基因、ESTs及与任何序列无同源性的新基因片段.     

nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株抑制消减cDNA文库的构建

背景与目的 已有的研究表明,nm23-H1基因是一个重要的肺癌转移抑制基因,为了筛选与该基因表达相关的差异表达基因.本研究拟构建nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株(L9981和L9981-nm23-H1)差异表达基因的抑制消减cDNA文库,为进一步筛选、克隆与nm23-H1转移相关的基因奠定基础.方法利用抑制消减杂交(suppressive subtractive hybridization,SSH)技术构建nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株(L9981和L9981-nm23-H1)间差异表达基因的正向和反向消减cDNA文库,经蓝白菌落筛选克隆,并PCR反应鉴定.结果 成功构建了该两株细胞株差异表达基因的正向和反向消减cDNA文库.经蓝白菌落筛选,正向消减文库总共获得约300个白斑克隆,反向消减文库总共获得约400个白斑克隆,从正反向消减文库中各挑选96个克隆进行PCR扩增检测是否有插入片段,结果显示在挑选的正向文库中有84个克隆有插入片段,反向文库中有83个克隆有插入片段.其片段大小范围为(300-750)bp.结论 抑制消减杂交是克隆差异表达基因的有效方法,我们应用SSH法和T/A克隆技术成功建立了nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株(L9981和L9981-nm23-H1)差异表达基因的抑制消减cDNA文库.nm23-H1基因在肺癌细胞中的表达可能影响某些转移相关基因的差异表达.     

人前列腺癌高低转移细胞株差异表达基因的筛选

目的：筛选高低转移能力人前列腺癌细胞株PC3M-1E8和PC3M-2B4间差异表达基因。方法：应用抑制性消减杂交（SSH）技术,对高转移能力人前列腺癌细胞株PC3M-1E8及其同源低转移细胞株PC3M-2B4进行2次消减杂交,第1次SSH实验,以PC3M-2B4细胞株为实验方,PC3M-1E8株为驱动方,构建正向消减文库。第2次实验则以PC3M-1E8株为实验方,PC3M-2B4为驱动方,构建反向消减文库。筛选出来的阳性克隆进行测序,并在GeneBank数据库中进行同源性比较后从中选取若干序列进行实时定量PCR验证。结果：2个消减文库共得到238个阳性克隆,从中各随机选取8个克隆测序并进行同源性分析,发现其中12条序列来自于11个已知基因,另外4条序列为新的未知功能的基因序列标签（EST）。结论：成功构建了高低转移力人前列腺癌细胞株的双向消减杂交文库。     

人大细胞肺癌高低转移株差异表达基因消减cDNA文库的构建和初步筛选

背景与目的 筛选肺癌转移相关基因有助于阐明肺癌侵袭转移的分子机理.为了筛选不同转移潜能肺癌的转移相关差异表达基因,本研究构建不同转移潜能的人大细胞肺癌细胞株NL9980和L9981间差异表达基因的消减cDNA文库,并对消减文库进行初步筛选.方法 应用抑制消减杂交技术构建人大细胞肺癌高低转移株NL9980与L9981间差异表达基因的正向消减cDNA文库和反向消减cDNA文库,利用α互补原理,经蓝白菌落初步筛选获得阳性克隆,应用斑点杂交的方法对正向和反向消减cDNA文库进行杂交筛选.结果 成功构建了人大细胞肺癌高低转移株差异表达基因的正向消减cDNA文库和反向消减cDNA文库.经蓝白菌落筛选和斑点杂交,正向消减文库获得了307个阳性克隆,反向消减文库获得了78个阳性克隆.结论 抑制消减杂交是克隆差异表达基因的有效方法,利用此方法可以成功构建人大细胞肺癌高低转移株差异表达基因消减cDNA文库.不同转移潜能人大细胞肺癌细胞株中存在可能与转移相关的差异表达基因.     

应用抑制性消减杂交技术克隆人肺鳞癌差异性表达基因

目的 克隆人肺鳞癌肿瘤差异性表达基因。方法 应用抑制性消减杂交技术（suppression subtractive hybridization,SSH)构建人肺鳞癌cDNA消减杂交文库，筛选后挑选阳性克隆进行测序，并在Gen Bank数据库中进行同源性比较，最后经RT－PCR验证。结果 成功克隆10个差异基因片段，其中2个为新基因（GenBank登录号分别为：C20：AF363068；C34：AY032661）。结论 抑制性消减杂交技术是克隆差异表达基因及发现新基因的有效方法。     

高低淋巴道转移力小鼠肝癌细胞间抑制性消减杂交文库的建立

目的:以抑制性消减杂交技术分离高低淋巴道转移力小鼠肝癌细胞HcaF和HcaP间差异表达的基因。方法:采用抑制性消减杂交技术,以高低转移力小鼠肝癌细胞HcaF为检测子,以低转移力HcaP细胞为驱赶子,分离高转移力癌细胞中高表达的基因的cDNA片段。将差异表达基因的cDNA片段插入T/A克隆载体,并通过热转化的方法转化大肠埃希菌DH5α,建立了高低淋巴道转移力小鼠肝癌细胞间抑制性消减杂交文库。以菌液PCR的方法检测随机挑选的白色菌落中插入片段的出现频率。提取14个重组质粒进行序列分析。结果:在消减文库中共获800个白色菌落,对随机挑选的160个白色菌落进行菌液PCR扩增,发现95%的白色菌落中含有100～700bp的插入片段。对重组质粒的序列分析和同源性比对发现,所获的14个序列中3个为已知基因,分别来自小鼠热休克蛋白、ribosomalproteinS13、ethanolinduced6基因;4个可能来源于新基因;3个与3个不同的EST同源。结论:成功构建了高低淋巴道转移力小鼠肝癌细胞间抑制性消减杂交文库,为今后高通量筛选癌淋巴道转移相关基因,奠定了坚实的基础。     

拮抗凋亡转录因子基因在高转移人成骨肉瘤细胞系中的高表达

背景与目的：成骨肉瘤是青少年中最常见的恶性骨肿瘤,具有易发生肺转移的特点。尽管目前已能够成功地控制原发瘤,但是仍有30％以上的患者在5年内死于肺转移。更好地理解调节转移过程的分子机制,为设计有效的治疗方案提供生物学基础,我们用原位移植的方法建立了人成骨肉瘤细胞系SOSP－9607裸鼠转移模型,用这一模型筛选出了高转移细胞系SOSP－M。本研究旨在通过比较两个细胞系的基因表达水平来克隆与骨肉瘤转移相关的基因,探讨成骨肉瘤转移的分子机制。方法：采用抑制性消减杂交技术建立人成骨肉瘤高转移细胞株SOSP－M的消减文库;用差异筛选技术筛选出阳性克隆;对部分克隆进行测序和同源性分析,用Northern杂交后转录多聚酶链式反应技术对SOSP－M中表达上调的有意义的克隆在低转移细胞系SOSP－9607,OS－9901,高转移细胞系SOSP－M和裸鼠肺转移结节中的表达情况进行了分析。结果：在高转移细胞株SOSP－M中有2个阳性克隆均与人凋亡对抗转录因子（apoptosis antagonizing transciption factor)同源（99％同源）。Northern杂交及反转录PCR证实这个基因在高转移细胞和裸鼠肺转移结节中高表达,而在低转移人成骨肉瘤细胞系SOSP－9607和OS－9901中表达微弱。结论：对抗凋亡转录因子在促进肿瘤细胞转移中可能起重要作用。     

哈萨克族食管癌差异表达基因的研究

 目的 筛选并克隆在哈萨克族食管鳞癌与正常食管组织之间差异表达的基因。方法 (1)应用抑制性消减杂交(SSH)进行基因差异表达分析，构建哈族食管鳞癌组织和正常食管黏膜组织之间差异表达的cDNA消减文库；(2)克隆、鉴定食管癌组织特异表达的基因；(3)登录Genbank．运用Blastn程序进行同源性分析。结果 成功构建了消减效率高的哈族食管鳞癌cDNA消成文库．对其中6个克隆的插入cDNA片断进行测序，经检索Genbank表明：这些差异表达基因与跨膜受体、乳腺癌转录因子、蛋白剪接基因及染色体1、8不同区域有较高的同源性。结论 通过抑制性消减杂交技术构建了哈族食管鳞癌cDNA消减文库，并分析鉴定了部分差异表达基因，为进一步筛选鉴定食菅鳞癌特异性基因及其全长克隆、功能研究等提供了依据。     

利用反向mRNA斑点印迹从抑制消减杂交阳性克隆中筛选差异表达基因

目的:建立一种从抑制消减杂交阳性克隆中筛选差异表达基因的方法.方法:以阵列方式将抑制消减杂交阳性克隆的PCR产物点加于尼龙膜上,以标记polyA+RNA为探针进行反向杂交,化学发光法检测,在图象分析仪上进行光密度扫描,计量平均单位面积光密度,扣除背景,计算两个阵列各对应点之间光密度值的比值R(ratio).差异表达基因的阳性判定标准为R值大于或等于2.00.结果:通过反向mRNA斑点印迹技术可以从抑制消减杂交阳性克隆中把差异表达基因有效地筛选出来.结论:反向mRNA斑点印迹技术是一种筛选抑制消减杂交差异表达基因的有效方法.     

应用抑制性消减杂交技术分离E1A药敏相关基因

背景与目的：大量研究已经证明,腺病毒5型E1A基因能抑制肿瘤的生长和转移,逆转其恶性表型,特别是能提高肿瘤细胞对多种化疗药物的敏感性,对射线也具有明显的增敏作用。但E1A基因通过哪些基因发挥作用还不知道。本研究利用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术在药物敏感的肿瘤细胞中分离差异表达的E1A药敏相关基因。方法：以E1A蛋白处理的人头颈淋巴结转移肿瘤细胞LN686为实验组,以亲本LN686细胞为对照组,提取mRNA,构建消减cDNA文库。随机挑取克隆,采用斑点杂交技术鉴定差异基因片段的表达水平,分析所获cDNA核苷酸序列,并在GenBank中进行比较,半定量RT-PCR鉴定实验组和对照组中新基因的mRNA水平。结果：文库包含约7000个阳性克隆,随机挑取：384个克隆进行PCR鉴定,其中．362个有插入片段,通过斑点杂交技术,证实这些基因在实验组中表达水平较对照组显著提高。将这362个克隆进行测序并经过BLAST分析,表明10个为新基因,已在GenBank中登录。对其中7个新基因进行半定量RT—PCR检测,证明经E1A蛋白处理的LN686细胞中,新基因的表达水平明显高于亲本LN686细胞,相差3～8倍。结论：应用抑制性消减杂交技术筛选到10个新基因片段,为进一步克隆其全长基因、研究其功能打下基础。     

肺腺癌多药耐药细胞特异表达基因的克隆与鉴定

目的：克隆和筛选肺腺癌多药耐药细胞特异表达基因,方法：将肺腺癌多药耐药细胞（SPC－A－1／CDDP）作为实验方,肺腺癌细胞（SPC－A－1）作为对照方,应用抑制消减杂交技术,构建实验方特异表达cDNA消减文库;用斑点杂交法初步筛选cDNA消减文库后,将获得的阳性克隆进行测序和同源性分析（Genbank),对新的cDNA序列进行Northern blot杂交验证。结果：建立了一个肺腺癌多药耐药细胞（SPC－A－1／CDDP）特异表达cDNA消减文库,斑点杂交法初步筛选显示23个个克隆中有SPC－A－1／CDDP特异表达cDNA片断,测序和同源性分析表明2个cDNA片断为新序列,其余cDNA片段与已知基因有93％－100％的同源性,Northern blot杂交结果表明2个新的cDNA片断来自SPC－A－1／CDDP细胞。结论：2个新的cDNA序列可能为未知肺腺癌多药耐药相关基因序列;抑制消减杂交法是克隆特异表达基因的有效方法。     

正常肝组织与肝硬化组织差异表达基因的削减cDNA文库的构建及差异基因的初步筛选

目的构建人正常肝组织与肝硬化组织差异表达基因的削减cDNA文库.方法采用抑制削减杂交技术,以正常肝组织及有肝癌背景的肝硬化组织作为对比材料.分离出mRNA,经反转录后,通过两轮杂交、两次PCR和T/A克隆构建了两种组织间差异表达基因的cDNA削减文库.结果挑取70个克隆进行酶切和PCR鉴定,显示65个克隆有250～2000 bp插入片段.结论用SSH和T/A克隆技术成功构建了正常肝组织与肝硬化组织差异表达基因的削减cDNA文库.该文库的建立为进一步筛选、鉴定出肝癌发生过程中的相关调控基因奠定了基础,也有助于阐明肝硬化在肝癌发生过程中所起的作用.     

K562细胞消减cDNA文库的构建及初步鉴定

背景与目的:消减杂交技术是一种寻找和克隆差异基因的方法。本研究目的是通过快速、高质量构建消减cDNA文库,筛选K562细胞中差异表达基因。方法:以用限制性显示(restriction display,RD)技术制备的K562细胞cDNA片段作为消减对象,以正常人淋巴细胞的Sau3AⅠ酶解cDNA片段对其进行消减。经过消减后的RD片段被分组扩增出来,并克隆于T载体中,挑选阳性克隆进行测序并进行初步分析。结果:构建的K562细胞消减cDNA文库,包含360个阳性克隆,插入片断大小范围在200～800bp之间,选取50个克隆进行测序分析,结果为来源于42个已知基因。结论:利用自行建立的消减杂交法,成功构建了特异性K562细胞消减cDNA文库,文库质量可靠,可用于进一步筛选及克隆K562细胞中差异表达基因。     

人胃印戒细胞癌组织差异表达基因克隆的研究

目的:分离胃印戒细胞癌组织差异表达基因,探讨人胃印戒细胞癌发生的分子机制。方法:采用抑制性消减杂交技术(SSH),构建人胃印戒细胞癌组织cDNA 消减文库;随机挑选部分阳性克隆测序,与GenBank中的已知序列进行基因同源性分析,并进一步探讨基因功能。结果:成功构建高消减效率的人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库,并分离出多个差异表达基因片段:其中1 条与染色体序列相似,可能代表未知的新基因序列,已被GenBank 接收(注册号:CN446913);其他多为已知的肿瘤相关基因的部分片段。结论: 1 )SSH技术是分离差异表达基因的有效方法;2)胃印戒细胞癌的发生发展与多种基因表达异常有关;     

Differential expression of Axl in hepatocellular carcinoma and correlation with tumor lymphatic metastasis

Protein kinases play important roles in tumor development and progression. A variety of members of the signal transduction enzymes serve as targets for therapeutic intervention in cancer. The dysregulation of Axl receptor and its ligand growth arrest‐specific 6 (Gas6) is implicated in the pathogenesis of several cancers. In this study, the differential expressions of Axl were investigated in mouse hepatocarcinoma cell lines Hca‐F and Hca‐P, which have high‐ and low‐metastatic potential to lymph nodes. Experimental inhibition of Axl by siRNA assessed further the metastatic potential of Axl. The results showed that down‐regulation of Axl expression attenuated Hca‐F cells proliferation, migration, and invasion in vitro, as well as inhibited metastasis to peripheral lymph nodes in vivo. Further analysis demonstrated that the addition of exogenous Gas6 mediated the migration and invasion of Hca‐F cells both in vitro and in vivo through Axl. Furthermore, Gas6 stimulation of Axl in Hca‐F cells resulted primarily in the down‐regulation of Cyr61, a member of the CCN protein family involved in tumor progression. These data suggest that Axl acts as a tumor lymphatic metastasis‐associated gene, and may function partly through the regulation of Cyr61. © 2010 Wiley‐Liss, Inc.     

Identification of genes differentially expressed in association with acquired cisplatin resistance

The goal of this study was to identify genes whose mRNA levels are differentially expressed in human cells with acquired cisplatin (cDDP) resistance. Using the parental UMSCC10b head and neck carcinoma cell line and the 5.9-fold cDDP-resistant subline, UMSCC10b/Pt-S15, two suppressive subtraction hybridization (SSH) cDNA libraries were prepared. One library represented mRNAs whose levels were increased in the cDDP resistant variant (the UP library), the other one represented mRNAs whose levels were decreased in the resistant cells (the DOWN library). Arrays constructed with inserts recovered from these libraries were hybridized with SSH products to identify truly differentially expressed elements. A total of 51 cDNA fragments present in the UP library and 16 in the DOWN library met the criteria established for differential expression. The sequences of 87% of these cDNA fragments were identified in Genbank. Among the mRNAs in the UP library that were frequently isolated and that showed high levels of differential expression were cytochrome oxidase I, ribosomal protein 28S, elongation factor 1alpha, alpha-enolase, stathmin, and HSP70. The approach taken in this study permitted identification of many genes never before linked to the cDDP-resistant phenotype.