角膜缘干细胞培养后移植的研究进展

眼表的许多疾病都是由于角膜缘干细胞功能障碍引起，角膜缘干细胞培养后移植是治疗角膜缘干细胞功能障碍的有效手段。本文将对培养的角膜缘干细胞移植的材料，角膜缘干细胞培养后自体和异体移植以及移植术后的处理等方面的研究作一简要综述。     

人角膜缘干细胞的原代培养和生物学鉴别

目的 探讨人角膜缘干细胞（stem cell,SC)体外培养方法并观察其生物学活性。方法 应用消化培养法对人角膜缘组织进行原代培养,记录其生长特性。待细胞生长至80％汇合时,分别采用针对64KD角蛋白的AE5、针对一组酸性角蛋白的AE1单克隆抗体,抗增殖细胞核抗原单克隆抗体（anti-proliferatin cell nuclear antigen,PCNA),针对50KD烯醇酶特异的单克隆抗体4G 10．3,通过间接免疫荧光细胞化学染色对培养细胞进行鉴别。结果 人角膜缘组织应用消化培养法在6－7d达到80％汇合状态,应用间接免疫细胞化学染色,AE1、AE5染色,胞浆染色呈阳性。PCNA染色、细胞核染色阳性,4G 10．3亦可见阳性结果。结论 应用消化培养法可成功地对人角膜缘组织进行原代培养,培养后细胞既可保持角膜上皮特性,又含有具有强增殖潜力的原始细胞,适合用于临床移植治疗眼表疾病。     

角膜缘干细胞体外培养的研究进展

角膜缘干细胞是位于角膜缘Vogt栅栏区的一种成体单能干细胞,其可通过自我更新以补充角膜上皮的损伤修复,在维持正常角膜上皮完整性、角膜透明度以及维持正常视力中发挥着重要作用。各种原因造成的角膜缘干细胞缺失将导致患者角膜混浊、眼表血管化,最终失明,目前治疗相关疾病的主要方法为体外培养角膜缘干细胞后再行移植治疗,其中如何高效地体外扩增角膜缘干细胞成为治疗成功与否的关键,本文就角膜缘干细胞定位、获取方法以及体外扩增方式等进行综述。     

以不同性质羊膜为载体培养人角膜缘干细胞的生物学特性

目的:观察并比较在完整羊膜和去上皮层羊膜这两种不同性质的载体羊膜上培养的人角膜缘干细胞的生物学特性。方法:采用组织块培养法,将角膜缘组织块种植于完整羊膜(I组)和去上皮层羊膜(D组)上进行培养,并对细胞的生长特点,超微结构以及免疫荧光染色结果进行观察。结果:在这两种性质的羊膜上人角膜缘干细胞均可生长形成单层,扫描电镜观察见细胞之间存在细胞连接。免疫荧光细胞化学染色结果显示,I组细胞BrdU标记阳性率高于D组(I组vsD组,P<0.05),而对AE5和缝隙连接蛋白(Cx43)表达的阳性率低于D组(I组vsD组,P<0.05),对增殖细胞核抗原(PCNA)阳性表达两组均较高。结论:人角膜缘干细胞均可在这两种性质的羊膜上生长,在去上皮羊膜上生长的干细胞有不同程度的分化,而完整羊膜能更好的维持干细胞特性。     

低温冷冻对角膜缘干细胞生物学特性的影响

目的 评价低温冷冻保存对体外培养兔角膜缘干细胞生物学特性的影响.设计实验研究.研究对象新西兰白兔.方法 新西兰白兔20只（40眼）,制备2 mm周边角膜和2 mm球结膜的环形浅层角膜缘植片,待形成细胞单层后,将培养的细胞低温冻存1个月,然后复苏培养.将未冻存的细胞和冻存复苏后的细胞采用免疫细胞荧光染色、流式细胞仪检测,鉴定培养细胞的生物学特性,通过倒置显微镜、MTT比色法比较传代培养的角膜缘干细胞低温保存前后的形态结构和特性.主要指标角膜缘干细胞活性及生物学特性.结果 显微镜下观察冻存复苏后的细胞,与未冻存细胞相比,细胞状态差,贴壁时间晚,核浆比变小,形态不规则;免疫荧光细胞染色检测ABCG2单克隆抗体阳性率未冻存细胞为81.7%,低温冻存细胞降至46.9%,差异有统计学意义（P〈0.05）;流式细胞仪检测低温冻存细胞与未冻存细胞角膜缘干细胞占总细胞的比例分别为0.90%和2.43%,差异有统计学意义（P〈0.05）;MTT法检测低温冻存的细胞比未冻存细胞增殖活性降低,差异有统计学意义（P〈0.05）.结论 低温冻存后角膜缘干细胞的活性和生物学特性均受到严重影响,其冻存方法和复苏技术有待进一步改进.     

供体因素对人角膜缘干细胞培养影响的研究

目的观察供体年龄及角膜新鲜程度对人角膜缘干细胞体外培养的影响。方法168例人角膜，按年龄分为A、B、C三组：按供体死亡至被培养的时间分为新鲜组和陈旧组。采用组织块培养法进行细胞培养，观察各组细胞开始生长时间及培养生长率。结果细胞开始生长时间及培养生长率在不同年龄组之间差异无显著性意义；但在较新鲜组与陈旧组之间差异有显著性意义；组织越新鲜，细胞生长越快，生长率越高。结论选取较新鲜的供体(≤8天)进行培养可获得好的培养效果，而不需过多考虑年龄因素。     

角膜缘干细胞培养及研究进展

角膜缘干细胞是一种特殊类型的细胞,位于角膜缘基底上皮层,在角膜上皮更新和创伤愈合中起重要作用。对于角膜缘干细胞缺乏或功能障碍的疾病,培养角膜缘干细胞进行移植将是一种重要且有效的治疗方法。对角膜缘干细胞的生物学特性和解剖定位、影响培养的干细胞增殖的调控因素、培养的角膜缘于细胞移植、移植所需载体的选择等方面的研究进展作一综述。     

兔角膜缘干细胞的体外培养

目的 探寻兔角膜缘干细胞体外培养方法。方法 分别用20％小牛血清营养液和20％胎牛血清营养液兔角膜缘干细胞行体外培养，观察细胞贴壁生长情况；同时对生长良好的原代细胞进行消化传代，进一步观察传代细胞的形态和生长情况。结果 20％胎牛血清营养液组，角膜缘干细胞在培养48－72h有80％贴壁生长，7－10天形成良好单层，细胞呈圆形、卵圆形或多边形，类似角膜上皮细胞；传代培养细胞形态仍正常，生长良好，但混有成纤维细胞。20％小牛血清营养液培养72h，仅有20％细胞贴壁生长，且细胞形态极不规则，有细胞“拉网”现象，培养14天仍未形成单层。结论 角膜缘干细胞的培养较常规细胞培养难，需要特殊培养基。20％胎牛血清营养液能作为角膜缘干细胞培养的基础液。     

人角膜缘干细胞的体外培养及鉴定

目的探讨人自体角膜缘干细胞（LSCs）体外培养及鉴定的方法。方法将供体新鲜人角膜缘组织在制备的含20％胎牛血清DMEM／F12培养基的羊膜载体上应用组织块培养法进行体外培养,对培养获得的LSCs用苏木精-伊红染色在倒置显微镜下进行形态学观察,用免疫荧光技术鉴定培养的LSCs细胞。结果组织块静置2h后贴壁良好,3～4d细胞从组织块边缘荫出,7～10d细胞出现生长高峰,12～14d形成良好的细胞单层。细胞形态呈多边彤、圆形、卵圆形和梭形。第14天时行间接免疫荧光染色,可见大量细胞表达p63,呈细胞质的绿色荧光;少量细胞表达AE5,呈细胞质的绿色荧光和细胞核的红色荧光。结论组织块培养法体外培养的人LSCs具有与正常人LSCs相一致的生物学特性。     

胎儿角膜缘干细胞的培养和生物学特性观察

角膜缘干细胞(limbalstemcells,LSC)及利用角膜缘干细胞移植(limbalstemcellstransplantation,LSCT)重建眼表的研究正在国内外广泛展开。而实行LSCT其前提是必须有LSC供体,尽管当前LSC的来源有自体、同种异体和体外培养的自体及同种异体等几种,但均有其局限性。人胎儿细胞的增殖和分化潜能较成人同类细胞大,此外,胎儿的免疫系统没有发育完善,胎儿组织存在免疫宽容现象[1]。贾卉等[2]研究还发现,胎儿角膜中与免疫反应有关的细胞和细胞间黏附分子较成人少,故胎儿器官、组织或细胞移植较少甚至无免疫排斥反应发生。因此,为探寻一种新的…     

角膜缘干细胞不同载体培养的研究进展

角膜缘干细胞缺乏所致眼表疾病已成为重要的致盲角膜病之一,而体外培养的角膜缘干细胞移植是治疗眼表疾病的重要途径。其中载体的选择是成功的关键。本文将从不同载体的生物特性,用于培养干细胞的可行性及优缺点等方面,阐述选择合适的载体培养角膜缘干细胞的研究进展。     

体外兔胚胎成纤维细胞为饲养层克隆兔角膜缘干细胞

目的研究兔胚胎成纤维细胞体外克隆兔角膜缘干细胞。方法兔胚胎成纤维细胞经丝裂霉素C(MMC)处理成饲细胞,用消化法培养兔角膜缘基底层细胞并接种于含有经MMC处理饲细胞的12孔培养板,进行原代培养。观察其光镜特征、电镜结构,用间接免疫细胞化学染色等对克隆的细胞进行综合鉴别。结果克隆的细胞呈典型的上皮细胞形态,电镜下可见微绒毛、桥粒、张力丝等典型上皮细胞结构,单克隆抗体AE1、PCNA染色后细胞大多数阳性,单克隆抗体AE5染色后细胞染色偶见阳性。结论体外兔胚胎成纤维细胞为饲养层成功地克隆出兔角膜缘干细胞。     

角膜缘组织定位培养和冷冻后培养的实验研究

目的验证角膜缘干细胞的组织学定位,探讨低温冷冻保存对其增殖活性的影响。方法取新鲜角膜缘上皮组织和相应部位浅层巩膜组织各10块进行体外细胞培养,对比观察细胞生长情况。取冷冻保存的角膜缘上皮组织14例,观察体外培养后细胞生长情况。通过免疫组化方法检测冷冻保存的角膜缘上皮细胞的增殖活性和培养后单层细胞K3角蛋白的表达。结果10例新鲜角膜缘上皮组织培养后,7例有上皮细胞生长,1周形成细胞单层;10例浅层巩膜组织培养后未见细胞生长。14例冷冻角膜缘上皮组织培养后,4例有上皮细胞生长,9d形成细胞单层。5例冷冻角巩膜环组织冰冻切片中,3例可见角膜缘上皮基底细胞PCNA表达阳性。培养细胞对K3角蛋白特异性的AE-5单克隆抗体免疫反应阳性。结论角膜缘干细胞定位于角膜缘上皮基底部,低温冷冻保存的角膜缘干细胞组织可以保持增殖活性,体外培养后生长分化成为角膜上皮。     

Quantification of corneal neovascularization after ex vivo limbal epithelial stem cell therapy

AIM: To assess cultured limbal epithelial stem cell transplantation in patients with limbal stem cell deficiency by analyzing and quantifying corneal neovascularization.METHODS: This retrospective, interventional case series included eight eyes with total limbal stem cell deficiency. Ex vivo limbal epithelial stem cells were cultured on human amniotic membrane using an animal-free culture method. The clinical parameters of limbal stem cell deficiency, impression cytology, and quantification of corneal neovascularization were evaluated before and after cultured limbal stem cell transplantation. The area of corneal neovascularization, vessel caliber (VC), and invasive area (IA) were analyzed before and after stem cell transplantation by image analysis software. Best-corrected visual acuity (BCVA), epithelial transparency, and impression cytology were also measured.RESULTS: One year after surgery, successful cases showed a reduction (improvement) of all three parameters of corneal neovascularization [neovascular area (NA), VC, IA], while failed cases did not. NA decreased a mean of 32.31% (P=0.035), invasion area 29.37% (P=0.018) and VC 14.29% (P=0.072). BCVA improved in all eyes (mean follow-up, 76±21mo). Epithelial transparency improved significantly from 2.00±0.93 to 0.88±1.25 (P=0.014). Impression cytology showed that three cases failed after limbal epithelial stem cell therapy before 1y of follow-up.CONCLUSION: This method of analyzing and monitoring surface vessels is useful for evaluating the epithelial status during follow-up, as successful cases showed a bigger reduction in corneal neovascularization parameters than failed cases. Using this method, successful cases could be differentiated from failed cases.     

体外培养自体角膜缘干细胞移植术治疗翼状胬肉1例

目的：观察体外培养自体角膜缘干细胞移植术治疗翼状胬肉的临床效果。方法：翼状胬肉11例12眼采取显微镜下手术切除局部病灶联合体外培养自体角膜缘干细胞移植术，术后随访6～15(平均10)mo。结果：术后角膜上皮愈合良好，无排斥反应或其它并发症发生。随访期间1眼复发，复发率为8％。结论：体外培养自体角膜缘干细胞移植术为受损的角膜缘提供新的健康干细胞，可有效地防止翼状胬肉复发，简单、安全、有效。