角膜缘组织定位培养和冷冻后培养的实验研究

目的验证角膜缘干细胞的组织学定位,探讨低温冷冻保存对其增殖活性的影响。方法取新鲜角膜缘上皮组织和相应部位浅层巩膜组织各10块进行体外细胞培养,对比观察细胞生长情况。取冷冻保存的角膜缘上皮组织14例,观察体外培养后细胞生长情况。通过免疫组化方法检测冷冻保存的角膜缘上皮细胞的增殖活性和培养后单层细胞K3角蛋白的表达。结果10例新鲜角膜缘上皮组织培养后,7例有上皮细胞生长,1周形成细胞单层;10例浅层巩膜组织培养后未见细胞生长。14例冷冻角膜缘上皮组织培养后,4例有上皮细胞生长,9d形成细胞单层。5例冷冻角巩膜环组织冰冻切片中,3例可见角膜缘上皮基底细胞PCNA表达阳性。培养细胞对K3角蛋白特异性的AE-5单克隆抗体免疫反应阳性。结论角膜缘干细胞定位于角膜缘上皮基底部,低温冷冻保存的角膜缘干细胞组织可以保持增殖活性,体外培养后生长分化成为角膜上皮。     

上皮性钙黏附蛋白在人角膜上皮中的表达研究

目的 研究上皮性钙黏附蛋白（E-cadherin）在人角膜上皮中的分布。方法低钙培养基培养人角膜缘干细胞．并取人角膜中央上皮及角膜边缘上皮组织，分别使用免疫组织化学及免疫细胞化学方法检测E-cadherin在人角膜中央上皮、角膜边缘上皮及低钙培养的人角膜缘干细胞中的分布情况。结果E-cadherin在角膜边缘上皮全层细胞即处于分化阶段的短暂扩充细胞中大量表达，在抑制干细胞分化、促进增殖的低钙培养的人角膜缘干细胞中表达减少，在终末分化细胞即角膜中央上皮细胞中没有表达。结论E-cadherin在处于分化阶段的角膜上皮细胞中有大量的表达。     

人角膜缘干细胞的原代培养和生物学鉴别

目的 探讨人角膜缘干细胞（stem cell,SC)体外培养方法并观察其生物学活性。方法 应用消化培养法对人角膜缘组织进行原代培养,记录其生长特性。待细胞生长至80％汇合时,分别采用针对64KD角蛋白的AE5、针对一组酸性角蛋白的AE1单克隆抗体,抗增殖细胞核抗原单克隆抗体（anti-proliferatin cell nuclear antigen,PCNA),针对50KD烯醇酶特异的单克隆抗体4G 10．3,通过间接免疫荧光细胞化学染色对培养细胞进行鉴别。结果 人角膜缘组织应用消化培养法在6－7d达到80％汇合状态,应用间接免疫细胞化学染色,AE1、AE5染色,胞浆染色呈阳性。PCNA染色、细胞核染色阳性,4G 10．3亦可见阳性结果。结论 应用消化培养法可成功地对人角膜缘组织进行原代培养,培养后细胞既可保持角膜上皮特性,又含有具有强增殖潜力的原始细胞,适合用于临床移植治疗眼表疾病。     

人角膜上皮干细胞的低钙培养及碱性成纤维细胞生长因子对其增殖的影响

目的 探讨如何获取较纯的人角膜上皮干细胞,以及碱性成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor,bFGF)对人角膜缘上皮干细胞增殖的影响,为干细胞的移植奠定基础。方法 采用低钙培养法对人角膜缘体外培养,将培养的细胞行AE5免疫荧光染色,观察培养细胞的分化状态,并将其分别置于不同浓度的bFGF中,通过数码照相技术和计算机图像分析系统,检测角膜干细胞的增殖。结果 体外培养的细胞以角膜上皮干细胞为主;不同浓度的bFGF(1-100ng/ml)可促进体外培养的人角膜缘上皮干细胞的增殖（P＜0．001）,而各实验组间比较,差异无显著性（P＞0．05）。结论 将无钙培养液与低钙培养基组合,可获得较纯的、未分化的角膜干细胞;bFGF对人角膜上皮干细胞的增殖具有重要的促进作用。计算机图像分析系统适用定量检测呈膜状生长的上皮细胞增殖,是一种新颖、实用、准确的检测手段。     

高糖抑制角膜缘干细胞间质性及其迁移能力的研究

目的　探讨高糖环境对角膜缘干细胞增殖、迁移能力及表面分子标志的影响。方法　通过细胞免疫荧光、细胞增殖检测（CCK-8）、划痕和Transwell实验观察角膜缘干细胞在高糖环境下的迁移及增殖能力的改变。选取16只SPF级大鼠用链脲霉素进行糖尿病造模，14只正常SPF级大鼠作为对照组，刮除两组大鼠角膜上皮观察上皮创伤愈合情况，采用HE染色和免疫组织化学染色探讨糖尿病对角膜缘干细胞表面分子标志及细胞状态的影响。结果　高糖可导致体外培养的角膜缘干细胞增殖减慢，24 h、48 h及72 h增殖率为0.728、0.345及0.395，较对照组明显降低（P<0.05），迁移功能障碍（48 h时正常对照组迁移率为100%，高糖组为17.6%）；高糖组细胞表面分子β-catenin和vimentin的mRNA和蛋白表达水平降低、细胞内定位异常。糖尿病大鼠角膜上皮创伤后愈合延迟，角膜组织HE染色发现糖尿病大鼠角膜上皮层变薄，基底细胞结构紊乱、形态异常。角膜免疫组织化学染色发现与对照组相比，角膜基底细胞的vimentin和β-catenin蛋白表达明显降低。结论　高糖可导致角膜缘干细胞迁移障碍和增殖抑制，其损伤机制与高糖导致角膜缘干细胞表面分子标志的丢失有关。     

角膜缘干细胞在重建眼表中的作用研究进展

正常角膜上邓小平的完整性依赖于基底层角膜缘干细胞的不断增殖。角膜缘于细胞对角膜上皮的再生起着重要的作用。如果角膜缘干细胞因各种原因严重缺乏，会导致持续性角膜上皮糜烂、角膜新生血管和假性翼状胬肉形成，角膜的完整性和透明性将受到破坏。本对角膜缘干细胞的性质、特点、分布、检测、各种干细胞移植术、干细胞的体外培养及其适宜的载体等进行综述，以便对角膜缘干细胞进行更深入的研究。     

模拟角膜缘干细胞微环境诱导人多潜能干细胞分化为角膜上皮细胞的研究

目的：探讨模拟角膜缘干细胞(LSCs)微环境诱导人多潜能干细胞(hiPSCs)分化为角膜上皮细胞的可行性。方法：体外建立hiPSCs细胞系，利用transwell体系将hiPSCs与角膜基质细胞共培养模拟角膜缘干细胞微环境，添加小分子骨形态发生蛋白4(BMP4)和特异性转化生长因子β抑制剂(SB431542)，诱导hiPSCs向角膜上皮细胞分化。采用免疫荧光染色、流式细胞方法检测角膜上皮细胞特异标志物 CK3和CK12，角膜上皮细胞前体CK15，角膜缘干细胞标志物ABCG5的表达。结果：hiPSCs体外培养增殖活跃，免疫荧光染色显示干细胞特异性标志物OCT4、SOX2、TRA-1-60、NANOG呈阳性。采用transwell体系将hiPSCs与角膜基质细胞共培养，免疫荧光染色结果显示角膜缘干细胞标志物ABCG5及角膜上皮细胞前体标志物CK15阳性，角膜上皮细胞标志物CK3及CK12阴性； 在共培养的基础上添加小分子BMP4和SB431542，免疫荧光染色及流式细胞检测结果显示角膜上皮细胞特异性标志物CK3阳性表达，且随分化时间延长表达比例增高。结论：模拟角膜缘干细胞微环境同时添加小分子SB431542及BMP4，可成功诱导体外培养的hiPSCs向角膜上皮细胞分化。     

体外培养不同代角膜缘干细胞特性分析

目的比较不同代角膜缘干细胞的生物学特性,为角膜缘细胞移植在临床中的氉应用提供依据。方法组织块培养法体外培养角膜缘干细胞,光镜观察、HE染色和免疫荧光染色分析原代、第1代和第2代角膜缘细胞形态学特性;流式细胞技术定量检测原代、第1代和第2代角膜缘细胞ABCG2表达;MTT比色法测定体外培养原代、第1代和第2代角膜缘干细胞的增殖活性变化。结果倒置相差显微镜下可见原代细胞培养24h有单个细胞从组织块边缘迁出,48h细胞局部可见拉网样生长趋势,72h出现大片细胞,细胞呈现多边形或多角形,96h细胞几乎铺满整个培养板。随着传代次数的增加,细胞形态变得不规则,CK3单克隆抗体表达阳性率逐渐增强;p63单克隆抗体原代和第1代细胞间表达阳性率无明显差别,第2代细胞表达量明显减弱。流式细胞检测显示原代、第1代和第2代细胞ABCG2表达阳性率分别为13.41%、22.96%和4.43%。MTT结果显示随传代次数增加细胞增殖活性逐渐下降。结论原代和第1代角膜缘干细胞可以作为制备组织工程角膜上皮细胞膜片的较理想种子细胞。     

角膜缘干细胞在重建眼表中的作用研究进展

正常角膜上皮的完整性依赖于基底层角膜缘干细胞的不断增殖。角膜缘干细胞对角膜上皮的再生起着重要的作用。如果角膜缘干细胞因各种原因严重缺乏 ,会导致持续性角膜上皮糜烂、角膜新生血管和假性翼状胬肉形成 ,角膜的完整性和透明性将受到破坏。本文对角膜缘干细胞的性质、特点、分布、检测、各种干细胞移植术、干细胞的体外培养及其适宜的载体等进行综述 ,以便对角膜缘干细胞进行更深入的研究。     

不同移植手术治疗角膜缘干细胞缺损的实验研究

目的探讨以人羊膜为载体培养的角膜缘干细胞，自体及异体移植治疗全角膜缘干细胞缺损。方法制作兔眼角膜缘干细胞完全缺损3个月的模型。实验动物随机分为自体移植组和异体移植组，前者取对侧眼角膜缘组织，后者取异体兔眼角膜缘组织，均以去除上皮细胞的羊膜基底膜为载体，培养12d后行角膜缘干细胞羊膜移植术。术后观察3个月，以角膜上皮染色、角膜浑浊和新生血管3项指标进行临床疗效评定，通过病理检查评估术后角膜上皮修复情况，印迹细胞学检查移植前后角膜上皮的细胞表型。结果体外培养的兔角膜缘干细胞可在羊膜上粘附生长并增生，体外培养12d可形成复层。自体移植组和部分异体移植组术后角膜上皮逐渐愈合，透明度提高，基质细胞浸润减轻，新生血管减退或消失。印迹细胞学检查显示：移植前角膜上皮细胞PAS阳性，而移植后转为阴性；组织病理学显示：移植前角膜上皮大部分缺损，移植后呈现角膜上皮结构。部分异体移植组术后出现了免疫排斥反应。结论兔自体角膜缘干细胞羊膜移植术可重建眼表；免疫排斥反应仍是异体角膜缘干细胞羊膜移植术失败的主要原因。     

深低温保存角膜缘组织的结构和增殖活性研究

目的 探讨深低温保存材料角膜缘组织的结构和增殖活性。方法 应用常规切片，HE染色及电镜检查观察深低温保存4个月的角膜缘组织的结构变化。应用免疫组织化学染色法对6片深低温保存4个月的角膜缘材料在刚复温时及于培养液中放置6d后的增殖细胞核抗原(PCNA)表达进行检测，2片新鲜角膜缘材料作为对照。结果 深低温保存4个月的角膜缘材料基本保持了其形态结构的完整性。新鲜角膜缘材料PCNA呈弱阳性表达，6片深低温保存材料在复温时其PCNA呈阴性表达，但当置于培养液中6d后，其PCNA呈阳性表达。结论 深低温保存4个月的角膜缘材料结构完整，且保持其增殖活性，可用于角膜缘移植。     

成人结膜干细胞定位特征的免疫组织化学研究

目的:研究成人结膜上皮细胞中,粘蛋白5AC(MUC5AC),角蛋白7,p63和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达及分布情况,探讨成人结膜上皮干细胞的定位特征。方法:获取角膜移植供者的睑球结膜,采用HE免疫组化染色法,观察MUC5AC,角蛋白7,p63和PCNA的表达及分布情况。结果:PCNA及p63表达情况一致,主要表达在睑缘皮肤黏膜交界处及近角膜缘结膜上皮深层细胞。角蛋白7在穹窿部球结膜的固有层中的腺体细胞有阳性表达,MUC5AC在各部位结膜上皮的杯状细胞的胞质阳性表达。结论:MUC5AC细胞角蛋白7和p63及PCNA在成人结膜上皮细胞的特征性表达情况可以推测具有分化潜力的结膜干细胞存在于睑缘皮肤黏膜交界处及近角膜缘球结膜上皮深层细胞。     

胎儿角膜缘干细胞的培养和生物学特性观察

角膜缘干细胞(limbalstemcells,LSC)及利用角膜缘干细胞移植(limbalstemcellstransplantation,LSCT)重建眼表的研究正在国内外广泛展开。而实行LSCT其前提是必须有LSC供体,尽管当前LSC的来源有自体、同种异体和体外培养的自体及同种异体等几种,但均有其局限性。人胎儿细胞的增殖和分化潜能较成人同类细胞大,此外,胎儿的免疫系统没有发育完善,胎儿组织存在免疫宽容现象[1]。贾卉等[2]研究还发现,胎儿角膜中与免疫反应有关的细胞和细胞间黏附分子较成人少,故胎儿器官、组织或细胞移植较少甚至无免疫排斥反应发生。因此,为探寻一种新的…     

组织块联合胰酶消化法培养兔角膜缘干细胞的初步探索

目的：建立一种简便、高效的兔角膜缘干细胞原代培养方法。

方法：获取兔角膜缘组织,采用组织块联合胰蛋白酶消化法进行兔角膜缘干细胞体外培养,倒置显微镜下观察细胞生长情况,HE染色观察细胞形态和结构特点,并运用免疫组织化学技术进行细胞鉴定。

结果：采用组织块联合胰蛋白酶消化法可以简便、快速地培养出兔角膜缘干细胞,显微镜下动态观察细胞生长良好,有较高的增殖能力; HE染色证实细胞形态和结构正常; AE5及P63免疫组织化学鉴定呈阳性。

结论：采用组织块联合胰蛋白酶消化共同培养的方法,建立了一种简便、高效的兔角膜缘干细胞原代培养模式。     

细胞周期依赖性激酶抑制剂P27,P21在人角膜上皮的表达研究

目的:探讨细胞周期依赖性激酶抑制剂(CKI)P27,P21 在角膜上皮细胞的表达情况。方法:应用 SP 免疫组化法,检测 P21,P27 等细胞周期依赖性激酶抑制剂和增殖细胞核抗原(PCNA)在角膜上皮不同部位的表达情况。结果:角膜缘上皮区 PCNA 呈阳性表达,主要位于基底细胞层,中央区角膜上皮内未见阳性表达,差异有显著意义(P <0.01);P27,P21 在中央区角膜上皮内呈阳性表达,角膜缘上皮内未见阳性表达,差异均有显著意义(P <0.01)。结论:细胞周期依赖性激酶抑制剂 P27,P21 和 PCNA 在角膜上皮不同部位的表达差异,提示在角膜缘上皮基底层内存在着一群有较高的增殖能力,处于 G1 期的细胞群,即干细胞。     

增殖细胞核抗原与bc1-2在培养的人视网膜色素上皮细胞的表达

目的观察培养的人视网膜色素上皮细胞（ｒｅｔｉｎａｌｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｓ，ＲＰＥ）的增殖细胞核抗原（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｃｅｌｎｕｃｌｅａｒａｎｔｉｇｅｎ，ＰＣＮＡ）和ｂｃ１－２的表达。方法用ＳＡＢＣ法对培养的人ＲＰＥ作鼠抗人ＰＣＮＡ单抗及兔抗人ｂｃ１－２抗体免疫组织化学染色。结果ＲＰＥ在接种后２４小时和４８小时，ＰＣＮＡ的阳性率分别为３１．２％和５０．６％，阳性染色位于细胞核内，斑块状。ｂｃ１－２的表达为７６％～９０％，阳性染色在细胞浆，细颗粒状。结论培养中一半ＲＰＥ有ＰＣＮＡ抗原表达，提示这些细胞处于Ｓ期；ｂｃ１－２抗原在大多数ＲＰＥ表达阳性。这些生物标记物可能与培养的ＲＰＥ生长活性有关。     

细胞周期依赖性激酶抑制剂P27、P21在人角膜上皮的表达研究

目的　探讨细胞周期依赖性激酶抑制剂 (CKI) P2 7、P2 1在角膜上皮细胞的表达情况。方法　应用 SP免疫组化法 ,检测 P2 7、P2 1等细胞周期依赖性激酶抑制剂和增殖细胞核抗原 (PCNA)在角膜上皮不同部位的表达情况。结果　角膜缘上皮区 PCNA呈阳性表达 ,主要位于基底细胞层 ,中央区角膜上皮内未见阳性表达 ,差异有显著意义 (P <0 .0 1) ;P2 7、P2 1在中央区角膜上皮内呈阳性表达 ,角膜缘上皮内未见阳性表达 ,差异均有显著意义(P <0 .0 1)。结论　细胞周期依赖性激酶抑制剂 P2 7、P2 1和 PCAN在角膜上皮不同部位的表达差异 ,提示在角膜缘上皮基底层内存在着一群有较高的增殖能力、处于 G1 期的细胞群 ,即干细胞     

增生细胞核抗原在视网膜色素上皮细胞表达及其反义寡核苷酸的抑制作用

目的 研究视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞中增生细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)表达及其反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides,AS ODN)对其表达和细胞增生的抑制作用，为增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)治疗探索基因治疗新途径。 方法 (1)体外培养兔眼RPE细胞，在不同时间采用链霉亲合素-生物素化过氧化物酶复合物(streptoavidin-biotin enzyme complex,SABC)免疫组织化学法检测PCNA的表达;(2)脂质体介导下不同浓度的PCNA AS-ODN和正义寡核苷酸(sense oligodeoxynucleotides,S-ODN)分别作用于体外培养的RPE细胞，采用免疫组织化学方法检测PCNA的表达;(3)四唑盐比色法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)检测在不同浓度的PCNA AS-ODN和S-ODN作用下RPE细胞生长活性及其生长抑制率。 结果 (1)体外培养兔眼RPE细胞表达PCNA，表达高峰为培养后48 h ;(2)在0.28、1.12 μmol/L AS-ODN 作用下，PCNA的表达明显受抑制;(3)0.28、1.12 μmol/L的PCNA AS-ODN 能明显抑制RPE细胞增生活性，并呈剂量依赖性，其生长抑制率分别达53%、81%。 结论 一定浓度PCNA AS-ODN能序列特异性地抑制RPE细胞PCNA表达和增生活性，有望进一步用于PVR的治疗实验研究。 (中华眼底病杂志, 2002, 18: 231-233)     

增殖细胞核抗原与bcl-2在培养的人视网膜色素上皮细胞的表达

目的观察培养的人视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelial cells，RPE）的增殖细胞核抗原（proliferative cell nuclear　antigen，PCNA）和 bc1-2的表达。方法用SABC法对培养的人RPE作鼠抗人PCNA单抗及兔抗人bcl-2抗体免疫组织化学染色。结果RPE在接种后24小时和48小时，PCNA的阳性率分别为31.2%和50.6%，阳性染色位于细胞核内，斑块状。bcl-2的表达为76%～90%，阳性染色在细胞浆，细颗粒状。结论培养中一半RPE有PCNA抗原表达，提示这些细胞处于S期；bcl-2抗原在大多数RPE表达阳性。这些生物标记物可能与培养的RPE生长活性有关。(中华眼底病杂志,1998,14:26-28)