哺乳动物精子顶体反应检测考马斯亮蓝染色法

顶体反应(acrosomereaction,AR)是精子在受精过程中经历的重要环节之一。在AR机理研究中,检测精子是否发生AR是生殖生物学和生殖医学中常用的研究手段。目前已建立了十多种较实用的AR检测技术,但由于精子及其顶体存在种间差异性,使许多方法在应用上都存在一些局限。近年来Moller[1]和Aarons[2,3]等报道采用考马斯亮蓝染色法来检测小鼠精子AR,作者等人先前已将此法移用于人精子AR的检测中[4],方法简便、经济。本研究目的是为了推广考马斯亮蓝染色的适用范围,建立一种哺乳动物精子AR检测较通用简便的技术。1　材料与方法1.1　材料1.1.1…     

膜联蛋白A1在小鼠精子的定位

目的对小鼠精子膜联蛋白A1(AnxA1)进行定位,了解其与精子睾丸后成熟、获能、顶体反应的关系。方法用间接免疫荧光染色对睾丸、附睾精子以及诱导获能、顶体反应的精子进行膜联蛋白A1定位,同时用考马斯亮蓝染色法鉴定顶体反应率。结果取自睾丸、附睾头、体、尾部的精子膜联蛋白A1均分布于顶体帽区及尾部;诱导获能、顶体反应的精子头部荧光呈现2种类型:顶体帽型(Cap),赤道段-顶体后区型(Ep)。获能组精子Cap型(97.3±1.0)%,Ep型(2.7±1.0)%;顶体反应组精子Cap型(41.8±4.1)%,Ep型(58.2±4.1)%。考马斯亮蓝染色呈顶体反应(AR)型精子获能组为(5.4±2.5)%,顶体反应组为(64.7±3.7)%。相关分析表明AnxA1荧光标记Ep型百分率与考马斯亮蓝染色AR型百分率呈高度正相关(P<0.001)。结论在附睾成熟过程中及获能后小鼠精子膜联蛋白A1分布无明显变化,顶体反应后转移至赤道段、顶体后区,可能参与精子的钙依赖事件如顶体反应、精卵融合过程。     

抗精子抗体阳性大鼠动物模型的建立

目的　建立抗精子抗体 (AsAb)阳性大鼠动物模型。方法　同种Wistar大鼠精子抗原人工免疫法建立模型 ,通过ELISA法检测血清AsAb ;光镜HE染色观察大鼠附睾组织形态学改变 ;考马斯亮蓝顶体染色法检测精子的顶体反应率 ;化学比色法检测精子的ATP酶活性。结果　模型AsAb阳性大鼠血清样品的AsAb符合实验要求 ,其精子的顶体反应率、Na+ -K+ ATP酶、Ca2 + -ATP酶活性与对照组相比均显著降低 (P <0 0 1;P <0 0 5 ;P <0 0 5 )。结论　成功建立抗精子抗体阳性大鼠动物模型。     

精子形态学分析中染色方法的比较

目的：评价改良巴氏染色法、瑞-吉染色法和考马斯亮蓝染色法对形态正常精子率和顶体完整率检测结果影响。方法：分别采用改良巴氏染色法、瑞-吉染色法和考马斯亮蓝染色法对55例男性不育症患者精液涂片染色,计算形态正常精子率和顶体完整率。结果：①3种染色方法检测的形态正常精子率两两比较,差异均无显著性(P>0.05),瑞-吉染色法评价颈部和中段缺陷精子率及尾部缺陷精子率显著低于改良巴氏染色法和考马斯亮蓝染色法（P<0.05）。②3种染色方法检测的Ⅰ型、Ⅳ型顶体完整率两两比较,差异均无显著性 (P>0.05),改良巴氏染色法检测的Ⅱ型和Ⅲ型顶体完整率明显高于考马斯亮蓝染色法和瑞-吉染色法（P<0.05）。③3种染色方法检测的形态正常精子率间均呈显著正相关关系(r=0.535、P<0.01, r=0.601、P<0.01,r=0.329、P<0.05)。3种染色方法检测的顶体完整率间均呈显著正相关关系（r=0.604,P<0.01, r=0.682、P<0.01, r=0.446、P<0.01）。结论：3种染色方法均可作为检测人精子形态和顶体完整率实用方法,其中改良巴氏染色法更适于精子形态学分析,瑞-吉染色法更适于顶体完整率判读。     

重组人透明带蛋白3诱导精子的顶体反应

目的：在体外条件下检测重组人透明带蛋白诱导的顶体反应。 方法：体外采集已生育健康男子精液,采用非连续密度梯度法分离精子,将获能的精子悬液分成阴性对照组(C组,200 μL精子悬液加1 μL DMSO)、阳性对照组(A组,200 μL精子悬液加A23187至终浓度为10 μmol•L^-1)和ZP3组(200 μL精子悬液加ZP3至终浓度为10 mg•L^-1),考马斯亮蓝染色法检测重组人ZP3蛋白诱导的顶体反应。结果：C组、A组和ZP3组发生顶体反应的精子百分率分别为(5.00±1.70)%、(46.10±7.49)%和(13.20±2.70)%,各组间比较差异有显著性(P<0.05)。 结论：重组人透明带蛋白能够诱导人精子发生顶体反应。     

基础理论

021881 NO对抗精子抗体阳性大鼠精子自发顶体反应的影响/张威…//生殖与避孕一2002,22(4)一203一207 采用主动免疫法建立抗精子抗体(AsAb)阳性大鼠动物模型;浅盘凝集实验和ELISA法检测大鼠血清AsAb;考马斯亮蓝染色法进行精子顶体染色,以观察大鼠自发精子顶体反应率。结果:AsAb阳性大鼠精子自发AR%下降,且内源性NO含量、精子内SOD和Na十一K十ATP酶活性明显低于对照组;低剂量NO(SNP10一9一10一8 mol/L)可提高AsAb阳性大鼠精子自发顶体反应率、SOD活性,但对Na+一K十ATP酶活性无影响(P>0 .05)。高剂量NO(SNP10一6一10一4mol/…     

双向电泳两种凝胶染色方法的比较

目的比较肾脏蛋白质双向电泳凝胶银染色法与考马斯亮蓝G-250染色方法的染色效果。方法利用蛋白质固相pH梯度双向电泳技术分离SD大鼠肾脏组织蛋白,应用银染色和考马斯亮蓝G-250染色两种染色方法,及ImageMaster 2D5．0凝胶分析软件对凝胶进行染色分析。结果银染后的可见蛋白点比考马斯亮蓝染色法多,银染色法与考马斯亮蓝染色法平均匹配率为49．42％。结论银染法比考马斯亮蓝染色法的灵敏度高。     

考马斯亮蓝微盘比色法测定蛋白质含量

目的 建立快速、灵敏的测定蛋白质的方法。方法 以考马斯亮蓝作为显色剂,用酶联免疫测定仪微盘比色测定牛血清白蛋白和小鼠肝组织匀浆的蛋白含量,并与常量比色法进行了比较,结果 考马斯亮蓝微盘比色法与常量法相比,对样品的测定结果相近,而前者样品用量少（只需几微升）,简便、快速、检测极限低（0.63ug)。结论 考马斯亮蓝微盘比色法是一种简单、快速、灵敏的蛋白质测定方法,尤其适用于大批量、微量样品的蛋白质含量测定。     

蜂毒素脂质体质量评价方法的研究

目的:考察蜂毒素脂质体包封率的测定方法和游离药物的含量测定方法,对蜂毒素脂质体进行质量评价。方法:对于游离蜂毒素的含量测定,比较了单波长考马斯亮蓝法、双波长考马斯亮蓝法、福林-酚法、二喹啉甲酸法及高效液相色谱法等5种含量测定方法。对于蜂毒素脂质体包封率测定,筛选了透析法及超滤-离心法。结果:在吸收度及线性均良好的情况下,双波长考马斯亮蓝法可用于测定蜂毒素脂质体包封率时游离蜂毒素的含量,检测范围为0.5~25.0μg/mL,范围内线性良好,相关系数为0.9996。脂质体包封率测定采用超滤离心法,游离药物的平均回收率在95.75%~98.30%之间,脂质体不能透过截留相对分子质量为105的超滤膜。采用超滤离心法结合双波长考马斯亮蓝法测定3批蜂毒素脂质体的包封率为(91.45±0.83)%,RSD小于1%。结论:该方法可用于蜂毒素脂质体的质量评价。     

小鼠透明带溶解液诱导人精子顶体反应

目的 研究小鼠透明带溶解液诱导人精子顶体反应的效果，建立人精子顶体反应模型，方法正常生育力人精子经ＢｉｇｇｅｒｓＷｈｉｔｔｅｎａｎｄＷｈｉｔｔｉｎｇｈａｍｍｅｄｉｕｍ（ＢＷＷ）获能５～６ｈ后，分别用小鼠透明带溶解液（ｍＺＰＳ），ｍＺＰＳ的缓冲液ｈａｌｏｇｅｎｂｕｆｆｅｒ（ＨＢ），Ｃａ＾２＋载体Ａ２３１８７处理１ｈ，对实验和对照组精子用经典的豌豆凝集素（ＰＳＡ）法检测顶体反应。结果 ｍＺＰＳ组的顶体