肾综合征出血热纯化疫苗候选毒株在Vero细胞上的适应传代及其免疫原性研究

目的 将肾综合征出血热纯化疫苗候选毒株适应于Vero细胞，并对其抗原性和免疫原性进行研究。方法 将汉滩病毒H8207株和汉城病毒Y86013株在Vero细胞上进行连续终末稀释传代，采用间接免疫荧光法、酶联免疫吸附试验和空斑减少中和试验，研究传代后毒株的繁殖特性、病毒滴度、抗原量及免疫原性。结果 经过5次终末稀释传代，两株病毒在Vero细胞上均显示出良好的适应性，从第六代开始病毒滴度稳定在7．0Lg TCID50/m1以上，第八代两毒株抗原量均已达到1：64，H8207株抗原量继续升高，最高时达1：256。用两株病毒不同培养代次上清液制备的单价原液灭活疫苗免疫家兔二针，免疫血清对同型毒株的中和效价均达到1：10。结论 两株病毒已适应于Vero细胞，且具有病毒滴度高和免疫原性良好的特性，适合用作Vero细胞肾综合征出血热灭活纯化疫苗的候选毒株。     

有源汉坦病毒疫苗候选株的分离鉴定及其某些特性 …

目的 对人源汉坦病毒疫苗候选株作分离鉴定及特性的研究。方法 用Ｖ ｅｒｏ细胞分离病毒,用免疫荧光法作病毒效价测定。用ＲＴ－ＰＣＲ及部分核苷酸序列分析等检定。结果 用Ｖｅｒｏ细胞从安徽省凤台县肾综合征出血热病人血清中分离一株汉坦病毒（ＨＶ）,其抗原特性及ＰＣＲ分型结果证明为汉滩病毒（Ⅰ型病毒）;其免疫血清对来源于不同地区的ＨＶ均有中和活性。Ｍ片段部分序列分析结果表明,该毒株与７６－１１８等毒株苷酸序     

新疆虫媒病毒的分离与鉴定

１９９０￣１９９２年从新疆境内的多种蜱、蚊、病人血清及脑脊液中分离到多株虫媒病毒，经初步鉴定，其中部分为甲属披膜病毒。１９９３年７￣１０月与美国国家疾病控制中心（ＣＤＣ）虫媒传染病防治研究所合作，对上述病毒做进一步鉴定。３５株病毒感染Ｖｅｒｏ细胞，其中２８株可在３￣７ｄ内引起典型的细胞病变。用２８株病毒进行空斑形成试验（ＰＦＴ），其中１９株可在Ｖｅｒｏ细胞中形成空斑，其滴度为ｌｏｇ１０４．７／ｍｌ     

流行性乙型脑炎Vero细胞纯化灭活疫苗的研究

目的研制新的流行性乙型脑炎传代细胞疫苗。方法将流行性乙型脑炎弱毒株ＳＡ１４１４２适应于Ｖｅｒｏ细胞,作纯化灭活疫苗,比较不同培养方法病毒在Ｖｅｒｏ细胞的增殖规律,对病毒的浓缩和纯化条件进行研究,并将所制备的疫苗按不同蛋白浓度免疫动物。结果发现普通转瓶培养,可长时间维持病毒的高滴度。在感染病毒后,以无牛血清的培养基替代含牛血清的培养基,不仅可维持病毒的高滴度增殖,而且可多次收获,确立了应用８％ＰＥＧ８０００浓缩病毒液,１５％～６０％的蔗糖密度梯度超速离心纯化的工艺,每剂量为０５μｇ纯化疫苗的中和抗体水平,即可达到与现有商品疫苗相一致的滴度。结论ＳＡ１４１４２株制备的Ｖｅｒｏ细胞纯化疫苗,有望成为一种新的反应轻、效价高的疫苗。     

宁夏HFRS疫源地宿主动物汉坦病毒的首次分离和鉴定

目的　对宁夏肾综合征出血热（ ＨＦＲＳ） 新发疫源地进行宿主动物汉坦病毒的分离和鉴定。方法　采用幼龄长爪沙鼠接种和ＶｅｒｏＥ６ 细胞培养的方法进行汉坦病毒分离。用单克隆抗体间接免疫荧光试验,属特异性逆转录聚合酶链反应（ＰＣＲ） 结合限制性内切酶分析和型特异性逆转录ＰＣＲ 进行分离株的鉴定。结果　从宁夏黑线姬鼠肺成功地分离了２ 株汉坦病毒。单克隆抗体间接免疫荧光试验表明２ 株病毒与汉滩型病毒反应谱相同。逆转录ＰＣＲ 试验表明,２ 株病毒均可被汉坦病毒属特异性引物以及汉滩型特异性引物扩增,属特异性逆转录ＰＣＲ 产物的限制性内切酶分析表明２株病毒与汉滩型病毒酶切图谱相同。结论　首次在宁夏疫区成功分离了汉坦病毒并鉴定其属于汉滩型病毒,为进一步研究和控制该地区ＨＦＲＳ 提供了科学依据。     

小盾纤恙螨体内肾综合征出血热病毒增殖的初步研究

为进一步观察小盾纤恙螨感染肾综合征出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）后的体内增殖，直接取饲养的小盾纤恙螨幼虫和若虫，每２０天为一批制成无菌滤液，接种Ｖｅｒｏ－Ｅ６细胞测定ＴＣＩＤ５０／ｍｌ滴度，动态观察ＨＦＲＳＶ在螨体内的增殖。结果表明：在小盾纤恙螨幼虫期除采集至测定６０天批未测出ＨＦＲＳＶ滴度和未分离到ＨＦＲＳＶ外，其余１２批均在不同时间内测出ＨＦＲＳＶ滴度和分离到ＨＦＲＳＶ，滴度均在１０－１～１０－５之间。３批若虫亦有２批测出ＨＦＲＳＶ滴度和分离到ＨＦＲＳＶ，滴度为１０－５。所分离的ＨＦＲＳＶ用ＰＣＲ扩增技术亦检测出ＨＦＲＳＶＲＮＡ。这为小盾纤恙螨作为ＨＦＲＳ的传播媒介提供了进一步的证据。     

1995年云南瑞丽人免疫缺陷病毒的生物学特性

１９９５年从云南省瑞丽市３０名静脉注射毒品者（ＩＤＵｓ）及部分配偶中采血，分离外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ），用共培养法分离人免疫缺陷病毒（ＨＩＶ），以ＨＩＶ－Ｐ２４抗原酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）为检测终点，分离到１０株ＨＩＶ。其毒株的生物学特征为：复制能力弱，生长缓慢，滴度不高；不引起细胞融合。多数毒株只能在ＰＢＭＣ中生长，不能感染Ｔ细胞，只有１株（Ｃｒ２６９）可感染Ｔ细胞。已分离毒株的核苷酸     

甲型肝炎病毒在体外培养对人单核巨噬祖细胞增殖的实验研究

甲型肝炎病毒（ＨＡＶ）最易引起流行，探讨ＨＡＶ和单核巨噬细胞的关系，病毒在体内扩散过程及单核巨噬细胞在发病机制中的作用是很必要的。我们的研究表明ＨＡＶ可侵入患者外周血白细胞并在其中繁殖,单常,单核巨噬细胞培养,并进行了体了体外病毒传代的研究。结核巨噬细胞的培养，并进行了体外病毒传代的研究。结果如下：１．二株ＨＡＶ感染的细胞，于第１０天均查到ＩＦ阳性细胞，培养到１８天将贴壁细胞冻融离心取上清，重新感染单核巨噬细胞，均出现甲肝抗原阳性荧光。用抗ＨＡＶ阳性兔血清可以阻断上述荧光反应。第三代单核巨噬祖细胞…     

甲型肝炎病毒的纯化及其单抗的制备

应用不连续蔗糖／甘油密度梯度超速离心的方法，从培养细胞中纯化甲肝病毒（Ｈｅ－ｐａｔｉｔｉｓＡＶｉｒｕｓ，ＨＡＶ）。纯化的ＨＡＶ抗原经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析，获得三条带：ＶＰ１（３４０００），ＶＰ２（３００００）和ＶＰ３（２６０００）。用纯化的ＨＡＶ抗原免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，将已免疫小鼠的脾细胞与ＳＰ２／０细胞融合，获得６株分泌抗ＨＡＶ单克隆抗体的杂交瘤。它们的培养上清和腹水的抗体滴度分别是５０～１０００和１０００～４０００。Ｉｇ亚类５株为ＩｇＧ１，１株为ＩｇＧ２ａ。采用间接的ＥＬＩＳＡ法分析ＨＡＶ抗原的抗原位点，结果表明ＨＡＶ抗原至少存在４个抗原位点，两个存在于ＶＰ１蛋白带，另两个分别存在于ＶＰ２和ＶＰ３蛋白带     

亚甲基蓝／光化学法灭活血浆中指示病毒及对血浆？…

目的 探讨亚甲基蓝光化学法灭活血浆中模型病毒的效果。方法 用ＶＳＶ－Ｉｎｄｉａｎａ株作为指示病毒。接种于Ｖｅｒｏ单层细胞中,孵育３９℃２４ｈ用微量细胞病变法,进行病毒滴定。并用小量试验观察病毒灭活效果及对血浆蛋白的影响。结果 亚甲基蓝（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ ｂｌｕｅ ＭＢ）结合可见光照射可有效灭活血浆中的指示病毒,极低浓度的染料加光照可完全灭活血浆中大于６ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０的水泡性口膜炎病毒（Ｖ     

柯萨奇病毒A16型YY157株在Vero细胞中培养与增殖特性的研究

目的 探索柯萨奇病毒A16型（CVA16） YY157株在非洲绿猴肾（Vero）细胞中培养与增殖的合适条件.方法 把CVA16 YY157株接种于Vero细胞适应性传代,挑斑纯化后,在不同条件下培养并比较其对病毒滴度的影响.结果 CVA16 YY157株在Vero细胞中培养能导致细胞病变（CPE）,可形成蚀斑.将此CVA16病毒以0.01 ～0.1MOI接种于Vero细胞,并在低于2％牛血清浓度的培养基,35℃培养60 h,CPE可达90％以上;此条件下收获培养液上清,可得到较高滴度的病毒.结论 初步建立了CVA16 YY157株在Vero细胞中培养与增殖的方法,为其下一步的大规模培养及疫苗制备奠定了基础.     

甲型肝炎重组痘苗病毒在鸡胚细胞能复制子代却不表达HAV抗原

本实验室构建的甲型肝炎重组痘苗病毒〔１，２〕在人１４３ｔｋ－、人胚肺２ＢＳ、ＨｅＬａ、Ｈｅｐ２、ＦＲｈＫ４、Ｖｅｒｏ等细胞上都能很好复制子代病毒，产生细胞病变并同时表达甲型肝炎病毒（ＨＡＶ）抗原。但该重组病毒感染鸡胚细胞能产生子代病毒及细胞病变，用酶...     

Colti病毒的分离及其生物学性状

１９９４年夏秋季从北京郊区采集的蚊子中分离到两株Ｃｏｌｔｉ病毒（北京９５－７０和北京９５－７５）。病毒在Ｃ６／３６细胞引起明显的细胞病变，但在ＢＨＫ－２１和Ｖｅｒｏ细胞未见明显病变。对５’－碘脱氧尿苷和乙醚抵抗，表明为无包膜ＲＮＡ病毒；对酸敏感，在ｐＨ３．０条件下病毒滴度降低３．５～４．５个对数以上。聚丙烯酰胺凝胶电泳显示病毒基因组为１２节段ＲＮＡ，两株病毒的电泳带型完全相同，与１９９１年分离的Ｃｏｌｔｉ病毒ＴＲＴ２株带型基本一致，皆为６－６带型，但仔细比较至少有８条带的迁移率存在着细微差别。组织培养交叉中和试验表明，新分离株与ＴＲＴ２株的抗原性未见明显差异，可能属同一血清型。病毒在Ｃ６／３６细胞繁殖可能造成持续感染。     

单纯疱疹病毒1型诱导的Hela细胞凋亡及钙浓度的变化

一方面认为宿主细胞可利用细胞凋亡来清除病毒感染细胞 ;另一方面病毒可以抑制细胞凋亡 ,以利于自身增殖需要。而病毒诱导细胞凋亡还是抑制凋亡 ,取决于多方面因素。Ｌｅｐｐａｒｄｉ研究表明野生株ＨＳＶ 1感染Ｖｅｒｏ细胞并不引起Ｖｅｒｏ细胞凋亡 ,但缺乏调节性基因α4的Ｈ     

汉滩病毒感染成龄鼠模型用于特异性单克隆抗体保护作用的研究

目的建立汉滩病毒感染成龄鼠的模型,以进行mAb的保护实验.方法将7～8wkBalb/c小鼠于感染病毒前1d及感染后1d,2d和4d,分别经腹腔注射环磷酰胺65mg/kg体重,总剂量为260mg/kg体重,观察其发病及死亡情况,并检测其体内不同脏器中汉滩病毒抗原的分布及滴度.用mAb对上述感染小鼠进行保护实验.结果经环磷酰胺处理的成龄鼠,由汉滩病毒隐性感染变为急性致死性感染(死亡率达100%).其发病症状与汉滩病毒感染的乳鼠类似,平均发病与死亡时间较感染乳鼠晚2～3d,且较为规律和集中.汉滩病毒抗原在感染的成龄鼠和乳鼠体内的分布及滴度基本相同.用mAb对感染的成龄鼠和乳鼠分别进行保护实验,结果完全一致.结论经环磷酰胺处理的成龄鼠,可作为汉滩病毒和HFRS研究用的动物模型.     

猪胸膜肺炎放线杆菌单克隆抗体的制备与鉴定

目的：建立抗血清1型猪胸膜肺炎放线杆菌（APP-1）脂多糖（LPS）的单克隆抗体杂交瘤细胞株,为今后建立该菌的分型诊断技术奠定基础。方法：腹腔注射APP-1标准株的甲醛固定抗原免疫BALB/c小鼠,ELISA检测血清中LPS抗体滴度并选择值最高的小鼠用于细胞融合,且于融合前3天加强免疫1次。常规方法进行融合,HT、HAT培养液选择培养融合后的细胞,ELISA检测细胞培养上清中的LPS抗体,阳性杂交瘤细胞用有限稀释法克隆传代。结果：获得3株稳定分泌抗APP-1LPS抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株,其小鼠腹水单克隆抗体效价1∶16000～1∶32000。结论：已成功建立3株稳定分泌抗APP-1LPS抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株,其产生的单克隆抗体与呼吸道其它常见致病菌及APP-3,5,7,9,型无交叉反应。     

Epstein-Barr病毒壳抗原gp125的纯化和应用

目的研制ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒ（ＥＢ）病毒诊断试剂。方法将重组痘苗病毒表达的Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒ病毒（ＥＢＶ）壳抗原（ＶＣＡ）主要多肽ｇｐ１２５纯化，作为诊断抗原建立了酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ），检测了４８份鼻咽癌（ＮＰＣ）病人血清及１０份正常人血清中的ＶＣＡ／ＩｇＡ抗体。结果该方法与免疫荧光（ＩＦ）检测结果一致，但ＥＬＩＳＡ的平均几何滴度（ＧＭＴ）是ＩＦ的１２倍。结论以纯化的ＥＢ病毒壳抗原主要多肽ｇｐ１２５作为诊断抗原建立的检测方法，更适合于ＥＢＶ相关疾病的血清学诊断和血清流行病学调查。     

质粒型单纯疱疹病毒载体的构建及其在真核细胞中的表达

利用基因工程技术构建成功质粒型Ⅰ型单纯疱疹病毒（ＨＳＶ－１）载体ｐＨＳＶ，其中含有ＨＳＶ－１包装信号序列和ＨＳＶ－１复制起点，以及ＨＳＶ－１ＩＥ６８启动子。为验证其构建是否成功，在其ＩＥ６８启动子下游的多克隆位点上插入了Ｅ．ｃｏｌｉＬａｃＺ基因，构建成ｐＨＳＶＬ质粒。用ＨＳＶ－１温度敏感株（ｔｓＫ株）超感染传代细胞后，将这种质粒转染入该细胞，ｐＨＳＶＬ可在辅助病毒ＨＳＶ－１ｔｓＫ（允许温度为３１℃）存在的条件下被包装成病毒颗粒，由此得到的混合病毒含有ＨＳＶ－１ｔｓＫ和ｐＨＳＶＬ假病毒颗粒，收获后再感染培养的Ｖｅｒｏ细胞，原位检测β－半乳糖苷酶活性呈阳性。同时用ｐＨＳＶＬ病毒接种体外培养的ＳＤ大鼠胚胎脊髓运动神经元，用Ｘ－ｇａｌ原位检测β－半乳糖苷酶的活性，亦发现有阳性的神经元存在。说明载体ｐＨＳＶＬ携带的报告基因ｌａｃＺ在这两种真核细胞中均得以正确表达。报告基因可为其它目的基因所代替，可用于神经生理、病理以及神经系统疾病基因治疗的实验研究。     

Coltivirus新成员的分离和鉴定

１９９１年，在甘肃和北京地区采集蚊子，从中分离到１０株病毒，该类病毒在Ｃ６／３６，ＢＨＫ－２１及Ｖｅｒｏ细胞上可出现病变，使乳鼠发病、致死，抵抗乙醚和５－溴脱氧尿苷，电镜观察为球形、无包膜，直径约６２．７±３．１３ｎｍ。ＰＡＧＥ示该类病毒ＲＮＡ为１２节段，分为４个不同的电泳带型，均与云南分离株不同。交互中和试验和交互补体结合试验表明，中国分离株之间抗原性有变异。中国分离株与Ｃｏｌｔｉｖｉｒｕｓ属已知成员科罗拉多蜱热病毒、加利福尼亚分离株Ｓ６－１４－０３及德国分离株Ｅｙａｃｈ有血清学交叉反应（１：４～１：８），但血清型明显不同，因而，中国分离株当属Ｃｏｌｔｉｖｉｒｕｓ属的新的成员。     

应用痘苗病毒载体表达猴轮状病毒VP4抗原基因

把编码猴轮状病毒（Ｒｈｅｓｕｓｒｏｔａｖｉｒｕｓ，ＲＲＶ）Ｖｐ４抗原的第４基因片段插入到痘苗病毒表达载体ｐＪＳＡ１１７５的Ｐ７．５启动子下游，构建成在痘苗病毒Ｐ７．５启动子调控下表达猴轮状病毒Ｖｐ４抗原基因的重组质粒ＰＪＳＡ１１７５－ＶＰ４。应用磷酸钙沉淀技术将ＰＪＳＡ１１７５－ＶＰ４ＤＮＡ转入ＴＫ－１４３细胞，在ＢＵＤＲ和Ｘ－ｇａｌ存在下筛选蓝色蚀斑。经３代以上纯化和病毒增殖，获重组病毒Ｒ－ＶＪＳＡ１１７５－Ｖｐ４。蚀斑滴定其满度达到１５×１０１１ＰＦＵ／Ｌ。经核酸杂交试验证明所获得的重组痘苗病毒带有猴轮状病毒Ｖｐ４抗原基因。用重组病毒感染ＴＫ－１４３细胞（或Ｖｅｒｏ细胞），在感染后４８ｈ，用酶免疫法（ＥＩＡ）检测受染细胞上清液和细胞裂解液中表达的猴轮状病毒Ｖｐ４抗原基因均呈阳性反应。本试验为本研究室轮状病毒基因工程疫苗的一部分，为深入了解轮状病毒基因结构及其功能在方法学上奠定了必要的基础。