hVEGF165及hBMP-7双基因共表达腺相关病毒载体的构建及鉴定

目的通过引入内部核糖体进入位点序列（internal ribosome entry site，IRES），构建带有hVEGF165及hBMP-7双基因的重组腺相关病毒载体（adeno—associated virus，AAV），并对其进行鉴定。方法以AAV腺相关病毒包装系统（helper—free system）为基础，将真核表达质粒pIRES中的IRES片段定向克隆至腺相关病毒骨架质粒pAAV-MCS中，形成含有IRES序列及上、下游多克隆位点的重组骨架质粒pAAV-MCSA—IRES—MCSB。PCR扩增hVEGF165和hBMP-7基因，先后亚克隆入重组腺相关病毒骨架质粒IRES序列上、下游的多克隆位点，获得重组质粒pAAV-hVEGF165—IRES—hBMP-7。将其和包装质粒pAAV-RC、辅助质粒pHelper三质粒共转染AAV-293细胞，包装重组腺相关病毒rAAV-hVEGF165-IRES—hBMP-7，同时包装含有绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）标记的重组病毒rAAV-IRES—GFP作平行对照。荧光显微镜下监测病毒包装效率，收获重组病毒后感染AAV-HT1080细胞测定病毒滴度，并通过病毒基因组外源基因扩增鉴定重组病毒的包装是否成功。结果重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-hVEGF-165-IRES—hBMP-7经双酶切鉴定正确。荧光显微镜下观察三质粒共转染AAV-293细胞72h后，病毒包装效率达95％～100％，收获的重组病毒具有较高浓度及活性，感染AAV-HT1080效率达90％，荧光计数法测定病毒感染滴度达5．5×10^11 vp／mL。提取重组病毒基因组成功扩增出外源目的基因hVEGF。及hBMP-7片段，重组病毒包装成功。结论成功构建带有hVEGF165及hBMP-7双基因的重组腺相关病毒rAAV-hVEGF165-IRES—hBMP-7，收获的病毒具有较高滴度，为今后利用腺相关病毒载体进行hVEGF。及hBMP-7双基因共表达影响骨修复的体外及体内研究提供实验基础。     

改良法构建Ⅱ型重组腺相关病毒介导人TIMP1基因及鉴定

目的改良法构建携带金属蛋白酶抑制剂1（TIMP1）基因的Ⅱ型重组腺相关病毒（rAAV2）。方法采用PCR法从pDNR-LIB质粒中扩增人全长TIMP1基因，利用基因重组的方法将TIMP1全长cDNA插入通用型AAV2载体质粒pSNAV的多克隆位点，构建成pSNAV-TIMP1；用脂质体转染的方法将重组质粒转入BHK-21细胞中，G418细胞筛选得到转入重组质粒并能表达目的基因的细胞系BHK21／rAAV2-TIMP1；用具有rAAV2包装功能的重组Ⅰ型单纯疱疹病毒（rHSV1-rc／△UL2）感染BHK-21／rAAV2-TIMP1，纯化后得到rAAV2-TIMP1。结果用改良法成功构建rAAV2-TIMP1，病毒滴度达到1×10^12v.g．／ml。结论成功构建rAAV2-TIMP1，为其进一步应用于基因治疗的研究提供实验基础。     

人骨形成蛋白7基因重组2型腺相关病毒载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的构建人骨形成蛋白7基因（hBMP7）重组腺相关病毒载体,并观察其在兔骨髓间充质干细胞中的表达。方法将骨形成蛋白7基因片段克隆入穿梭质粒pUC18获得重组质粒pUC18-hBMP7。KpnⅠ和鼠Ⅱ双酶切质粒pUC18-hBMP7／与pSNAV,用T4DNA连接酶连接分别回收的两片段后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,获得重组质粒PSNAV—hBMP7／,转染BHK-21细胞,筛选培养,用能表达Rap和Cap的重组Ⅰ型单纯疱疹病毒HSVl-rc／△UL2感染此细胞,裂解细胞收获病毒液。采用氯仿处理-PEG／NaCl沉淀-氯仿抽提法分离浓缩、纯化与测定病毒滴度。用rAAV2-hBMP7／和rAAV2-EGFP在体外分别转染兔骨髓间充质干细胞。流式细胞仪、RT-PCR和Western—blot方法检测兔骨髓间充质干细胞中hBMP-7基因的转录和表达。结果成功构建具有感染活性的重组腺相关病毒载体rAAV2-hBMP7／,病毒载体对兔骨髓间充质干细胞早期转染效率可达99．8％,hBMP7／在兔骨髓间充质干细胞中可得到转录和表达。结论成功构建了人骨形成蛋白7基因重组腺相关病毒载体,rAAV2-hBMP7／载体在体外可转染兔骨髓间充质干细胞,并获得较高的转染效率。     

携带Notch-1受体胞内段基因重组腺病毒载体的构建及其在胰腺腺泡细胞中的表达

目的构建并鉴定携带Notch-1受体胞内段基因（NICD）的腺病毒表达载体，同时观察重组腺病毒在胰腺腺泡细胞中的表达。方法提取K562细胞总RNA，利用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）扩增NICD并将其克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中，经PmeI酶切线性化质粒后与pAdeasy-1质粒在大肠杆菌BJ5183中同源重组。将鉴定正确的同源重组质粒线性化后转染293细胞进行包装、扩增得到重组腺病毒颗粒Ad—NICD。将该病毒感染胰腺腺泡细胞并通过实时定量PCR检测其表达。结果经PCR、基因测序和酶切鉴定证实重组质粒pAd—NICD构建成功，将重组质粒导入293细胞可以观察到绿色荧光蛋白（GFP）的表达，实时定量PCR证实病毒颗粒Ad—NICD感染腺泡细胞后可以有效地增加NICD表达。结论成功构建Ad—NICD并证实其在腺泡细胞中的表达，为进一步研究Notch信号传导途径及其与胰腺的疾病的关系奠定了基础。     

腺相关病毒介导人骨形态发生蛋白7基因体外转染脂肪源性干细胞的研究

目的构建人骨形态发生蛋白7(hBMP7)基因重组腺相关病毒载体并观察其在脂肪源性干细胞(ADAS cells)中的表达,为骨组织工程探索新的基因治疗方法和细胞来源。方法以pcDNA1．1／Amp-hBMP7质粒为模板扩增,将回收的PCR产物片段克隆入pUC18载体,获得重组质粒pUC18-hBMP7。双酶切质粒pUC18-hBMP7、pSNAV,回收的两片段转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,获得重组质粒PSNAV-hBMP7。用重组Ⅰ型单纯疱疹病毒HSV1-rc／△UL2感染BHK-21细胞,裂解细胞收获病毒液。采用“氯仿处理-PEG／NaCl沉淀-氯仿抽提”三个步骤分离浓缩和纯化,测定病毒滴度。培养大鼠ADAS cells,并检测细胞表面标记物。在体外分别转染rAAV2-hBMP7和rAAV2-GFP,流式细胞仪、Western-blot方法检测转染基因的表达。结果PCR、酶切鉴定以及测序分析表明,BMP7基因成功克隆入质粒pSNAV-hBMP7载体中,并在BHK21细胞中成功包装出具有感染活性的重组腺相关病毒载体rAAV2-hBMP7。早期对ADAS cells的转染效率可达90％, Western-Blot方法检测到第1周与第8周的转染组细胞均有蛋白水平的表达。结论成功构建了hBMP7基因重组腺相关病毒载体和培养出大鼠ADAS cells,rAAV2-hBMP7载体在体外可高效转染大鼠ADAS cells。     

基因-病毒治疗系统CNHK300-murine endostatin的构建及体外研究

目的构建一种新型的肿瘤基因．病毒治疗系统CNHK300-murine endostatin（CNHK300-mE），以肿瘤增殖病毒为载体，携带抗肿瘤新生血管生成的基因。方法利用基因重组技术将人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子插入腺病毒E1A基因上游，将小鼠内皮抑素基因表达盒插入到腺病毒包装信号和hTERT启动子之间，通过病毒增殖试验、电镜技术、Western blot分析、酶联免疫吸附实验（ELISA）、鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）试验，观察CNHK300-mE的复制情况、mE的表达情况及对鸡胚绒毛尿囊膜新生血管的抑制情况。结果成功构建了基因-病毒治疗系统CNHK300-mE，该系统为hTERT启动子调控腺病毒E1A基因表达并携带小鼠内皮抑素基因的重组腺病毒。该病毒可以在端粒酶阳性的胃癌细胞株SGC-7901和肝癌细胞株HepGⅡ中大量增殖及复制，而在端粒酶阴性的正常纤维细胞中不增殖。电镜证实该重组病毒在胃癌细胞株SGC-7901中复制及增殖。ELISA检测表明SGC-7901感染CNHK300-mE后7d，小鼠内皮抑素的表达量为1000μg／L。CAM实验证实该病毒感染胃癌细胞后的培养液上清具有抗新生血管生成的生物活性。结论基因-病毒治疗系统CNHK300-mE能在端粒酶阳性的肿瘤细胞中特异性增殖复制，并大量表达具有抗新生血管生成生物活性的小鼠内皮抑素。     

反转录病毒载体介导猪MHCⅡ分子在猪骨髓细胞中的表达

目的构建猪MHC Ⅱ分子的反转录病毒表达载体，建立产生病毒颗粒的包装细胞株，体外转导小型猪骨髓细胞并观察目的基因的表达情况，为研究小型猪转导同种异体MHC Ⅱ分子对于肝脏移植特异性免疫耐受的诱导提供实验基础和实验材料。方法利用基因重组技术将目的基因SLA-DRB^dd、SLA-DQA^dd和SLA-DQB^dd克隆到反转录病毒载体pLNCX2上，通过脂质体转染包装细胞AmphoPack^TM-293细胞，从G418筛选阳性克隆细胞培养上清中获得了有感染性的病毒颗粒；并对体外培养的猪骨髓细胞进行了感染，采用Nothern杂交和逆转录．聚合酶链反应（RTPCR）等方法检测了目的基因在骨髓细胞中的表达。结果经过酶切和测序验证已成功构建了MHC Ⅱ分子的反转录病毒表达载体，在转染AmphoPack^TM-293细胞后可以产生有感染性的重组病毒颗粒，稳定的CFM-GFG418抗性率为6％～11％，RT结果显示抗性细胞中有目的基因的RNA转录产物存在，而转染空载体的对照组没有。结论重组有目的基因的逆转录病毒载体pLNCX2经过包装细胞AmphoPack^TM-293产生的病毒颗粒可以有效地将猪MHC Ⅱ分子转导入猪的骨髓细胞并获得长期稳定的表达。     

重组人骨形成蛋白4基因腺相关病毒载体的构建

目的 构建重组人骨形成蛋白4（human bone morphogenetie protein4，hBMP-4）基因腺相关病毒载体。方法 根据hBMP4的基因序列设计引物，上游引入EcoRⅠ位点，下游引入Sal Ⅰ位点，以EX-A0242M01hBMP4为模板扩增目的基因。将hBMP-4基因克隆入pUC18载体中，获得重组质粒pUCl8hBMP-4。然后用EcoRⅠ与Sal Ⅰ酶切pUC18-hBMP-4及质粒pSNAV，回收酶切片段，T4DNA连接酶16C过夜，转化大肠杆菌DH5a感受肽细胞，筛选阳性克隆获得pSNAV-hBMP-4，EcoRⅠ／SalⅡ双酶切鉴定，并行全基因测序。转染BHK21细胞，G418筛选培养，获得抗药克隆细胞株。HsV1-rc／△UL2感染，包装此细胞株并收获病毒载体AAV-hBMP-4。行DNA点杂交法测定病毒滴度，SDS-PAGE分析判断病毒纯度。结果 PCR电泳及酶切鉴定表明，pSNAV-hBMP-4重组成功，基因测序显示装入pSNAV质粒中的hBMP-4基因正确；AAV-hBMP-4病毒的大致滴度为1．5×10^12μg／ml，分泌蛋白浓度为0．124mg／ml，病毒载体纯度在95％以上。结论 实验获得的病毒载体滴度高、感染性好，可以满足骨组织工程的需要。     

分泌型凋亡素真核表达载体的构建及对肝癌细胞HepG2凋亡的影响

目的 构建含有NT4和HA2-TAT的分泌型VP3真核表达载体,并观察其表达对人肝癌细胞HepG2和小鼠成纤维细胞NIH3T3的影响.方法 构建了含鸡贫血病毒VP3基因和NT4、HA2-TAT基因的分泌型真核表达载体--NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒载体.体外转染人肝癌细胞HepG2和小鼠成纤维细胞NIH3T3,用MTT法和流式细胞学,检测凋亡素融合基因诱导细胞凋亡的效果.结果 携带融合基因的重组腺相关病毒感染人肝癌HepG2细胞48 h后,显示了很强的诱导肿瘤细胞凋亡的能力.而对小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞无明显凋亡作用.结论 分泌型NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒载体转染细胞后能够被正常分泌、穿膜并特异性诱导肿瘤细胞凋亡,为肿瘤的基因治疗提供了新的思路.     

分泌型凋亡素真核表达载体的构建及对肝癌细胞HepG2凋亡的影响

目的 构建含有NT4和HA2-TAT的分泌型VP3真核表达载体,并观察其表达对人肝癌细胞HepG2和小鼠成纤维细胞NIH3T3的影响.方法 构建了含鸡贫血病毒VP3基因和NT4、HA2-TAT基因的分泌型真核表达载体--NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒载体.体外转染人肝癌细胞HepG2和小鼠成纤维细胞NIH3T3,用MTT法和流式细胞学,检测凋亡素融合基因诱导细胞凋亡的效果.结果 携带融合基因的重组腺相关病毒感染人肝癌HepG2细胞48 h后,显示了很强的诱导肿瘤细胞凋亡的能力.而对小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞无明显凋亡作用.结论 分泌型NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒载体转染细胞后能够被正常分泌、穿膜并特异性诱导肿瘤细胞凋亡,为肿瘤的基因治疗提供了新的思路.     

8型腺相关病毒介导的TRAIL基因促结肠癌细胞凋亡的实验研究

目的观察8型腺相关病毒介导的TRAIL基因对结肠癌HCT116细胞凋亡的诱导作用并探讨其作用机制.方法采用三质粒磷酸钙共沉淀方法转染HEK293细胞,制备出携带TRAIL基因的8型重组腺相关病毒;重组病毒感染结肠癌细胞及正常人肝细胞,利用台盼蓝染色计数法测定细胞生长活性;光镜下观察病毒感染后细胞大体形态改变;Hoechst染色荧光显微镜下观察细胞核形态的改变;DNA凝胶电泳观察细胞凋亡的发生;蛋白印迹检测凋亡相关基因caspase-3,caspase-8蛋白表达的变化.结果携带TRAIL基因的8型重组腺相关病毒能够激活caspase通路,促进结肠癌细胞凋亡,有效抑制结肠癌细胞的生长,而对正常人肝细胞的生长没有影响.结论8型腺相关病毒介导的TRAIL基因能够抑制结肠癌细胞HCT116的体外生长,对正常细胞没有毒性.     

Direct comparison of efficiency and stability of gene transfer into the mammalian heart using adeno-associated virus versus adenovirus vectors

OBJECTIVE: Recent gene therapy strategies have relied on the use of adenovirus or plasmid as vehicles for gene delivery to the heart. These approaches have been limited by low transduction frequencies and transient transgene expression. We sought to determine whether adeno-associated virus produces more stable, higher efficiency gene expression in the rodent heart than did previous conventional methods. METHODS: Two recombinant viral constructs were made: an adeno-associated virus containing the lacZ gene under the control of the cytomegalovirus promoter (AAV-lacZ) and an adenovirus expressing lacZ under the control of the same promoter (Adeno-lacZ). Twenty rats were injected (into the ventricular apex) with 1 x 10(7-8) genomic particles of each virus. Animals were put to death at serial time points and transgene expression quantitated by beta-galactosidase activity, myocardial staining, and Western blot protein analysis. RESULTS: Three months after adeno-associated virus gene transfer, animals demonstrated stable beta-galactosidase expression in 60% of cardiomyocytes without evidence of myocardial inflammation/necrosis. The distribution and degree of protein expression and number of positive cells at 3 months were equivalent to transgene expression at 4 weeks. Adeno-associated virus was not detected in organs other than the heart. In contrast, Adeno-lacZ animals displayed transient beta-galactosidase activity in 60% of cardiomyocytes, which was undetectable 4 weeks after gene transfer. Adenovirus-treated animals manifest significant myocardial inflammation and had transgene expression in other organs. CONCLUSION: Direct intramyocardial injection of an adeno-associated virus vector programs stable, long-term, cardiac-specific transgene expression in the rodent heart for up to 3 months. Our results suggest adeno-associated virus has significant advantages for long-term transgene expression in the heart compared to adenovirus vectors.     

融合基因骨形态发生蛋白-4/7重组腺相关病毒载体转染对骨髓基质干细胞成骨活性的作用

目的 应用高效细菌内同源重组系统pAd-Easy制备融合基因骨形态发生蛋白-4/7(BMP-4/7)基因的重组腺相关病毒(AAV),转染兔骨髓幕质干细胞(BMSCs),检测BMP-4/7的成骨活性.方法 采用RT-PCR一步法和基因重组法,从胎盘组织中克隆BMP-4和BMP-7成熟肽cDNA,获取BMP-4/7融合基因,克隆到pGEM质粒中;从pGEM-BMP-4/7质粒中切取BMP-4/7融合基因克隆到穿梭载体,在大肠杆菌内重组,在293细胞中构建AAV-BMP-4/7重组腺相关病毒载体;采用SDS-PAGE电泳榆测BMP-4/7融合基因蛋白在大肠杆菌的表达;采用ELISA法检测融合基因BMP-4/7在BMSCB中的表达.AAV-BMP4/7转染兔BMSCs细胞7、14 d后,行碱性磷酸酶及骨钙素含量测定,观察成骨活性,以非转染组作为对照. 结果成功构建高滴度的携带BMP-4/7融合基因的重组腺相关病毒AAV.BMP-4/7.AAV-BMPd/7重组质粒载体转化大肠杆菌进行诱导表达,SDS-PAGE电泳可见29～830 KD蛋白带,大多数蛋白存在于包涵体内.ELISA检测显示经AAV转染的BMSCs中BMP-4/7蛋白有表达,随着转染MOI值的增加,BMP-4/7蛋白的表达增高(P<0.01).AAV-BMP4/7转染细胞后,碱性磷酸酶及骨钙素含量均明显增高,并与转染后诱导培养的时间呈正相关,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01). 结论融合基因BMP-4/7可提高BMPs表达水平,有成骨活性,通过AAV可稳定表达.     

单纯疱疹病毒Ⅰ型扩增子载体转移脑啡肽基因在神经细胞的表达

目的：研究采用单纯疱疹病毒I型扩增子载体将脑啡肽基因导入神经细胞，观察载体lacZ基因和外源脑啡肽基因的表达。方法：实验共分4组；A组为对照组，未加病毒悬液的神经细胞；B组，加病毒悬液的神经细胞培养2d；C组，加病毒悬液的神经细胞培养3d；D组，加病毒悬液的神经细胞培养至第10d。留部基用放射免疫法检测外源性脑啡肽基因的表达。用X-gal原位检测lacZ基因表达反映扩增子病毒的存在和滴度。结果：L－脑啡肽放射免疫检测证实转基因神经细胞L－脑啡肽含量较对照组明显升高（P＜0．05），X-gal染色证实加入假病毒悬液的神经细胞有30％以上的细胞蓝染.结论：HSV－1扩增子假病毒能将外源脑啡肽基因导入神经细胞，并使之有效表达。     

构建携带hTERT基因的慢病毒重组载体及其包装和表达

目的构建含hTERT基因的慢病毒重组载体,进行病毒包装并检测hTERT在293T细胞中的表达。方法PCR扩增hTERT．插入慢病毒载体,并与包装质粒转染293T细胞,进行病毒包装,并测定其滴度。Western—Blot检测慢病毒液感染293T细胞后hTERT的表达。结果成功构建了含hTERT的慢病毒重组载体,滴度为2．79×10^7Tu／mL,Western-B10t检测显示慢病毒液感染的293T细胞中hTERT基因高表达。结论含hTERT的慢病毒重组载体成功构建并包装后能够顺利感染293T细胞．并阳性表达目的基因。     

大鼠PnNOS基因修饰脂肪源性干细胞的构建

目的 构建过表达大鼠阴茎神经源性一氧化氮合酶（PnNOS）基因大鼠脂肪源性干细胞（ADSCs）,为基因修饰ADSCs移植治疗勃起功能障碍（ED）大鼠模型提供种子细胞.方法 获取大鼠PnNOS基因,并与线性化的腺病毒真核表达载体pDC315-EGFP定向克隆连接.构建正确的pDC315-PnNOS-EGFP穿梭质粒转染293 T细胞,采用Western Blot检测PnNOS基因在293 T细胞中的表达情况.利用AdMax腺病毒包装系统包装产生重组腺病毒,包装后扩增纯化并测定病毒滴度.PnNOS基因重组腺病毒转染大鼠ADSCs,观察GFP表达情况和Western Blot检测PnNOS基因表达情况.结果 经PCR鉴定、限制性酶切分析、测序鉴定和目的质粒Western Blot表达检测鉴定,证实pDC315-PnNOS-EGFP重组腺病毒载体构建成功.重组腺病毒包装成功且病毒滴度为5.0×109 PFU/ml.Western Blot于大鼠ADSCs中检测到约161 KDa大小条带,其与PnNOS蛋白分子量大小基本相一致.结论 大鼠PnNOS基因修饰的ADSCs构建成功,从而为基因修饰ADSCs移植治疗ED提供了良好的基因工程细胞.     

双基因共表达腺相关病毒穿梭质粒的构建与鉴定

目的 合成和筛选nogc66-siRNA干扰片段,克隆神经生长因子-β(NGF-β),构建含nogu66-siRNA和NGF-β双基因的重组腺相关病毒穿梭质粒.方法 设计针对nogo66的siRNA,插入载体pGenesil-1.1,转染大鼠胶质瘤C6细胞,通过RT-PCR和Western-blot检测筛选有效的干扰质粒;培养人MI-Apaca-2细胞,提取总RNA,进行RT-PCR得到人NGF-β基因,插入T-easy载体;将pGenesil-1.1与pAAV-MCS进行重组,得到含U6和CMV双启动子的重组腺相关病毒穿梭质粒pAAV-U6/CMV-EGFP;将nogo66-siRNA和NGF-β分别插入pAAV-U6/CMV-EGFP中,构建含nogo66-siRNA和NGF-β双基因的重组腺相关病毒穿梭质粒.结果 干扰质粒pGenesil-nogo66-siRNA测序显示干扰序列正确;RT-PCR结果显示转染后各条带相对亮度有差异,转染pGenesil-nogo66-siRNA-1和pGenesil-nogo66-siRNA-2使nogo基因表达降低;Western-blot结果显示转染pGenesil-nogo66-siRNA-1使NOGO蛋白表达下降73%,转染pGenesil-nogo66-siRNA-2使NOGO蛋白表达下降78%,与未转染组相比,差异有统计学意义(P<0.05);质粒T-easy-NGF-β酶切可见3000 bp、736 bp条带,测序显示基因序列正确;酶切pAAV-U6/CMV-EGFP、pAAV-U6-nogo66-siRNA/CMV-EGFP可见4300 bp、800 bp条带,转染细胞后均可见绿色荧光蛋白表达;酶切pAAV-U6/CMV-NGF-β、pAAV-U6-nogo66-siRNA/CMV-NGF-β可见4300 bp、736 bp条带;质粒pAAV-U6βnogo66-siRNA/CMV-NGF-β测序显示载体中的基因序列止确.结论 成功构建了含有nogo66-siRNA与NGF-β双基因的重组腺相关病毒穿梭质粒,为深入研究脊髓损伤的修复提供了实验基础.     

转化生长因子β1基因转染兔颞下颌关节滑膜间充质干细胞及其表达

目的 构建TGF-β1基因的重组腺相关病毒载体并将其转入兔颞下颌关节滑膜间充质干细胞(SMSCs)中,对转染后外源性TGF-β1 mRNA和蛋白的表达进行检测.方法 含TGF-β1全长cDNA的质粒pCMV6-XL4和质粒pAAV-MCS用EcoR Ⅰ+Xba Ⅰ进行双酶切后连接,转化大肠杆菌DHSα感受态细胞,获得重组质粒pAAV-MCS-TGF-β1.通过酶切和DNA测序鉴定重组质粒的正确性.采用磷酸钙共沉淀法,以重组质粒pAAV-MCS-TGF-β1和pAAV-RC、pHelper共转染AAV-293细胞,产生具有传染性的病毒颗粒;斑点杂交方法检测重组病毒的滴度,并转染体外培养的SMSCs.以逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot分别检测目的 基因及蛋白的表达.结果 成功地构建TGF-β1基因腺相关病毒重组质粒,病毒滴度约为3.6×1013vp/ml,感染的SMSCs能稳定、高效地表达外源性目的 基因及蛋白.结论 重组腺相关病毒载体rAAV-TGF-β1能有效感染SMSCs并表达目的基因.     

ANG-1基因重组腺病毒载体的构建及其转染骨髓问充质干细胞的实验研究

目的构建携带大鼠血管生成素．1（angiopoietin-1,ANG．1）基因的重组腺病毒载体,并检测其转染对大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stemcells,BMSCs）活力的影响。方法RT-PCR法获取大鼠ANG-1基因并亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV,经测序无误后与骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183中同源重组。重组质粒pAdEasy-1-ANG-1经鉴定后转染293细胞进行病毒包装扩增。体外转染BMSCs,检测转染后BMSCs中ANG-1的表达。MTT法评估常氧及缺氧环境下ANG-1对BMSCs的影响。结果重组腺病毒载体pAdEasy-1-ANG-1经测序及酶切鉴定正确;BMSCs经转染ANG-1基因后表达ANG-1。MTT法检测提示常氧及缺氧条件下转染前后BMSCs活性的差异均无统计学意义（缺氧组与缺氧下转染组相比,P〉0-05;常氧组与常氧下转染组相比,P〉0-05）。结论成功构建大鼠ANG-1基因重组腺病毒载体,且其转染在体外不影响BMSCs的活性。