应用不同免疫组化抗原修复技术的体会

免疫组化成败的关键因素之一是抗原决定簇是否充分暴露,经甲醛固定的组织常引起蛋白质空间结构的改变而导致抗原决定簇的封闭,抗原修复技术在石蜡切片免疫组织化学染色中是一种简单有效的增强方法,但无论是高压热修复还是微波热修复均会出现不同程度的脱片现象,给技术人员带来烦恼,并加大了工作量.     

结核分枝杆菌rmlA基因的生物信息学分析

目的:分析结核分枝杆菌rmlA基因及其编码的蛋白质结构和特征,获得其生物学信息。方法:从GenBank中获取rmlA基因的核酸序列,应用DNAMAN、Geneious Pro等软件及生物信息学在线分析工具,预测rmlA基因及其编码的蛋白质基本理化特征、亚细胞定位、二级结构、抗原表位等;建立蛋白质三级空间结构模型;进行多序列同源比对并构建分子进化树。结果:rmlA基因编码α-D-葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶。其具有288个氨基酸残基,理论分子量为31 492.0Da。该蛋白无信号肽,位于细胞质,无明显跨膜结构,存在14个潜在抗原表位。二级结构以α螺旋为主,蛋白序列、结构保守,为分枝杆菌所特有。结论:rmlA基因及其编码的蛋白质可作为研发新型免疫诊断方法、结核疫苗、新药的理想侯选分子靶标。     

基因工程抗体的研究

近年来在生物学领域最引人注目的进展之一就是抗体工程的建立 ,人们已经可以将编码抗体的基因进行重组、改造 ,并实现了体内和体外的表达 ,从而使抗体得到更为广泛的应用。本文就这方面的研究作一综述。1　基因工程抗体的研究背景及含义大多数抗原由大分子蛋白质组成 ,但只有抗原分子上某些特殊的分子结构即抗原决定簇才能与相应抗体结合。一种抗原物质往往具有多种不同抗原决定簇 ,可刺激机体产生抗各种抗原决定簇的抗体 ,因而是多克隆的。由于这种抗体的不均一性 ,影响了检测抗原的特异性及敏感性 ,在临床上应用受到很大限制。而单克隆抗…     

分子克隆法测定蛋白质一级结构

蛋白质对于生命的重要意义是人所共知的,它的结构与生理功能密切相关,蛋白质特定的空间结构决定了它特殊的生理功能。而一种蛋白质分子空间结构的形成和维持,是以其氨基酸的排列顺序,即一级结构为基础的。一级结构的测定构成了蛋白质研究领域中一项十分重要的内容。分子克隆法测定蛋白质一级结构,是利用基因工程技术测定蛋白质分子中氨基酸序列的一种新方法,综合了分子生物学领域中的一些基本理论和常用技术,为蛋白质一级结构的测定开拓了新领域。     

HLA-A^＊0201限制性AFP抗原决定簇肽特异性肝癌疫苗的制备

目的探讨人HLA-A^＊0201限制性AFP抗原决定簇肽（含MHC—I类分子HLA-A^＊0201）作为原发性肝癌特异性抗原制备肝癌肿瘤疫苗的可行性。方法应用14佃AFP抗原决定簇肽片段分别体外脉冲刺激健康人血液树突状细胞（DC）,将DC与自体T淋巴细胞共同培养并扩增其数量,使AFP抗原决定簇肽导入CD8’阳性T淋巴细胞（CD8^＋-CTL）并对表达相应AFP抗原决定簇肽的K562／A2．1细胞（人慢性髓原性白血病细胞株K562转染人HLA-A^＊0201基因）产生特异性杀伤并释放gamma-干扰素（ELISPOT测定）。结果有4个AFP抗原决定簇肽对表达相应AFP抗原决定簇肽的K562／A2．1细胞杀伤能力较强,称之为免疫决定簇肽（Immunodominant）;另有10个AFP抗原决定簇肽对表达相应AFP抗原决定簇肽的K562／A2．1细胞杀伤能力较弱,称之为亚免疫决定簇肽（Subdominant）。结论AFP抗原决定簇肽可以作为肝癌特异性抗原制备肝癌肿瘤疫苗,K562／A2．1细胞可以作为有效的抗原提呈细胞（APC）用于实验研究。     

曼氏迭宫绦虫线粒体载体蛋白结构和功能的生物信息学分析

目的应用生物信息学技术预测曼氏迭宫绦虫线粒体载体蛋白超家族的结构和功能,为进一步研究曼氏迭宫绦虫的蛋白质提供理论依据。方法将测得的曼氏迭宫绦虫成虫EST序列用ORF finder获取开放读码框,Blast进行分析其结构域。应用分析工具Protparam、InterProScan、protscale、SignalP-3.0、PSORTⅡ、BepiPred、TMHMM、VectorNTI Suite 9软件包、Phyre2分别进行该蛋白质的基本性质、结构域、疏水性、信号肽、亚细胞定位、抗原表位、跨膜区及空间结构的预测及分析。结果 Blast预测该蛋白质为线粒体载体蛋白超家族,保守功能域为线粒体二羧酸载体,含294个氨基酸残基,理论分子量为32132.2Da。与曼氏血吸虫进化地位最接近;有1个信号肽位点和6个潜在的抗原表位。结论曼氏迭宫绦虫线粒体二羧酸载体能够介导苹果酸、琥珀酸等二羧酸的转运,使其跨越线粒体膜参与三羧酸循环,为虫体自身提供能量,可能是潜在的疫苗候选分子及药物作用靶点。     

干细胞表面分子Claudin-6的结构预测与分析

目的应用多种手段对干细胞表面分子Claudin-6(CLDN6)进行理化性质和各级结构的预测和分析,探讨CLDN6结构与功能的关系,为CLDN6在再生医学和转化医学上的应用提供理论基础。方法采用ProtParam工具、InterProScan和TMpred工具分析蛋白质一级结构,采用Consensus Secondary Structure Prediction工具对蛋白质二级结构进行预测,通过RaptorX远程同源建模工具预测蛋白质三级结构。结果 CLDN6是由219个氨基酸组成的蛋白质,相对分子质量为23387.7,含有4个跨膜结构域,N末端和C末端均位于细胞质中;二级结构预测结果显示,其以α-螺旋和无规则卷曲为主要构件。结论通过远程同源建模构建了CLDN6蛋白的空间结构,为进一步深入研究CLDN6的功能实现再生医学替代治疗奠定了基础。     

大肠埃希菌O157:H7 Tir基因的生物信息学分析

目的扩增和测序肠出血型大肠埃希菌O157:H7 tir基因,利用生物信息学预测分析其结构和功能特征,以探讨Tir作为疫苗候选抗原的可能性。方法利用PCR技术扩增tir基因并测序,应用生物信息学网站在线分析工具和vector NT Isuite软件分析Tir蛋白结构和生物学功能,预测B细胞抗原表位。结果该基因全长1674bp,编码558个氨基酸,蛋白质总体亲水性高,有稳定的理化性质。含有3个结构和功能域,两段穿膜结构,多个磷酸化位点,预测20个B细胞线性表位。结论Tir毒力因子是很有前景的疫苗候选抗原,为肠出血型大肠埃希菌O157:H7的疫苗研究提供了理论依据。     

人型结核杆菌H_(37)Ra的抗原决定簇的筛选及其初步鉴定

本文报导一种筛选人型结核杆菌H_(37)Ra的抗原决定簇的Western Blot分析技术。细菌培养滤液经15％SDS-PAGE电泳进行分离,然后电转移到硝酸纤维素薄膜上,应用鼠抗人型结核杆菌单克隆抗体进行免疫反应。通过免疫印染,一条能与单克隆抗体起强阳性反应的蛋白带被识别。应用蛋白质洗脱技术,这个蛋白质片段被提纯。经过SDS-PAGE电泳分析,这个含有抗原决定簇的蛋白质片段分子量为17500道尔顿,斑点免疫试验证实该片段具有生物学活性。本文提示,Western Blot分析技术是选择抗原决定簇的有用方法,为结核病的诊断提供了新的途径。     

沙眼衣原体主要外膜蛋白生物信息学分析

目的：分析和预测E血清型沙眼衣原体（Ct）主要外膜蛋白（MOMP）的结构和功能。方法：采用计算机辅助生物软件和网络数据库,从SwissProt蛋白质数据库中检索MOMP氨基酸序列,用Expasy服务器分析预测MOMP蛋白理化性质、二级结构,同时用Pcons服务器分析模拟蛋白质空间结构。结果：分析显示,Ct MOMP蛋白为一跨膜16次的酸性蛋白质,其空间结构为β-桶状膜蛋白,推测其功能为孔蛋白。结论：通过对MOMP生物信息学分析获得该蛋白的特性,为进一步研究Ct的感染与发病机制、研制Ct亚单位疫苗以及研究MOMP新的功能域等提供理论依据。     

细粒棘球绦虫(中国大陆株)特异性抗原P-29重组蛋白的生物信息学分析

目的应用生物信息学分析软件预测细粒棘球蚴中国大陆株诊断抗原P-29氨基酸序列,了解该蛋白的特性,预测其抗原表位,为P-29进一步应用研究提供理论依据。方法应用DNAStar、BIOSUN、EXPASY/SignalP、protparam、psite/softberry生物分析软件对P-29的二级结构、抗原表位、信号肽、极性进行预测分析,用EXPASY/SWISSMODEL对蛋白的三维结构进行模拟。结果 P-29基因开放阅读框编码一个由238个氨基酸残基组成的多肽,分子式为C1180H1906N324O386S9,其蛋白分子量为27095.58 Da,等电点为5.649,有37个碱性氨基酸,41个酸性氨基酸,68个极性氨基酸和76个疏水性氨基酸,半衰期是30 h,结构稳定,呈亲水性且为带负电荷的酸性蛋白,α-螺旋水平较高,有15个抗原决定簇,无信号肽,有2个N-糖基化位点,6个蛋白激酶C磷酸化位点,11个酪蛋白激酶II磷酸化位点及7个微体羧基端目标信号位点。结论根据生物信息学预测的结果表明,P-29可能是免疫诊断、药物作用及疫苗潜在的靶分子。     

基础免疫学问答

问:抗原与抗原决定簇含义有何不同? 答:抗原和抗原决定簇是免疫学中两个非常重要的术语,就特异性而言,两者含义是相同的,因此,许多文献中将抗原与抗原决定簇二词常常混用,其实,两者含义并不完全相同。抗原常泛指进入机体的一些物质,例如整个细菌。在这种情况下,细菌本身所含的抗原决定簇不仅有多种,而且同一种抗原决定簇也多至数以百计;既使单一蛋白质分子,其表面的抗原决定簇也不止一个。在刺激机体产生免疫应答的过程中,每一种抗原决定簇,均可刺激机体产生一种特异性抗体,并且抗体分子只能与抗原表面相应的抗原决定簇起反应。简言之,抗原常泛指一类具有免疫原性和免疫反应性的物     

阿片受体的结构预测

用电子计算机程序处理人胎盘Ｋ型阿片受体的氨基酸序列，预测出受体的亲水区、疏水区以及二级结构。结果表明亲水区主要分布在受体的Ｃ－末端，具有最高亲水峰的序列可能是受，体的抗原决定簇部分。同时也测出该受体有１８处α－螺旋区，１０处β－折叠区及６处β－转角区，螺旋区主要分布在疏水区。通过预测对阿片受体结构有了一定的了解。     

食管癌DNA聚合酶β基因突变研究中分子生物学软件的应用

目的：尝试应用分子生物学软件研究DNA聚合酶β基因突变后,其编码蛋白、酶结构功能的改变。方法：应用DNASIS、OMIGA、SWISS-PORT等分子生物学软件对前期实验中检测到的DNA聚合酶β基因的某些突变进行推测、评价。结果：核酸一级结构的改变直接导致了相应蛋白一级结构、空间结构的改变。结论：可利用计算机模拟蛋白质空间结构进而推测其功能,但对被研究对象功能、结构的最终评价仍需依赖传统研究方法的证实。     

EB病毒壳抗原在大肠杆菌中的表达及纯化

本文报告对EB病毒壳抗原(VCA)带有抗原决定簇的蛋白质在大肠杆菌中的表达及其纯化。以纯化后的蛋白为抗原检测人血清中VCA/IgA抗体,鼻咽癌病人及某些急性EB病毒感染人群呈抗体阳性.而对照组呈阴性。这一结果提示VCA蛋白在鼻咽癌的普查中有应用价值。     

自身抗原Ro/SSA抗原优势决定簇分析

目的： 探讨自身抗原Ｒｏ／ＳＳＡ（Ｍｒ＝ ６０ ０００）的抗原决定簇,为自身免疫性疾病机制的研究提供依据。方法： 根据计算机软件进行的蛋白质序列结构分析,采用ＰＣＲ法克隆自身抗原Ｒｏ／ＳＳＡ（Ｍｒ＝ ６０ ０００）多肽片段的ｃＤＮＡ,定向插入表达载体ＰＧＥＸ－２Ｔ,并且导入大肠杆菌中表达重组融合蛋白,用ＧＳＴ亲和层析柱进行纯化,经免疫印迹法与患者阳性血清进行反应。结果： Ｒｏ／ＳＳＡ（Ｍｒ＝ ６０ ０００）的抗原优势决定簇主要存在于１００～１９０位和１９１～３００位,不同患者、不同病程抗原优势决定簇有所不同。结论：抗原驱动机制在自身免疫性疾病的发病中起重要作用。     

牛带绦虫成虫谷胱甘肽S-转移酶基因的生物信息学分析

目的:分析牛带绦虫成虫谷胱甘肽S-转移酶(GST)基因结构并预测其编码蛋白的结构和功能。方法:利用生物信息学网站如NCBI和ExPASY系统中的生物信息学分析工具,并结合其它分析软件,分析该基因的结构并预测其编码蛋白质的结构和功能。结果:该基因全长908 bp,编码区为135～771 bp,编码212个氨基酸,无各种亚细胞定位序列;与猪带绦虫GST的一致性为93%,相似性为96%;预测3个主要的抗原表位33～53 aa,62～68 aa,179～184 aa位于空间结构上相距较远的分子表面。结论:从牛带绦虫成虫cDNA文库中筛选出GST基因,预测为胞浆型蛋白,可能具有较好的免疫学诊断抗原应用前景。     

生长相关蛋白GAP-43多肽抗体的制备

目的对生长相关蛋白-43（growth associated proteins-43,GAP-43）进行抗原表位分析并制备兔多克隆抗体。方法通过对GAP-43 cDNA序列及氨基酸序列的结构进行生物信息分析,依据蛋白质的二级结构、亲水性、疏水性、抗原性及理化特性,经过同源性检索后,综合考虑抗体设计的其他因素,选出具有免疫活性的抗原决定簇多肽片段,采用有机固相多肽合成法合成了GAP-43的多肽片段,并与载体蛋白血蓝蛋白（KLH）偶联制备成抗原,免疫新西兰家兔。结果 ELISA测定GAP-43抗体效价为1∶32 000;Western blot检测结果显示：在分子量25kDa出现单一条带;免疫组织化学法检测显示：GAP-43蛋白在小鼠海马神经元中有表达;免疫细胞化学法检测显示：GAP-43蛋白在人神经母细胞瘤株SH-SY5Y中存在表达。结论利用生物信息学软件比较准确地预测GAP-43的抗原决定簇,并成功制备了高效价、高特异性的多肽抗体。     

携带突变k-ras基因的重组腺病毒转染树突状细胞体外诱导的抗肿瘤免疫

近年来，肿瘤疫苗的研究已成为肿瘤免疫治疗的热点之一。肿瘤抗原的发现及确认为肿瘤的免疫治疗尤其是主动性免疫治疗提供了新的手段。有研究证实突变的ras蛋白质产物可被特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)所识别。由于ras基因突变发生在多种类型肿瘤的实质部分，相对应的抗原决定簇也被发现存在于多种肿瘤组织中，有较为一致的突变热点(密码子12，13，61)。许多研究已经证明肺腺癌中k-ras基因12位密码子点突变是频发、常见的，且与患者的预后有关。因此以ras为靶目标，     

妇科恶性肿瘤的免疫治疗

肿瘤的免疫治疗是继传统的手术、放疗、化疗之后发展起来的第四种治疗方法。近年来随着分子生物学、免疫学及基因工程学的迅速发展 ,使人们能在分子水平认识肿瘤的发生、发展及机体的抗肿瘤免疫机理 ,从而研究出了肿瘤的免疫治疗。疫苗是最常用的一种主动免疫疗法 ,目前研究较多的是肽疫苗 ,树突状细胞 (Dendritic cells,DC)疫苗 ,基因工程疫苗和抗独特型抗体疫苗。现综述如下。1　肽疫苗T细胞不能认识完整的肿瘤抗原蛋白 ,它只能识别经加工并与主要组织相容复合体 (MHC)共同表达在细胞表面上的抗原肽 ,这些肽是代表抗原决定簇的小肽 ,能…