优化H-2半相合造血干细胞移植物治疗急性白血病的实验研究

目的　探讨H 2半相合造血干细胞移植物中分离移植物抗宿主病 (GVHD)与移植物抗白血病 (GVL)作用的T淋巴细胞阈值。方法　建立 (C5 7BL 6× 6 15 )F1(H 2 b)白血病鼠模型作为受者 ,以C5 7BL 6 (H 2 b)小鼠为供鼠 ,应用免疫磁珠 (MiniMACS)纯化供鼠的CD34+ 和CD3+ 细胞 ,纯度分别为 ( 81.5± 2 .4) %和 ( 95 .4± 2 .9) %。 6 9只受鼠分为 7组 ,A为白血病自然生存组 ,其余各组均经6 0 Co 9GyTBI,除B组单纯TBI外 ,其余各组均经尾静脉输注供鼠CD34+ 细胞 10 5 只 ,D、E、F、G组移植物中还分别混合CD3+ 细胞每只 10 7,5× 10 7,10 8和 1.5× 10 8,饲养 6 0d ,根据病理确定死因。结果　E组 10 0 %存活 >6 0d ,明显长于其它组 (P <0 .0 0 0 1) ;生存 >6 0d者异性染色体为 10 0 %,D、E组因白血病复发死亡者明显少于C组 (P <0 .0 0 1) ,G组因GVHD死亡者明显高于E、F组 (P <0 .0 0 1)。结论　单纯CD34+ 细胞移植组白血病复发率最高。移植物中CD3+ 细胞 >10 8时因GVHD死亡者最多 ;5× 10 7 只时能够分离重度GVHD和GVL。     

供体Treg细胞对小鼠异基因骨髓移植后GVHD和GVL效应的影响

本研究探讨供体CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cells,Treg cells)输注对异基因骨髓移植(allo-BMT)后小鼠移植物抗宿主病(GVHD)及移植物抗GVL)效应的影响。建立BALB/c→C57BL/6小鼠EL4白血病骨髓移植模型,体外磁珠分离纯化供鼠CD4+CD25+T细胞,在骨髓移植的同时分别予尾静脉输注CD4+CD25+T细胞、CD4+CD25-T细胞。以移植后生存期、GVHD临床评分、组织病理形态等为观察指标并进行组间比较。结果显示:白血病对照组小鼠平均生存时间为(17.9±0.7)天,均存在白血病细胞浸润;移植对照组及效应T细胞组平均生存时间为(23.2±1.6)天和(22.3±1.9)天,肝脏、皮肤和小肠病理切片显示均存在GVHD病理改变;Treg细胞组小鼠平均生存时间为(47.3±6.5)天,70%的受鼠获得长期存活,病理显示无GVHD及白血病细胞浸润,其GVHD评分较移植对照组及效应T细胞组明显降低(p0.05)。结论:在小鼠allo-BMT中联合输注供体CD4+CD25+T细胞可减少及减轻GVHD,并保留GVL效应。     

体外阻断CD137-CD137L途径控制小鼠移植物抗宿主病的研究

目的探讨体外阻断活化的供鼠T淋巴细胞CD137-CD137L共刺激途径控制小鼠异基因骨髓移植（allo-BMT）后急性移植物抗宿主病（aGVHD）及其机制。方法供、受鼠的淋巴细胞体外混合培养，分别加入抗CD137L单抗或不加抗CD137L单抗培养后与供鼠骨髓细胞混合移植给受鼠。采用流式细胞术检测移植后受鼠T细胞亚群的变化，RT-PCR法检测细胞因子mRNA表达水平的变化，观察移植后受鼠GVHD的临床及病理改变。结果与未用抗CD137L单抗组相比，应用抗CD137L单抗组CD3^＋CD8^＋T细胞明显降低（P＜0．01）；IFN-γ表达水平明显减低（P＜0．01），IL-10的表达水平明显升高（P＜0．01）。移植后未预防GVHD组（A组）小鼠移植后15d内均死于aGVHD。采用甲氨蝶呤＋环孢素预防GVHD组（B组）小鼠100％发生aGVHD，但临床及病理改变程度较A组轻，平均存活时间[（9．5±2．5）d]较A组[（7．5±1．5）d]略有延长。采用抗CD137L单抗预防GVHD组（C组）受鼠aGVHD的发生率为70％，程度比A、B两组轻，与A、B两组相比生存率明显提高（P＜0．01），平均存活时间[（16．0±2．5）d]明显延长（P＜0．01），30％的小鼠生存时间大于30d。结论抗CD137L单抗体外阻断CD137-CD137L共刺激途径能有效控制小鼠GVHD，可能与影响Ⅰ类和Ⅱ类T细胞因子平衡有关。     

肝细胞生长因子对急性淋巴细胞白血病小鼠骨髓移植后移植物抗宿主病和移植物抗白血病的影响

目的探讨肝细胞生长因子(HGF)对急性淋巴细胞白血病(ALL)小鼠异基因骨髓移植(alloBMT)后移植物抗宿主病(GVHD)及移植物抗白血病(GVL)的影响及其可能的相关机制。方法随机将20只裸鼠(用于观察白血病复发)分为对照组(A组)和实验组(B组),将20只BALB/c小鼠(用于观察GVHD)分为对照组(C组)和实验组(D组),实验组在移植0天至移植后7天注射HGF,对照组注射PBS。流式细胞术检测HGF对alloBMT后ALL小鼠CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的影响。记录ALL小鼠BMT后的存活时间。观察移植后ALL小鼠肝脏、小肠的GVHD病理变化。ELISA法检测肿瘤坏死因子α(TNFα)的水平。结果A、B、C、D4组小鼠alloBMT后中位生存时间分别为(7.00±1.58),(9.00±1.58),(11.00±3.95),(24.00±13.44)d,D组生存时间明显延长(P值均<0.05)。D组CD4+T淋巴细胞[(10.39±1.15)%]较C组[(13.50±1.81)%]明显降低(P<0.01),CD8+T淋巴细胞[(12.25±2.85)%]较C组[(6.12±1.99)%]明显增加(P<0.01)。D组TNFα水平[(112.10±18.99)pg/ml]明显低于C组[(143.90±25.35)pg/ml](P<0.01)。GVHD明显减轻。结论HGF具有减轻ALL小鼠alloBMT后GVHD程度并且保留GVL的作用。     

昆明山海棠预防小鼠急性移植物抗宿主病的实验研究

目的观察昆明山海棠（THH）对急性移植物抗宿主病（aGVHD）小鼠血浆IFN-y、IL-4、IL-10浓度的影响，探讨THH预防aGVHD的可能机制。方法BALB／c受鼠清髓性预处理后输注C57BL／6供鼠的骨髓细胞和脾细胞混合液，建立aGVHD模型。实验分为4组：对照组（A组）、环孢素（CsA）预防组（B组）、THH预防组（C组）、THH和CsA联合预防组（D组）。观察aGVHD发生情况和受鼠嵌合体植入情况，ELISA法检测各组受鼠血浆IFN-y、IL-4、IL-10浓度。结果①B、c、D组受鼠血浆IFN-y的浓度明显低于A组（P〈0、05），D组下降最明显；IL-4浓度无明显变化；IL-10浓度均高于A组（P〈0．05），D组上升最明显；②A组受鼠移植后中位生存时间为9d，B、C、D组移植后中位生存时间均〉30d，较A组明显延长（P〈0．05）；③A组受鼠均有典型翘毛、弓背、腹泻、体重减轻表现，20d内全部死于GVHD；B、C、D组仅有翘毛、弓背表现，腹泻、体重减轻不明显；B、C组病理改变皮肤无异常，仅肝脏或小肠有少量淋巴细胞浸润；D组存活小鼠病理检查未见明显异常，均比A组轻；④B、C、D组受鼠＋30天骨髓细胞表面H-2^b分子百分率分别为（99．18±0．58）％、（97．68±0．59）％、（99、15±0．11）％。结论THH可以调节aGVHD小鼠细胞因子分泌，可用于aGVHD的预防，小剂量THH与CsA联合应用有协同作用，能减少CsA的用量。     

Th17细胞在小鼠移植物抗宿主病发病早期中的作用

目的 探讨Th17细胞在急性移植物抗宿主病(aGVHD)发病早期的作用及机制.方法 以C57/B6为供鼠,BABL/c为受鼠,致死性全身照射(TBI)后输注供鼠骨髓细胞和脾细胞混合细胞悬液,建立小鼠aGVHD模型.实验分为4组:正常对照组;单纯照射组(IRD);异基因骨髓移植(alloBMT)+二甲基亚砜(DMSO)组;allo-BMT+常山酮(HF)组.从-1 d开始到+10 d,观察小鼠弓背、翘毛、体质量变化等aGVHD的表现并进行临床评分.动态观察小鼠aGVHD发生及存活情况.取小鼠的肝、小肠和皮肤进行病理学分析.用流式细胞术检测移植后小鼠Th1/Th17亚群的变化.结果 移植后实验组小鼠均发生aGVHD,allo-BMT+HF组小鼠aGVHD表现较allo-BMT+DMSO组小鼠严重.病理学分析示allo-BMT+HF组小鼠皮肤损伤较轻,而肝脏和小肠损伤较重,与allo-BMT+DMSO组比较,+6 d allo-BMT+HF组Th17细胞比例明显下降(分别为1.04%和0.71%),Th1比例明显升高(分别为5.35%和12.81%),Th1/Th17比值显著升高(P<0.05).结论 异基因造血干细胞移植早期阻断Th17导致Th1比例明显升高(5.31和18.07),加重aGVHD.

Abstract：

Objective To explore the role of Th17 cells in early onset of acute graft-versus-host disease(aGVHD) and its mechanism. Methods Mice aGVHD model was established by irradiated BABL/c mice inoculated with mixed suspension of C57BL/6 bone marrow cells and splenocytes. The mice were divided into 4 groups:①normal control,②irradiated group, ③allo-BMT + DMSO group,④allo-BMT + halofugine (HF) group. HF was given intraperitoneally at 5 μg per mouse from -1 d to + 10 d after allogeneic bone marrow transplantation(allo-BMT). Mice aGVHD symptoms and survival were observed. Th1/Th17 cells ratio was evaluated by flow cytometry. Results All the experimental groups ③ and ④developed aGVHD after transplantation. More severe aGVHD was observed in group ④than in group ③. HF prevented cutaneous aGVHD in all the mice, but augmented hepatic and small intestine GVHD. The percentage of Th17 cells and the ratio of Th1/Th17 were significantly higher while the percentage of Th1 cells was significantly lower in group ④ at day+6(P<0.05). Conclusion Early blockage of Th17 cell results in increase of Th1 cell percentage, which exacerbates aGVHD.     

同种异基因Th2细胞移植对GVHD和GVL效应的作用

为探讨同种异基因Th2细胞移植是否可以减低移植物抗宿主病(GVHD)的发生和保留移植物抗白血病(GVL)效应的作用,在体外用rmIL-4,Con A和离子霉素把供鼠(C57BL/6H-2b)T细胞优势化诱导培养为Th2细胞,再把Th2细胞与供鼠骨髓细胞混合移植给红白血病受鼠模型(EL9611H-2d).结果表明未处理的对照组,受鼠平均存活时间为(10.6±1.3)天,10只均死于白血病;环磷酰胺化疗组,小鼠平均存活(18.7±4.2)天,10只小鼠最终均死于白血病;骨髓细胞和脾T淋巴细胞移植组,小鼠平均存活(22.7±7.4)天,9/10只均死于GVHD;骨髓细胞和Th2细胞移植组,3/10只在28天内死于GVHD,其余7/10只无GVHD发生,白血病发病时间明显推迟,平均存活(36.9±10.8)天,在50天时检查有2只鼠无白血病证据.研究证明体外极向化诱导培养的Th2细胞移植可减低GVHD发生的同时保留了抗白血病的能力.     

非清除性异基因骨髓移植后输注供者淋巴细胞治疗白血病的实验研究

目的探讨非清除性异基因骨髓移植(allo-BMT)后供者淋巴细胞输注(DLI)是否能减少移植相关并发症、相关死亡和减轻移植物抗宿主病(GVHD),是否能增强移植物抗白血病(GVL)效应.方法荷L615白血病的615(H-2k)小鼠,于接种白血病细胞后第3天接受60Coγ射线全身照射(TBI,5Gy),照射当天移植供鼠BALB/c(H-2d)小鼠的骨髓细胞(3×107)和脾细胞(1×107),移植后第2天腹腔注射环磷酰胺(200mg/kg),分别于移植后第14天和第21天输注供鼠脾细胞(2×107)或移植后第14天输注经氢化可的松(HC)和环孢菌素A(CsA)处理后的供鼠脾细胞(5×107),观察其抗白血病作用.结果移植后第21天输注供鼠淋巴细胞组和移植后14天输注经HC、CsA处理后的淋巴细胞组小鼠生存期明显延长,分别为(45.1±12.8)d和＞50d,而非清除性allo-BMT组为(26.2±3.6)d,第14天输注供鼠淋巴细胞组为(29.3±3.7)d,差异有显著性(P＜0.01),且无明显GVHD发生.结论非清除性allo-BMT后早期输注经HC和CsA处理的供者淋巴细胞或延迟加用DLI可在减轻移植相关并发症的基础上,增强GVL效应,提高长期无病生存率.     

IL-2和IL-15激活供者自然杀伤细胞在异基因造血干细胞移植应用的实验研究

目的 探讨IL-2和IL-15激活的供者自然杀伤(NK)细胞在异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)中减轻移植物抗宿主病(GVHD)发挥移植物抗白血病效应方面的作用.方法 采用免疫磁珠分选小鼠脾NK细胞,采用添加IL-2和IL-15的培养基扩增NK细胞并测定NK细胞杀伤活力.C57BL/6小鼠作为供鼠,BALB/c小鼠作为受鼠,部分小鼠移植前8天静脉接种EL9611白血病细胞.异基因移植小鼠输注骨髓细胞5×106 和脾细胞5 × 106.NK细胞治疗组输注骨髓细胞和脾细胞各5×106 以及激活的NK细胞1 × 107,并且给予腹腔注射IL-2和IL-15.移植后观察GVHD发生、生存期、嵌合度、免疫重建.结果 分选NK细胞纯度为95.7%～97.1%.培养后NK细胞杀伤活力较静息时增加3倍.单纯异基因骨髓细胞输注组小鼠未见GVHD发生,异基因骨髓及脾细胞移植对照组移植后1周起开始出现GVHD表现.实验组小鼠发生GVHD的严重程度明显低于脾细胞输注小鼠(P＜0.05).单纯全身照射预处理小鼠生存期9.5～14.0 d.白血病模型中对照组移植后100 d生存率10%,其余死于白血病;实验组80%生存期超过100 d,实验组生存期明显长于对照组(P＜0.01).实验组小鼠移植后2周外周血NK细胞占4.8%,对照组外周血NK细胞占2.8%,实验组NK细胞恢复早于对照组(P＜0.05).实验组TRBV基因重建比对照组快,而且TRBV家族基因表达数比对照组多,对照组小鼠多见单克隆及寡克隆表达.结论 IL-2和IL-15在体外可以有效促进NK细胞增殖与激活.allo-HSCT时给予激活的供者NK细胞输注以及相关细胞因子处理可以促进免疫重建、减轻GVHD发生、降低白血病复发.     

树突细胞应用于荷白血病小鼠免疫治疗的实验研究

目的探讨白血病抗原活化的树突细胞(DC)应用于荷白血病小鼠异基因骨髓移植 (allo-BMT)后免疫治疗的可行性及有效性。方法应用mGM-CSF及mIl-4从小鼠骨髓细胞扩增出成熟DC,使其负载经冻融法制备的L7212白血病细胞相关抗原。将进行allo-BMT后的荷白血病小鼠分 A(对照组)、B(T细胞组)、C(DC T细胞组)三组进行免疫治疗,观察小鼠生存率、生存期、移植物抗宿主病(GVHD)发生等情况及血清细胞因子水平和脾细胞细胞毒活力变化。对各组长期生存小鼠行二次攻击,以观察其体内抗白血病免疫能力。结果小鼠骨髓单个核细胞经mGM-CSF、mIL-4联合作用7 d可生成大量成熟DC。B、C二组复发率分别为30％及0％,移植后长期生存率分别为30％及 70％,两组差异均有统计学意义(P<0．05),而GVHD发生率差异无统计学意义。两组平均生存时间分别为(32．95±13．29)d、(41．15±13．88)d,差异有统计学意义(P<0．01)。MYT法检测发现C组小鼠脾细胞对L7212细胞产生特异性杀伤作用;EIJSA法检测显示血清中Th1类因子IL-2水平为 (419．75±26．66)pg／ml,明显高于其他两组(P<0．01)。二次攻击后B、C二组生存率分别为33．3％及85．7％,差异有统计学意义(P<0．05)。结论肿瘤抗原负载的DC联合供者淋巴细胞输注是增强 allo-BMT后移植物抗白血病效应、减少白血病复发的有效手段。     

非清除性异基因骨髓移植治疗小鼠白血病的实验研究

目的　研究非清除性异基因骨髓移植 (BMT)及其加供者淋巴细胞输注 (DLI)治疗小鼠白血病是否在保留移植物抗白血病效应 (GVL)的同时 ,又能减轻移植物抗宿主病 (GVHD)及移植相关并发症。方法　采用L6 15淋巴细胞白血病小鼠模型 ,非清除性预处理后移植BALB c小鼠骨髓细胞和脾细胞。分 4组 :清除性BMT对照组 (A组 )、非清除性预处理组 (B组 )、非清除性BMT组 (C组 )、非清除性BMT +DLI组 (D组 )。通过受鼠生存期、外周血白细胞和L6 15细胞计数、死亡鼠尸解观察GVL效应 ;通过体重改变、弓背、翘毛、腹泻等表现和肝脏、小肠、皮肤病理学检查观察GVHD ;通过染色体检查和PCR检测嵌合状态。结果　A、B、C、D组生存时间分别为 (2 0 .3± 13.4 )d、(15 .9± 1.1)d、(2 1.6± 1.7)d和 (37.8± 2 .0 )d ,C组和A组生存时间无统计学意义 (P >0 .0 5 ) ,C组生存时间长于B组 (P <0 .0 1) ,D组长于C组 (P <0 .0 1) ;A组有 6 0 %出现GVHD表现及病理学改变 ,而C组和D组均无典型GVHD表现和病理学改变 ;A组有 4 0 %在 2周内死于移植相关并发症 ,C组和D组均无移植相关死亡发生 ;A组一直保持异基因嵌合 ,C组渐被排斥。结论　非清除性BMT有一定的GVL效应 ,加DLI能增强GVL效应 ;非清除性BMT能减轻GVHD及移植相关并发症。     

供者自然杀伤细胞减轻急性移植物抗宿主病的实验研究

目的探讨骨髓移植中供者自然杀伤(NK)细胞减轻急性移植物抗宿主病(GVHD)的作用与受者总树突细胞(DC)、成熟DC、转化生长因子β1(TGF-β1)的关系。方法C57BL／6小鼠作为供鼠,BALB／c小鼠为受鼠,受鼠接受60Coγ射线全身照射(6．5 Gy)后随机分为4组,对照1组无任何处理,对照2组移植供鼠骨髓,实验1组移植供鼠骨髓同时输注激活的受鼠NK细胞,实验2组移植供鼠骨髓同时输注激活的供鼠NK细胞,观察受鼠生存期、GVHD临床和病理表现,检测总DC、成熟DC以及TGF-β1含量。结果对照1组小鼠未发生GVHD,其余三组均发生GVHD。但实验2组GVHD临床和病理评分分别为(3．1±1．2)分和(2．5±1．1)分,较对照2组GVHD程度[分别为(7．2±1．3)分和(7．5±1．1)分]明显减轻(P<0．01),实验1组分别为(8．5±1．0)分和(8．8±1．7)分,较对照2组GVHD加重(P<0．05)。移植后4周,对照1组、对照2组、实验1组和实验2组CD11c+细胞分别占26．1％,24．7％,24．1％,8．6％,CD86+细胞分别占10．2％,19．3％,23．4％,6．1％,CD80+细胞分别占16．1％,24．6％,33．2％,5．1％。实验2组受者总DC和成熟DC含量较对照2组明显减少(P< 0．05),实验1组成熟DC含量较对照2组增加(P<0．05)。实验2组TGF-β1含量较对照2组增加(P<0．05),实验1组较对照2组减少(P<0．05)。结论供者NK细胞减轻GVHD的机制与其减少受者总DC和成熟DC数量以及增加TGF-β1含量有关,这种作用可能与杀伤细胞抑制受体(KIR)-主要组织相容复合物(MHC)Ⅰ不匹配有关。     

应用扩增的Treg预防异基因骨髓移植后移植物抗宿主病的实验研究

目的：探讨扩增后的CD4+CD25+调节T细胞(regulatory T cell ,Treg)输注对异基因骨髓移植(allo-BMT)后小鼠移植物抗宿主病(GVHD)的影响。方法：利用免疫磁珠法分选小鼠Treg细胞； 以抗鼠 CD3ε 单抗、抗鼠CD28 单抗 、鼠重组 IL-2及辐射过的Balb/C小鼠脾细胞为共刺激因子，扩增TREG细胞；建立C57BL/6→BALB/c小鼠allo-BMT模型,接受移植小鼠随机分为3组,移植骨髓后6-8小时后分别予尾静脉输注扩增的Treg细胞、CD4+CD25-T细胞和RPMI 1640培养液(空白对照)。以移植后GVHD表现,肝、脾、小肠组织病理形态、生存期为观察指标并进行组间比较。结果：经免疫磁珠法分选可获得高纯度(91.80±2.15)%及具较强活力(97.58±1.23)%的Treg细胞；移植后(四周左右)的扩增后Treg细胞移植组小鼠肝、脾、小肠GVHD病理损害较同期CD4+CD25-T细胞移植组与空白对照组小鼠有一定程度的减轻。3组小鼠移植后平均存活时间分别为（61. 45±27. 88）天、(18.58±12. 39)天和(26. 37±15. 65)天, 扩增后Treg细胞移植组小鼠平均存活时间较CD4+CD25-T细胞、空白对照组小鼠延长(P<0.05)。结论：allo-BMT后输注增殖的Treg细胞可以减轻移植后GVHD程度,延长小鼠生存时间。     

异种骨髓移植移植物抗宿主反应的实验动物模型

为了观察大鼠和小鼠间异种骨髓移植中移植物抗宿主病 (GVHD)的现象 ,建立动物模型。受体BALB/c小鼠接受 8.5Gy全身照射后 ,一组 (n =10 )输入SD大鼠骨髓细胞 4× 10 7,另一组 (n =10 )输入SD大鼠骨髓细胞 4× 10 7及脾细胞 2× 10 7,观察 6 0天 ,记录受鼠发生GVHD情况。结果表明 :单纯骨髓细胞输入组 8只鼠存活超过 6 0天 ,另 2只鼠分别于 18天和 31天死亡 ,肝、小肠病理切片未见明显GVHD。而骨髓细胞及脾细胞输入组均于14天内死亡 ,肝、小肠病理切片证实有GVHD。结论 :大、小鼠间异种全骨髓细胞移植未见明显GVHD ,建立GVHD模型需要加入脾细胞     

移植物化学修饰与阻断 OX40-OX40L途径预防异基因骨髓移植小鼠移植物抗宿主病的研究

目的 观察甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酸酯(mPEG-SPA)与抗OX40L单抗预处理移植物对小鼠异基因骨髓移植后急性移植物抗宿主病(aGVHD)的影响及其机制.方法 供、受鼠的脾淋巴细胞体外混合培养,加入抗OX40L单抗孵育培养后,再用mPEG-SPA化学修饰,与C57BL/6供鼠骨髓细胞混合后移植给经致死量全身照射的BALB/c受鼠.同时设相应的对照组.观察移植后受鼠aGVHD的临床表现、病理学改变、存活时间及生存率等,检测移植鼠T淋巴细胞亚群,细胞因子的变化及异基因嵌合体.结果 ①单纯骨髓移植对照组小鼠均出现aGVHD临床表现,17 d内全部死于aGVHD,存活时间为(12.1±5.5)d;而mPEG-SPA和抗OX40L单抗单独或联合预处理组小鼠一般状态较好,部分出现aGVHD表现,且较单纯骨髓移植对照组症状轻,皮肤、肝脏、小肠病理表现均较单纯骨髓移植对照组明显减轻,mPEG-SPA和抗OX40L单抗单独或联合预处理组小鼠存活时间分别为(36.2±24.9)、(32.0±24.8)和(44.3±23.2)d,均较单纯骨髓移植对照组明显延长(P＜0.05),其中抗OX40L mPEG-SPA联合预处理组小鼠平均存活时间最长(P＜0.05),mPEG-SPA单独预处理组和抗OX40L单独预处理组牛存率分别为50.0%、41.7%,明显高于单纯骨髓移植组,OX40L mPEGSPA联合预处理组生存率最高,为66.7%.②移植后对照组小鼠血清IFN-γ浓度升高,在+10～+15d时达高峰;而mPEG-SPA和抗OX40L单抗单独或联合预处理组降低,+10 d时降至最低,OX40LmPEG-SPA联合预处理组降低最明显(P＜0.01).移植后对照组IL4、IL-10浓度轻度降低,而mPEG-SPA和抗OX40L单抗单独或联合预处理组均明显升高(P＜0.05),+10～+15 d达高峰,以联合组升高最明显(P＜0.01).③mPEG-SPA和抗OX40L单抗单独或联合预处理组+60 d时异基因嵌合率为95%～100%,证实为完全供者型植入.结论 mPEG-SPA与抗OX40L单抗联合应用能够阻断T细胞激活的抗原和共刺激双信号通路,协同抑制T细胞的增殖活性,促进Th0细胞向Th2细胞分化,从而明显减轻小鼠骨髓移植中aGVHD的发生.     

延迟连续骨髓移植对主要H-2不合小鼠移植后急性移植物抗宿主病的影响

目的 研究延迟连续骨髓移植对主要H-2不合小鼠移植后急性移植物抗宿主病(aGVHD)的影响.方法 以近交系C57BL/6(H-2b)小鼠为供鼠、BALB/c(H-2d)小鼠为受鼠,受鼠接受总剂量为8.0 Gy 60Co γ射线全身照射(TBI)后,实验分为5组:①空白对照组(只输注0.4 ml RPMI 1640);②经典移植组(TBI后4 h输注);③连续移植组(TBI后4 h,1、2、3 d连续输注);④延迟移植组(TBI后4 d输注);⑤延迟连续移植组(TBI后4、5、6、7 d连续输注).移植后用流式细胞术检测各组受鼠H-2b细胞植入水平,ELISA法测定IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ的血浆浓度,比较各组的生存率、aGVHD发生情况及造血重建情况.结果 经典移植组出现典型aGVHD表现,均于3周内死亡,连续移植组、延迟移植组60 d生存率分别为30%、50%,延迟连续移植组出现aGVHD的小鼠数量少、程度轻,60 d存活率70%,高于其他组(P＜0.05).延迟移植组和延迟连续移植组血浆IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10分泌高峰较经典移植组延迟5～10 d,IL-4、IL-10的表达高于经典移植组(P＜0.05),IL-2、IFN-γ的表达低于经典移植组(P＜0.05).各组血浆IL-6浓度均于TBI后5～10 d达高峰,且经典移植组的表达高于其他组(P＜0.05).延迟连续移植组60 d时H-2b细胞的百分率为(98.1±1.1)%,20d时外周血白细胞计数恢复正常.结论 延迟连续骨髓移植可减轻小鼠异基因移植后的aGVHD,提高生存率,不影响骨髓植入和造血重建,是合适的移植方式,其减轻aGVHD机制可能与减少T细胞Ⅰ类细胞因子分泌,促进Ⅱ类细胞因子分泌有关.     

体外阻断CD_(40)-CD_(40)L共刺激途径减轻小鼠异基因骨髓移植中移植物抗宿主病的研究

目的　在异基因骨髓移植移植物抗宿主病 (GVHD)小鼠模型中 ,观察抗CD4 0 L单克隆抗体 (单抗 )体外预处理供鼠T细胞输注 ,观察其减轻GVHD的作用并探讨其作用机制。方法　供鼠(C5 7BL 6 H 2b)脾T细胞作为反应细胞 ,受鼠 (BALB cH 2d)脾细胞作为刺激细胞 ,分别加抗CD4 0 L单抗或不加单抗进行混合培养 ,培养第 5天的细胞作为经体外诱导后的脾T淋巴细胞 ,分别混合供鼠骨髓细胞后移植给接受 8.0Gy全身照射预处理的受鼠。比较受鼠GVHD发生和造血重建。在移植后不同时间点采用流式细胞仪检测受鼠脾细胞中T细胞表型的改变 ,用ELISA法检测外周血血清中Th1和Th2类细胞因子的水平。结果　移植后对照组受鼠均于 2 5d内死于GVHD ,实验组GVHD的发生率为2 0 % ,与对照组小鼠相比 ,存活率和存活时间明显增高和延长 (P <0 0 1) ;存活的实验组小鼠 (8只 )第4 0天时骨髓细胞中H 2Db 阳性细胞为 (93.5 4± 2 .32 ) %。实验组小鼠CD3+ CD4+ 、CD3+ CD8+ 、CD4+CD2 5+ 、CD4+ CD6 9+ 、CD8+ CD2 5+ 、CD4+ CD4 0 L+ 和CD8+ CD6 9+ T细胞比例明显低于对照组 (P <0 .0 5 ) ,CD8+ CD4 0 L+ 和CD4+ CD4 5RA+ T细胞比例在两组中变化差异无显著性 (P >0 .0 5 )。实验组受鼠血清中细胞因子水平明显低于对照组 (P <0 .0 5 )。结论　应     

体外阻断CD40-CD40L共刺激途径减轻小鼠异基因骨髓移植中移植物抗宿主病的研究

目的在异基因骨髓移植移植物抗宿主病(GVHD)小鼠模型中,观察抗CD40L单克隆抗体(单抗)体外预处理供鼠T细胞输注,观察其减轻GVHD的作用并探讨其作用机制.方法供鼠(C57BL/6H-2b)脾T细胞作为反应细胞,受鼠(BALB/cH-2d)脾细胞作为刺激细胞,分别加抗CD40L单抗或不加单抗进行混合培养,培养第5天的细胞作为经体外诱导后的脾T淋巴细胞,分别混合供鼠骨髓细胞后移植给接受8.0 Gy全身照射预处理的受鼠.比较受鼠GVHD发生和造血重建.在移植后不同时间点采用流式细胞仪检测受鼠脾细胞中T细胞表型的改变,用ELISA法检测外周血血清中Th1和Th2类细胞因子的水平.结果移植后对照组受鼠均于25 d内死于GVHD,实验组GVHD的发生率为20%,与对照组小鼠相比,存活率和存活时间明显增高和延长(P<0.01);存活的实验组小鼠(8只)第40天时骨髓细胞中H-2Db阳性细胞为(93.54±2.32)%.实验组小鼠CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD25+、CD4+CD69+、CD8+CD25+、CD4+CD40L+和CD8+CD69+T细胞比例明显低于对照组(P<0.05),CD8+CD40L+和CD4+CD45RA+T细胞比例在两组中变化差异无显著性(P>0.05).实验组受鼠血清中细胞因子水平明显低于对照组(P<0.05).结论应用抗CD40L单抗体外孵育的脾T细胞与骨髓细胞混合移植,可明显减少GVHD的发生率,且不影响供鼠造血干细胞的植入,CD4+和CD8+T细胞对异体抗原发生耐受,耐受化T 细胞的活化障碍发生于活化的早期和成熟阶段,同时抑制了Th1和Th2类细胞因子分泌,为抗CD40L单抗应用于临床移植预防GVHD提供了实验依据.     

骨髓间充质干细胞对小鼠急性移植物抗宿主病的预防及治疗作用

目的 观测小鼠骨髓间充质干细胞(MSC)对急性移植物抗宿主病(aGVHD)的预防及治疗作用,并探讨其干预机制.方法 建立以C57BL/6小鼠为供体、致死剂量照射的BALB/c小鼠为受体的aGVHD动物模型.将小鼠分成6组:PBS组(单纯放射组)、BM组(单纯输注骨髓)、GVHD组(输注骨髓+脾细胞)、MSC-A组(输注骨髓+脾细胞,并于移植当天输注1×10~5 MSC)、MSC-B组(输注骨髓+脾细胞,并于移植当天输注5×10~5 MSC)、MSC-C组(输注骨髓+脾细胞,并于+7 d输注1×10~5 MSC),观测各组的生存状态;绿色荧光蛋白基因(Ad-EGFP)转染MSC,输入aGVHD模型小鼠,观察MSC在靶器官组织中的分布.结果①供体MSC可显著控制小鼠的GVHD症状,延长aGVHD小鼠的平均生存时间:PBS组为(13.5±2.6)d、GVHD组为(11.1±4.0)d,MSC-A组为(26.4±7.7)d、MSC-B组为(22.7±9.2)d,MSC-C组为(22.9±8.2)d,MSC各组与GVHD组比较差异均有统计学意义(P＜0.01),但MSC各组之间无明显差异(P=0.28).病理评估显示MSC可明显减少小肠及脾脏组织中淋巴细胞的浸润,减轻损害.②MSC可明显减少aGVHD环境中Th1类炎性因子的分泌:GVHD、MSC.A、MSC-B、MSC-C各组+14 d外周血上清中IFN-γ的水平分别为(607.9±157.1)、(143.6±37.5)、(117.0±77.8)、(131.4±63.4)ng/L,各组TNF-α的水平分别为(52.31±17.95)、(6.02±3.99)、(5.21±0.28)、(22.39±18.21)ng/L;MSC不影响aGVHD环境中异基因T淋巴细胞的增殖,但促进其凋亡:GVHD、MSC-A、MSC-B、MSC-C各组的CD3+ Annexin V+ PI-细胞率分别为(10.3±6.6)%、(13.5±13.8)%、(19.7±6.0)%、(16.6±7.3)%,其中MSC-B组与GVHD组比较差异具有统计学意义(P＜0.05).③Ad-EGFP成功高效转染MSC,输注入aGVHD模型鼠6 d后,共聚焦显微镜下发现MSC可大量分布至肺及小肠,而肝、脾及肾脏有少量分布.结论 MSC可促进异基因T淋巴细胞凋亡、抑制其二次活化功能、减少Th1类炎症因子的分泌表达、参与修复aGVHD靶器官组织,可有效防治aGVHD.     

慢病毒载体介导单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦系统抑制移植物抗宿主病的实验研究

目的研究慢病毒载体介导单纯疱疹病毒胸苷激酶／更昔洛韦（HSV-TK／GCV）系统对小鼠异基因骨髓移植（allo—BMT）后移植物抗宿主病（GVHD）的防治作用。方法将转染HSV-TK基因的慢病毒感染供鼠（C57BL／6小鼠）脾脏淋巴细胞，将感染后的淋巴细胞与供鼠骨髓细胞混合，移植给经。Co1射线照射后的受鼠（BALB／c小鼠）。分别于移植后当天、移植后7天（＋7天）和＋12天腹腔注射GCV25mg／kg×7d，观察受鼠生存期、GVHD发生率及严重程度、T细胞亚群（CD3、CD4、CD8）及异基因嵌合等指标。结果HSV-TK／GCV使用0天、＋7天、＋12天组受鼠生存时间分别为（30．10±5．21）d、（36．40±5．28）d、（28．20±4．82）d，三组生存时间均较移植对照组[（15．10±0．43）d]明显延长（P〈0．05）；HSV-TK／GCV＋7天组小鼠50d存活率达60％，高于HSV-TK／GCV0天（40％）和＋12天组（30％）（P〉0．05）。对照组小鼠全部发生Ⅲ～Ⅳ级GVHD，实验组死亡小鼠有Ⅱ～Ⅲ级GVHD病理学改变，而长期生存小鼠仅出现Ⅰ～Ⅱ级GVHD。在＋5，＋10，＋15d，3个时间点实验组小鼠CD4^＋细胞明显高于对照组（P〈0．05），CD8^＋细胞均低于对照组（P〈0．05）。＋30天受鼠异基因嵌合率为100％。结论慢病毒载体介导的HSV-TK／GCV系统能有效控制小鼠allo—BMT后GVHD；＋7天外周血白细胞数开始回升时用GCV控制GVHD效果最佳。