慢性房颤患者右心房细胞电压依赖性钾电流变化的研究

目的：研究风湿性心脏病（RHD）慢性房颤（AF）对心房肌细胞膜电压依赖性外向钾电流的影响，探讨和评价心房电重塑（AER）中钾电流变化的作用和意义。 方法： 采用急性分离的人心房肌细胞，应用膜片钳全细胞技术，记录18例风心病非房颤（NAF）和18例慢性AF患者右心房肌细胞两种电压依赖性外向钾电流：瞬间外向钾电流（Ito1）和超快速激活钾电流（IKur），并比较两组的电流-电压曲线。结果： 在钳制电位+10 mV-+60 mV下，AF组的Ito1密度均较NAF组Ito1值明显降低（P<0.05），在钳制电位+60 mV时，AF组Ito1密度较NAF组低57.5%（P<0.05）。在钳制电位0 mV-+40 mV时，AF组IKur值明显低于NAF组（P<0.05）；其中，AF组IKur密度在钳制电位+40 mV时，较NAF组低47.0%（P<0.05）。结论： Ito1和IKur的改变均可能是慢性房颤时AER中多种离子通道重塑作用中的重要表现，可能与AF时心肌细胞的传导性、不应期的改变和频率适应性变化有关，与其它离子通道改变以及AF发生和持续的关系尚需进一步研究证明。     

牵张刺激对乳大鼠心房肌细胞瞬时外向钾电流和内向整流钾电流的影响

 目的：探究牵张刺激对乳鼠心房肌细胞瞬时外向钾电流（Ito）、内向整流钾电流（IK1）和动作电位时程（APD）的影响。方法：取1日龄SD乳大鼠心脏,分离、消化获得心房肌细胞。于细胞牵引装置培养24 h分组：对照组不予牵张刺激;牵张组予增加12%硅胶膜面积牵张刺激24 h。膜片钳全细胞记录方法记录细胞膜Ito、IK1和APD的变化。结果：在+60 mV刺激电压水平,牵张组Ito密度与对照组相比明显降低［(16±04）pA/pF vs (121±29) pA/pF,P<001］。在-120 mV刺激电压下,牵张组IK1密度较对照组增大［（-108± 08） pA/pF vs (-88±09)pA/pF,P<001］。牵张组动作电位复极50%（APD50）和复极90％（APD90）均较对照组明显缩短［(105±14）ms vs (155±24) ms,(300± 28) ms vs (563±36) ms,P<001］。结论：牵张刺激可降低乳大鼠心房肌细胞Ito密度,增大IK1密度,缩短APD,这可能是压力负荷增大致心房电重构的基础之一。     

慢性房颤患者心房肌细胞乙酰胆碱敏感钾通道的研究

目的： 研究慢性房颤时乙酰胆碱敏感钾通道电流及其基因表达的变化，探讨该离子通道变化在房颤发生与发展中的作用。 方法： 膜片钳全细胞技术记录风湿性心脏病慢性房颤患者和窦性心律患者心房肌细胞乙酰胆碱敏感钾通道电流，分析两组的电流密度-电压关系曲线；半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)测量心房肌细胞乙酰胆碱敏感钾通道基因(Kir3.4)mRNA表达的变化。 结果： （1）与窦性心律组比较，在测试电位-80 mV--120 mV时，慢性房颤组心房肌细胞乙酰胆碱敏感钾通道电流密度明显减小。其中测试电位为 -100 mV 时，慢性房颤组电流密度为(-11.665±1.027)pA/pF(n=11)，窦性心律组为(-19.486±0.766) pA/pF(n=11) (P<0.01)。（2）慢性房颤组心房肌细胞Kir3.4 mRNA表达低于窦性心律组54.3%，为0.523±0.301(n=11) vs 0.239±0.102 (n=11), P＜0.01。 结论： 慢性房颤时乙酰胆碱敏感钾通道电流密度的改变与乙酰胆碱敏感钾通道基因表达下调呈正相关，该通道的改变可能与房颤的发生和发展有关。     

灯盏花素对大鼠心室肌细胞瞬间外向和内向整流钾电流的影响

目的：研究灯盏花素对大鼠心室肌细胞膜瞬间外向钾电流（I_to）和内向整流钾电流(I_K1)的影响，在离子通道水平探讨灯盏花素的抗心律失常作用机制。方法： 用急性酶解法获得单个大鼠心室肌细胞，标准的全细胞膜片钳技术记录I_to和I_K1。结果：(1) 灯盏花素呈浓度依赖性抑制I_to，在+50 mV时，0.02、0.05、0.08、0.10 (g· L^-1)灯盏花素分别阻断Ito峰电流(10.07±0.30)%、(27.47±1.25)%、(42.72%±1.30)% 和(56.09±2.10)%，冲洗后可以完全恢复。在+50 mV时，0.10 g·L^-1灯盏花素使峰电流从（29.61±3.40）pA/pF 减少至（13.00±1.80）pA/pF (n=5，P<0.05)。（2）灯盏花素呈电压依赖性抑制I_to，在0～+50 mV,各浓度随电压增加抑制作用明显减弱。（3）0.10 g·L^-1灯盏花素对I_to失活、激活和复活曲线无明显影响。（4）0.10 g·L^-1灯盏花素对I_K1无明显影响。结论： 灯盏花素能够抑制心肌细胞I_to，呈浓度依赖性和电压依赖性，对I_K1无明显影响，这可能是其抗心律失常作用的重要机制之一。     

成年大鼠脑内ATP敏感性钾通道亚型mRNA表达的研究

为探讨ATP敏感性钾通道(KATP)亚型在大鼠脑组织中的表达,本研究采用半定量逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)检测了大鼠小脑、大脑皮质、海马、纹状体、黑质的KATP亚型mRNA的表达。结果显示Kir6. 1、Kir6. 2、Sur1、Sur2B在小脑、大脑皮质、海马、纹状体、黑质中均有表达,Sur2A在脑组织中未见表达。Kir6. 1mRNA在海马和黑质的相对表达水平明显高于小脑、大脑皮质和纹状体(P<0.01);Kir6. 2和Sur1mRNA在黑质的相对表达水平明显高于小脑、大脑皮质、海马和纹状体 (P<0.01 );Sur2BmRNA在黑质、海马和纹状体的相对表达水平明显高于小脑和大脑皮质(P<0.01 )。以上结果提示KATP在脑内具有广泛表达,其表达水平在不同部位存在着差异性。     

家兔陈旧性心肌梗死心室肌细胞钾离子电流的变化

目的:探讨陈旧性心肌梗死(HMI)心律失常的发生机制,观察HMI非梗死区心肌细胞动作电位时程(APD)、瞬时外向钾电流(I_to)、延迟整流钾电流(I_K)和内向整流钾电流(I_K1)的变化。方法: 12只家兔随机分为2组,陈旧性心肌梗死组(HMI)开胸结扎冠状动脉左回旋支,假手术组开胸但不结扎冠状动脉。3个月后应用全细胞膜片钳技术记录非梗死区心肌细胞的APD、I_to、 I_K和I_K1。 结果: (1)HMI组心肌细胞的膜电容明显高于假手术组;(2)HMI组心肌细胞的APD显著延长,并有早期后除极(EAD)出现;(3)HMI组心肌细胞I_to 、I_K,tail和I_K1的电流密度分别为(4.03±0.33)pA/pF、(1.14±0.11)pA/pF和(17.6±2.3)pA/pF,显著低于假手术组的(6.72±0.42)pA/pF、(1.54±0.13)pA/pF和(25.6±2.6)pA/pF(P<0.01)。结论: HMI非梗死区心室肌细胞I_to 、I_K,tail、和I_K1的电流密度的降低是其APD延长和EAD出现的离子流基础,而APD延长和EAD的出现,可能在HMI恶性心律失常的发生中起着重要作用。     

血小板活化因子对豚鼠心室肌细胞钾电流及动作电位的影响

 目的：研究血小板活化因子(PAF)对豚鼠心室肌细胞钾电流及动作电位的影响。 方法:应用全细胞膜片钳技术，记录豚鼠心室肌细胞动作电位及钾电流(I_K 与I_K1)。 结果:当电极内液ATP浓度为5 mmol/L，1 μmol/L PAF使APD₉₀由对照的(225.8±23.3)ms延长至(352.8±29.8)ms(n=5, P<0.05)；使I_K尾电流在指令电压 +30 mV 时由对照的(173.5±16.7)pA降为(152.1±11.5)pA(P<0.05, n=4)；使I_K1在指令电压 -120 mV 时从(-6.1±1.3)nA降为(-5.6±1.1)nA(P<0.05, n=5)；当电极内液ATP 为0 mmol/L，APD₉₀明显缩短，1 μmol/L PAF使APD₉₀由对照的(153.0±24.6)ms缩短为(88.2±19.4)ms (n=5, P<0.01)，而用1 μmol/L格列本脲 ( I_KATP特异性阻滞剂)预处理后，恢复了PAF可显著延长动作电位时程的作用。 结论: PAF使缺血区K_ATP开放，动作电位时程缩短，却可抑制正常区I_K 与I_K1，使动作电位延长，从而放大了缺血区与正常区的不均一性，这可能与缺血时心律失常的发生有关。     

Kv1.2、Kv1.5、Kv2.1钾通道在缺氧性肺血管收缩中的作用

目的和方法:雄性Wistar大鼠随机分为两组:常氧对照组和低氧组。用酶消化的方法获得单个大鼠肺内动脉平滑肌细胞(PASMC)。采用全细胞膜片钳技术,记录PASMC静息膜电位(Em)和电压门控性钾通道电流(IKv),通过细胞内灌流Kv1.2/Kv1.5/Kv2.1抗体混合液(1∶125),探讨Kv1.2、Kv1.5、Kv2.1钾通道在缺氧性肺血管收缩(HPV)中的作用。结果:①低氧组膜电位明显去极化,由(-51.8±0.8) mV 去极到(-47.2± 0.7) mV,P<0.01,IKv与常氧组相比显著降低,在测试电压-30 mV时, IKv由(6.16±0.58) pA/pF 降为 (3.31±0.37) pA/pF (P<0.01)。②细胞内灌流Kv1.2/Kv1.5/Kv2.1抗体混合液可显著抑制常氧对照组PASMC 的IKv,使Em去极化,然而细胞内灌流Kir2.1/Kir2.3/Kir4.1(1∶125)抗体混合液对常氧对照组PASMC 的IKv和Em无显著影响。③细胞内灌流Kv1.2/Kv1.5/Kv2.1抗体混合液和Kir2.1/Kir2.3/Kir4.1抗体混合液对低氧组PASMC的IKv和Em均无显著影响。结论:Kv1.2、Kv1.5、Kv2.1可能是氧敏感型通道,并介导了低氧性肺血管收缩。     

MMP9及TIMP1 mRNA在先兆子痫患者胎盘中的表达及其意义

目的检测基质金属蛋白酶9及其抑制物1的mRNA(MMP9mRNA、TIMP1mRNA)在先兆子痫患者胎盘中的表达,以探求MMP9在先兆子痫发病机制中的意义.方法用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测正常妊娠(10例),先兆子痫(22例)剖宫产后胎盘中MMP9、TIMP1基因在转录水平的表达.结果重度先兆子痫胎盘中MMP9mRNA表达量降低(0.05±0.04),TIMP1mRNA表达量增加,MMP9/TIMP1比值下降(0.04±0.03),与轻度先兆子痫及正常对照组比较有明显意义.结论 MMP9表达在基因转录水平就已经下调,同时因TIMP1表达增强其活性进一步被抑制,因而在先兆子痫的发生和发展中有重要意义.     

Zacopride增强心肌内向整流钾电流(IK1)效应的受体和信号转导通路

目的:探讨5-HT4受体激动剂兼5-HT3受体阻断剂zacopride增强心肌内向整流钾电流(IK1)效应的受体和细胞信号转导机制.方法:应用全细胞膜片钳技术记录大鼠心室肌细胞膜IK1电流,分别观察10 μmol/L 5-HT4受体阻断剂 RS23597-190、10 μmol/L 5-HT3受体激动剂间氯苯双胍(m-CPBG)、5 μmol/L PKA 抑制剂 KT5720、5 μmol/L PKC 抑制剂GF109203x 和 5 μmol/L PKG抑制剂 KT5823对zacopride 增强IK1的影响.结果:10 μmol/L 5-HT4受体阻断剂RS23597-190本身可抑制IK1电流,在预先应用RS23597-190的基础上,1 μmol/L zacopride仍可明显激动IK1通道,使其内向电流(-100 mV)增强32.5% (P< 0.05).10 μmol/L 5-HT3受体激动剂m-CPBG对IK1电流无明显影响,也不能逆转1 μmol/L zacopride对IK1的增强效应(P> 0.05).此外,5 μmol/L PKA 阻断剂 KT5720能显著抑制1 μmol/L zacopride对IK1的增强效应(P< 0.05),而PKC 阻断剂GF109203x和PKG阻断剂KT5823则对1 μmol/L zacopride的效应无明显影响(P> 0.05).结论:Zacopride对 IK1的增强作用可能经由PKA介导的信号转导通路,而不依赖于5-HT3和5-HT4受体.     

风湿性心脏瓣膜病合并房颤中异常钾离子通道的实验研究

目的 探讨心脏瓣膜病合并房颤患者心房组织中异常活动钾离子通道的类型及功能。方法 对2015年8月—2016年7月蚌埠医学院第一附属医院心脏外科32例二尖瓣和/或主动脉瓣置换术患者资料进行回顾性分析。其中,男14例、女18例,年龄48~71岁;房颤患者19例,窦性心律患者13例。在体外循环开始前,常规取房颤患者的左右心房组织及窦性心律患者的右心房组织,置于液氮中备用。通过转录组学及逆转录-PCR方法,对比房颤患者的左右心房组织与窦性心律患者的右心房组织中钾离子通道表达,分析与房颤发生相关的特异性钾离子通道。结果 转录组学分析发现在房颤组中,钾离子通道在生物过程、细胞成分及分子功能上差异均有统计学意义(P值均＜0.01);钾离子通道KCNMB1在房颤组内的左、右房间的表达差异无统计学意义(0.24±0.02 vs 0.28±0.04, P＞0.05),KCNH7 (0.29±0.03 vs 0.45±0.06, P＜0.05)、KCNH2 (0.24±0.04 vs 0.79±0.1, P＜0.01)、KCNJ4 (0.1±0.02 vs 0.75±0.1, P＜0.01)、KCNA6 (0.33±0.03 vs 0.89±0.05, P＜0.01)、KCNK5 (0.21±0.04 vs 0.94±0.04, P＜0.01)和KCNN2 (0.35±0.06 vs 0.58±0.1, P＜0.05)差异均有统计学意义。结论 在心脏瓣膜病合并房颤患者中,多种钾离子通道功能异常,其中KCNH7、KCNH2、KCNJ4、KCNA6、KCNK5及KCNN2与房颤的发展有关。     

人类肠道病毒分子生物学分型鉴定方法的建立及应用

目的 建立人类肠道病毒（HEV）分子生物学分型鉴定方法,用于临床分离肠道病毒的分型鉴定.方法 根据已知各型别人类肠道病毒基因的核苷酸序列和文献资料,分别合成HEV种属特异性和分型鉴定引物;提取病毒RNA,采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）扩增病毒cDNA,通过琼脂糖凝胶电泳和核苷酸序列分析,鉴定病毒并分型,并与血清中和试验相互验证.结果 采用种属特异性引物鉴定18株疑似HEV毒株,其中17株阳性;型特异性引物鉴定结果：18株病毒中4株为科萨奇病毒A24型,3株为科萨奇病毒B3型;科萨奇病毒B2、A9、A15型、埃可病毒3、6、7、9、11、14、33型和鼻病毒9型各1株,分型结果与中和试验相符.结论 建立的人类肠道病毒分子生物学分型鉴定方法,具有特异性强、敏感性高、快速简便等优点,可以直接鉴定并分型诊断人类肠道病毒感染,适用于人类肠道病毒感染的实验室诊断和流行病学研究.     

血管紧张素Ⅱ对心房颤动患者外向钾电流的作用

目的：研究血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对心房颤动(AF)患者心房肌外向钾电流的作用及其受体机制。方法: 采用急性酶解法获取游离心房肌细胞，应用膜片钳全细胞技术记录外向钾电流。结果: (1) 在钳制电位-10 mV~+50 mV时, AF组瞬时外向钾电流(I_to1)密度明显低于窦性心律(SR)组（P<0.01），而持续性外向钾电流（I_sus）密度与SR组无明显差异。(2) 以0.1 μmol/L AngⅡ灌流后，在钳制电位0 mV~+50 mV时，SR患者的Ito1密度明显低于灌流前（P<0.01），其动力学特性没有改变，AngⅡ对AF组I_to1的抑制作用明显低于SR组 (P<0.01)。0.1 μmol/L AngⅡ对两组I_sus没有影响。(3) AngⅡ对Ito1的抑制作用可逆，10 μmol/L缬沙坦（valsartan）以及1 μmol/L沙拉新(saralasin)均能完全消除0.1 μmol/L AngⅡ对Ito1的抑制，以10 μmol/L valsartan灌流后，膜电位+50 mV时I_to1的电流密度增加（22.46±4.30）%。结论: AngⅡ通过Ⅰ型受体（AT₁R）介导，明显抑制心房肌细胞膜I_to1，是AF患者心房肌瞬时外向钾通道电重构的机制之一。     

微量酶标夹心杂交法定量检测人iNOS-mRNA

目的：建立一种高灵敏度、高特异性、精确、简便的微孔板酶联夹心杂交技术，对人iNOS-mRNA进行定量检测。方法：设计两条特异探针，其中一条为捕获探针，5'端连接氨基，能与微孔板表面的NOS基团共价结合，“竖直”地包被在微孔中，另一个为检测探针，3'端带有生物素标记。用脂多糖（LPS）刺激人外周血单个核细胞24 h后，提取巨噬细胞总RNA，进行RT-PCR扩增，PCR产物热变性后加入到已包被捕获探针的微孔板内，并加入检测探针进行夹心杂交，最后加入亲和素-辣根过氧化物酶（AV-HRP）及底物，在450 nm波长检测杂交信号。结果：该方法检测iNOS-mRNA的灵敏度明显高于RT-PCR-琼脂糖凝胶电泳；特异性高，RT-PCR和酶联夹心杂交均无非特异阳性信号出现；精密度良好。结论：本方法操作简单、灵敏度高、特异性强、结果数据化，适合于iNOS-mRNA的定量检测。     

孟鲁司特对人鼻黏膜上皮细胞黏蛋白MUC2和MUC5B mRNA表达的影响

目的 探讨白三烯受体拮抗剂孟鲁司特对人鼻黏膜上皮细胞黏蛋白MUC2和MUC5BmRNA表达的影响。方法 应用下鼻甲黏膜组织进行鼻黏膜上皮细胞的原代培养,取第2代培养的鼻黏膜上皮细胞分成对照组、IL-1β组、孟鲁司特+IL-1β组和孟鲁司特组。IL-1β组加入含IL-1β(10 μg/L)的无血清培养基;孟鲁司特+IL-1β组先加入孟鲁司特(0.01 mol/L)孵育8h后,再加入含IL-1β（10μg/L）的无血清培养基;孟鲁司特组加入含孟鲁司特(0.01 mol/L)的无血清培养基;对照组仅加入无血清培养基。培养24h后通过荧光定量PCR检测各组上皮细胞黏蛋白MUC2和MUC5B mRNA的表达。结果对照组MUC2和MUC5B mRNA和孟鲁司特组水平相近[MUC2:(2.93±1.57)×106拷贝/μg、( 1.63±0.47)× 106拷贝/μg;M UC5B:(8.21±3.54)×105拷贝/μg(5.15±2.16)×105拷贝/μg]。而孟鲁司特+IL-1β组MUC2和MUC5B mRNA定量表达均低于IL-1β组[(3.48±1.41)× 106拷贝/μg比(6.63±1.73)× 10拷贝/μg,MUC5B：(1.75±0.69)×106拷贝/μg比(3.40±2.79)×107拷贝/μg,均P＜0.05],但高于对照组和孟鲁司特组（均P＜0.05）。结论 孟鲁司特可降低IL-1β诱导的鼻黏膜上皮细胞黏蛋白MUC2和MUC5BmRNA的表达,但不影响正常状态鼻黏膜上皮细胞黏蛋白mRNA的表达,可能对炎性细胞因子诱导的鼻黏膜上皮细胞黏蛋白mRNA的表达有抑制作用。     

快速心房起搏兔肺静脉心肌袖细胞膜钾通道基因表达及胺碘酮的影响

目的： 观察快速心房起搏对兔肺静脉心肌袖细胞膜钾通道及其亚型(Kv4.3、Kir6.2)基因表达的影响及胺碘酮的干预作用。方法： 新西兰兔30只，随机分为3组(n=10)，Ⅰ组：对照组；Ⅱ组：快速心房起搏组；Ⅲ组：心房快速起搏+胺碘酮组。3组均经颈内静脉将电极置入右心房，其中Ⅰ组不予心房起搏，Ⅱ组和Ⅲ组以600 beats/min连续起搏右心房7 d；同时Ⅲ组按100 mg·kg^-1·d^-1给予胺碘酮灌胃，Ⅰ组和Ⅱ组则给予等量无药物成分的糖片(安慰剂)7 d。剪取3组兔的肺静脉心肌袖组织，应用逆转录-聚合酶链反应技术(RT-PCR)以3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参照，测定肺静脉心肌袖细胞Kv4.3、Kir6.2的mRNA表达水平。结果： Ⅱ组Kv4.3钾通道mRNA表达低于Ⅰ组45%(P<0.01)，Ⅲ组低于Ⅰ组73％（P<0.01),Ⅲ组低于Ⅱ组51%(P<0.01),Kir6.2mRNA的表达Ⅱ组比Ⅰ组高32%(P<0.01)，Ⅲ组与Ⅰ组无明显差异（P>0.05)，Ⅲ组低于Ⅱ组22%(P<0.05)。结论： 快速心房起搏可引起兔肺静脉心肌袖细胞钾通道基因表达变化，后者可能是肺静脉心肌袖接受电刺激后钾离子通道重构的分子基础，肺静脉心肌袖钾通道可能是胺碘酮的作用靶点之一。