不同种（株）利什曼原虫毒力相关基因的表达差异

目的 观察不同种（株）利什曼原虫前鞭毛体和无鞭毛体的毒力相关基因表达情况。 方法 制备杜氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫、热带利什曼原虫、硕大利什曼原虫和墨西哥利什曼原虫等5种7株利什曼原虫前鞭毛体和无鞭毛体的总RNA,采用半定量RT-PCR法,以α-微管蛋白基因和3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（GAPDH）作为阳性对照,根据GenBank公布的GDP甘露糖焦磷酸酶基因（GDPMP）、A2抗原相关蛋白基因（A2rel）、脂磷酸多糖合成蛋白1基因（LPG1）、脂磷酸多糖合成蛋白2基因（LPG2）、动基体膜蛋白11基因（KMP-11）、胱氨酸蛋白酶C基因（CPC）、亲水性酰化表面蛋白B1基因（HASPB1）、胱氨酸蛋白酶2基因（CPB2）、胱氨酸蛋白酶B2.8基因（CPB2.8）和热激蛋白100基因（CLP b）等毒力相关基因的核苷酸序列,设计特异性引物进行RT-PCR扩增,分析以上各基因在各种（株）前鞭毛体和无鞭毛体中的表达情况。 结果 各毒力基因在不同种（株）利什曼原虫的前鞭毛体和无鞭毛体中的表达明显不同,HASPB1基因在7个种（株）利什曼原虫的无鞭毛体和杜氏利什曼原虫前鞭毛体中均表达,GDPMP、LPG1、LPG2、CPB2.8、CPB2、A2rel和CLP基因分别在特定种（株）的前鞭毛体和/或无鞭毛体中表达,CPC基因仅在杜氏利什曼原虫SC10株和硕大利什曼原虫无鞭毛体内表达,KMP-11基因在7个种（株）利什曼原虫前鞭毛体或无鞭毛体内均不表达。 结论 毒力相关基因的表达存在种特异性和期特异性。     

中国利什曼原虫分离株分子核型分析

目的：通过核型分析探讨中国利什曼原虫分离株遗传变异情况。方法：应用脉冲电泳技术对16株中国利什曼原虫分离株基因组核型进行分析。结果：被测分离株分有14条－26条染色体（低于2200kb）被区分，核型差异大多集中于225kb－850kb染色体区域，较大染色体相对保守。其中14株属于杜氏利什曼原虫复合体的分离株存在明显的种内核型差异，但来自同一流行区的分离株核型显示差异较小。所有杜氏利什曼原虫复合体的分离株均含有11条相似染色体带：320kb,350kb,380kb,870kb,910kb,1070kb， 200 kb, 1 250 kb, 1 350 kb, 1 600 kb 和1 900 kb。其中, 从白蛉体内分离出的771 分离株核型显示较为独特, 共分离出26 条染色体带。另两株从大沙鼠体内分离的、先前已分被命名为沙鼠利什曼原虫和都兰利什曼原虫的R12 和R20 分离株显示相近核型。结论: 中国杜氏利什曼原虫复合体内存在明显种内遗传变异, 但亲缘关系越近的分离株核型也越相近。地理环境与媒介白蛉均对杜氏利什曼原虫复合体内遗传变异起一定作用。R12 和R 20 分离株倾向于属于同一个种或两个亲缘关系极近的种。同时, 可见寄生的哺乳动物宿主不同可能与利什曼原虫遗传关系密切。     

hsp70/CD80嵌合DNA疫苗对结核杆菌感染的免疫预防效果

卡介苗（BCG）虽然是全球使用最广泛的预防结核的疫苗,可预防和减轻儿童的重症结核,但对成人肺结核的保护效果不稳定.DNA疫苗为结核的防治提供了新的思路.人们试图用嵌合DNA疫苗和DNA疫苗的联合免疫来提高对结核病的免疫保护效果.分支杆菌热休克蛋白70（hsp70）包含多个T细胞和B细胞表位,免疫原性非常强,具有免疫优势抗原的特点,能诱导出特异性Th1型细胞反应,对结核杆菌的攻击可产生较强的保护性免疫效应,但单独的hsp70 DNA疫苗的免疫保护效果不能超过BCGCD80是近年来发现的一种具有免疫活化功能的第二信号分子,与其共刺激受体CD28/CTLA-4间相互作用可提供T细胞活化所必需的协同刺激信号,本研究将结核杆菌hsp70和人CD80的编码基因进行连接重组,制备成结核病hsp70/CD80嵌合DNA疫苗,可望提高hsp70 DNA疫苗的免疫效力,获得免疫原性更强、安全可靠的新型结核病疫苗.     

利什曼原虫中国分离株SSUrDNA多变区序列分析

目的：分析我国荒漠、山丘疫区利什曼原虫分离株的SSUrDNA多变区序列差异。方法nDNA进行PCR扩增,将扩增出的SSUrDNA基因的特异片段克隆于pGEM^R-T Easy Vector上,采用通用引物M13进行PCR扩增,全自动测序仪测序。结果：序列分析显示本文报道的荒漠、山丘疫区的2株利什曼原虫（L.d.XJ771,L.D.SC6)的SSUrDNA序列大小均为392bp;序列差异发生在两个独特序列区（UQ－Ⅰ和UQ-Ⅱ）,无移码突变;与GeneBank中的利什曼原虫比较分析,同源性在98％以上。 结我国荒漠、山丘疫区利什曼原虫分离株之间SSUrDNA多变区的碱基序列有差异;荒漠疫区分离株L.d.XJ771与国际标准株L.d.DD8的SSUrDNA多变区的碱基序列完全相同。     

墨西哥利什曼原虫无鞭毛体蛋白的基因克隆化与序列分析

目的 克隆墨西哥利什曼原虫（Ｌ．ｍｅｘ）ＷＲ９７２株的无鞭毛体蛋白（ａｍａｓｔｉｎ）的编码基因,并对其同源核苷酸序列进行分析。方法 根据已克隆的亚马逊利什曼原虫无鞭毛体蛋白的编码基因序列,设计并合成成无鞭毛体蛋白基因特异性引物,以墨西哥利什曼原虫ＷＲ９７２株的基因组ＤＮＡ作为模板,进行多聚酶链反应（ＰＣＲ）扩增。将扩增的ＤＮＡ片段克隆到ｐＣＲ２．１Ｔ载体中,进行测序,并对同源的核苷酸序列分析、比较     

人热休克蛋白70在毕赤酵母中的表达及鉴定

目的在毕赤酵母(pichiapastoris)中高效表达人热休克蛋白70(hHSP70),制备具有天然与hHSP70相同结构和活性的重组hHSP70(rhHSP70)。方法用PCR法自人DNA文库中克隆hHSP70的DNA,构建真核表达载体pPICZα/hHSP70。经核酸测序确证后,电转化毕赤酵母菌株X33。用PCR法筛选Zeocin抗性的转染阳性克隆,Westernblot法鉴定甲醇诱导的培养上清液中的rhHSP70,筛选高表达工程菌。结果经PCR法克隆的hHSP70DNA序列与GeneBank登录的cDNA序列一致。将hHSP70DNA定向插入pPICZα,构建pPICZα/hHSP70真核表达载体并经电转化获得Zeocin抗性的转染阳性克隆。SDSPAGE和Westernblot分析显示了甲醇诱导的培养基上清中含有rhHSP70,分子量72kD。氨基酸序列分析证实rhHSP70氨基端15个氨基酸与天然rhHSP70完全一致。rhHSP70表达量高达250mg·L-1。结论获得高效表达rhHSP70的毕赤酵母工程菌。     

热休克蛋白70及其抗体的检测对活动性肺结核的临床意义

目的　探讨热休克蛋白 70 (HSP70 )、热休克蛋白 70抗体 (HSP70 Ab)与活动性肺结核的关系。方法　用WesternBlot和WesternBlot ELISA法分别检测 3 0例活动性肺结核 (活动组 )、2 8例陈旧性肺结核 (陈旧组 )和 3 0名健康 (对照组 )血浆中HSP70和HSP70 Ab的水平。结果　活动组HSP70 [(4 675 .79± 767.11)积分光密度 ]高于陈旧组 [(2 85 4.81± 83 6.80 )积分光密度 ]和对照组 [(2 63 5 .60± 987.0 5 )积分光密度 ] (P <0 .0 1) ;活动组 1∶80抗体滴度组阳性检出率(3 3 .3 3 % )高于陈旧组 (14 .2 8% )和对照组 (10 .0 0 % ) ,两组比较差异有显著性 (P <0 .0 5 )。结论　HSP70、HSP70 Ab(1∶80 )可作为肺结核活动性诊断指标之一     

2型糖尿病患者热休克蛋白70基因多态性的变化

目的探讨热休克蛋白70（HSP70）基因多态性与2型糖尿病的关系。方法应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR．RFLP）方法，检测HSP70基因型在112例2型糖尿病患者和110例对照组的分布情况。结果112例2型糖尿病患者HSP70—1A／A、A／B和B／B3种基因型的分布频率分别为73．2％、23．2％和3．6％，HSP70．2A／A、A／B和B／B3种基因型的分布频率分别是55．4％、34．8％和9．8％，HSP70-hom A／A、A／B和B／B3种基因型频率分别是58．9％、37．5％和3．6％；110例对照组HSP70—1A／A、A／B、B／B基因型分布频率分别是54．5％、40．9％和4．6％，HSP70-2A／A、A／B、B／B3种基因型频率分别是52．7％，36．4％和10．9％，HSP70-hom A／A、A／B、B／B3种基因型频率分别是47．3％、47．3％和5．4％。结论112例2型糖尿病患者HSP70-1A／A、A／B和B／B3种基因型的分布与110例对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05），而HSP70-2和HSP70-homA／A、A／B和B／B3种基因型的分布与对照组比较差异无统计学意义（P〉0．05）。     

杜氏利什曼原虫四川分离株无鞭毛体蛋白基因的克隆及真核表达

目的克隆、真核表达杜氏利什曼原虫四川株的无鞭毛体蛋白(amastin)编码基因。方法PCR扩增杜氏利什曼原虫四川汶川人株L．d．SC10H2与四川南坪犬株L．d．SC7的无鞭毛体蛋白基因,将该基因导入pcDNA3．1( ),构建真核表达重组质牲,转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法鉴定重组质粒的瞬时表达;RT-PCR和Western blotting鉴定稳定表达,结果2株杜氏利什曼原虫均扩增出552 bp的无鞭毛体蛋白基因。同源性为86％。转染后在NIH3T3细胞膜和细胞内观察到较强的绿色荧光,表明无鞭毛体蛋白基因在NIH3T3细胞中获得短暂表达。细胞裂解产物经Western blotting,在相对分子质量(Mr)约20000处检测到阳性杂交信号,表明无鞭毛体蛋白基因在NIH3T3细胞内获得了稳定表达。结论获得了我国杜氏利什曼原虫四川分离株L．d．SC10H2和L．d．SC7的无鞭毛体蛋白基因序列,并在NIH3T3细胞中稳定表达。     

杜氏利什曼原虫四川分离株无鞭毛体蛋白基因的克隆及真核表达

目的 克隆、真核表达杜氏利什曼原虫四川株的无鞭毛体蛋白（amastin）编码基因。 方法 PCR扩增杜氏利什曼原虫四川汶川人株L.d.SC10H2与四川南坪犬株L.d.SC7的无鞭毛体蛋白基因，将该基因导入pcDNA3.1（+），构建真核表达重组质粒，转染NIH3T3细胞，采用免疫荧光法鉴定重组质粒的瞬时表达；RT-PCR和Western blotting鉴定稳定表达。 结果 2株杜氏利什曼原虫均扩增出552 bp的无鞭毛体蛋白基因，同源性为86％。转染后在NIH3T3细胞膜和细胞内观察到较强的绿色荧光，表明无鞭毛体蛋白基因在NIH3T3细胞中获得短暂表达。细胞裂解产物经Western blotting，在相对分子质量（Mr）约20 000处检测到阳性杂交信号，表明无鞭毛体蛋白基因在NIH3T3细胞内获得了稳定表达。 结论 获得了我国杜氏利什曼原虫四川分离株L.d.SC10H2和L.d.SC7的无鞭毛体蛋白基因序列，并在NIH3T3细胞中稳定表达。     

Heat shock protein 70 in rat liver with necrosis and regeneration induced by thioacetamide

Heat shock protein (hsp), which changes both its concentration and localization in reaction to stresses such as heating, ischemia, etc., is thought to protect protein structure and act as a chaperone in intracellular transportation. We examined one of the hsps, hsp 70, in rat liver with necrosis and regeneration produced by thioacetamide (TAA). Hsp 70 was determined by immunoblotting and detected histologically by immunostaining, using a specific antibody. Generally, hsp 70 moves from the cytosol to the nucleus, where it concentrates 15 min after TAA injection. After 15 min, hsp 70 was not detected in the nuclei of hepatocytes around the central vein, where the hepatocytes olater became necrotic. However, hsp 70 immunostaining was increasingly strong in the nuclei of hepatocytes around the portal area, which did not become necrotic. These findings show that, in acute necrosis, hsp 70 seems to correlate with nuclear protection or with the transportation of some protein from the cytosol to the nucleus. Hepatocytes probably neither survive nor regenerate without hsp 70 in their nuclei.     

Expression of Recombinant Heat-Shock Protein 70 of MCAN/IR/96/LON-49, a Tool for Diagnosis and Future Vaccine Research

Background: Heat shock protein 70 (HSP70) is present in all organisms studied so far, and is a major immunogen in infections caused by pathogens including Leishmania spp. Objective: The aim of this study was to clone and express HSP70 from L. infantum strain MCAN/IR/96/LON-49 and evaluate antibody response against HSP70 in visceral leishmaniasis (VL). Methods: The L. infantum HSP70 gene segment was amplified by specific primers. It was cloned into pTZ57R vector and subcloned into pET32a (+) expression vector. The new construct was transformed in the E.coli Rosetta strain, and HSP70 protein was expressed in the presence of 1 mM IPTG and purified using a HiTrap chelating column. Antibody responses against HSP70 were determined by ELISA in 37 patients with visceral leishmaniasis and 63 healthy controls. Results: Expression of HSP70 protein was confirmed using SDS-PAGE electrophoresis and dot blot with an anti-His tag antibody. There was no difference between the sequence of nucleotides of the HSP70 gene in the present study and other reported sequences. The ELISA results indicated that the sera of 81.1% (30/37) of the patients and 6.3% (5/63) of controls reacted to L. infantum HSP70. Conclusion: The conservative nature of the HSP70 molecule is an advantage in vaccine studies, because of minor differences (6%) between the nucleotide sequences and consequently the similarity in amino acid sequences in various strains of L. infantum. It could therefore be used in vaccine research against leishmaniasis and also as a tool for serodiagnosis.     

热休克蛋白70在心力衰竭患者中的研究进展

热休克蛋白（heat shock protein，HSP）在生物应激反应中具有保护细胞免受损伤的作用。大部分研究集中在这种重要的蛋白质家族在哺乳动物细胞对急性应激反应的作用机制。HSP70循环存在于正常健康个体及患有多种严重疾病的患者中，包括心力衰竭（HF）。HSP70在慢性心力衰竭（CHF）患者中是升高的，特别是在严重的晚期HF患者中。HSP70反映的是疾病的严重程度而非生存率。HSP70的表达在发病率中的重要关系有待进一步评估。     

超重/肥胖与2型糖尿病患者血清热休克蛋白70水平及其相关因素分析

目的 探讨热休克蛋白70（HSP70）在T2DM及肥胖发生发展中的可能作用. 方法 选取T2DM组71例和糖调节正常（NGR）组63名,根据BMI分为超重/肥胖（OW/OB）及体重正常（NW）亚组,检测各亚组SBP、DBP、WC、FPG、2 hPG、FIns和HSP70等指标,计算BMI、WHR、体内脂肪含量（BF％）和胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）. 结果 T2DM组血清HSP70水平低于NGR组[（545.89±165.27） vs （666.49±251.73） pg/ml,P＜0.01].OW/OB组血清HSP70水平低于NW组[（544.72±147.39） vs （658.75±258.56） pg/ml,P＜0.01].血清HSP70水平与BMI、SBP、DBP、WC、FPG、2 hPG、BF％和HOMA-IR均呈负相关（r=-0.403、-0.301、-0.328、-0.327、-0.256、-0.259、-0.349、-0.244,P均＜0.01）.BMI、FPG是血清HSP70水平的独立相关因素. 结论 肥胖及新诊断T2DM患者血清HSP70水平降低,与FPG、BMI独立相关.     

刚地弓形虫热休克70基因编码蛋白结构与功能的生物信息学分析

目的分析并预测刚地弓形虫热休克蛋白70(TgHSP70)基因编码蛋白的结构与功能,探讨其作为疫苗候选抗原的可能性。方法从Genbank数据库获取TgHSP70基因序列,采用在线蛋白分析专家系统(http://ca.expasy.org/),结合DNAMAN等生物信息学软件对该序列的编码区进行分析,预测该基因编码蛋白质的理化性质、翻译后修饰位点、功能域、亚细胞定位、二级结构、亲/疏水性、三维空间结构、抗原表位等。结果该基因全长2 382 bp,编码区为143~2 146 bp。编码蛋白性质稳定,理论分子质量单位为72.304 97 ku。TgHSP70有6个跨膜区,为跨膜蛋白;有4个N端糖基化位点,6个蛋白激酶C磷酸化位点,14个酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位点,3个酪氨酸激酶磷酸化位点;无信号肽,二级结构以无规卷曲为主;TgHSP70主要存在于弓形虫速殖子胞液和核内,有26个潜在的抗原表位。结论 TgH-SP70基因编码蛋白为可溶性蛋白,有多个抗原表位,具有免疫原性,可作为弓形虫病疫苗候选抗原。     

Overexpression of heat shock protein 70 in stomach of stress-induced gastric ulcer-resistant rats

Expression of heat shock protein 70, induced by an antiulcer drug, provides protection against gastric ulcers. However, the mechanisms responsible for this protection are not known. The expression in ulcer-resistant, spontaneously hypertensive rats was 2.8-fold higher than in normotensive rats. One hour after restraint and water immersion stress, strong nuclear immunoreactivity was observed in nuclei of surface epithelial cells at the crest of gastric mucosal folds, the first site of ulceration, only in spontaneously hypertensive rats. Heat shock cognate protein 70, which is expressed in mucus-secreting cells, was not overexpressed in spontaneously hypertensive rats. Heat shock protein 70 expression was attenuated by chemical sympathectomy, which also resulted in abolition of the increase of mucosal blood flow and aggravation of ulcers. Our results indicate that overexpression of heat shock protein 70 in the stomach seems to protect against gastric ulcers through its cytoprotective effects on gastric mucosa by increasing mucosal blood flow.     

不同分离株弓形虫hsp70基因体外扩增及其酶切分析

目的　不同分离株弓形虫hsp70基因的比较 ;运用限制性内切酶分析 (PRA)建立一种简单的虫株鉴定方法。 方法　采用PCR技术扩增hsp70基因 ;采用 3种限制性内切酶Bsp12 86Ⅰ、BstXⅠ、MboⅠ分别对该基因进行酶切比较。 结果　从 5种不同分离株的弓形虫基因组DNA中扩增出相似的约 2 0 2 2bp的完整HSP70基因阅读框序列 ;Bsp12 86Ⅰ酶切 5株弓形虫有 2组不同酶谱 ,而BstXⅠ、MboⅠ酶切的片段各株间没有差异。结论　 5种不同分离株弓形虫的hsp70基因片段大小基本相同 ;但酶切图谱有差异 ,这可以为虫株鉴定和毒力研究提供参考。     

热休克蛋白70及其在支气管哮喘中的研究进展

热休克蛋白为一类广泛存在于各种生物体的应激蛋白,其高度的保守性及“分子伴侣”功能已为人们所认识。热休克蛋白70为热休克蛋白家族在细胞内含量最多且最保守的一类。近年来,越来越多的研究表明热休克蛋白70在支气管哮喘的免疫及炎症中发挥重要作用,但确切机制尚未明了,仍待进一步的研究探索。     

Inflammatory status as an important determinant of heat shock protein 70 serum concentrations during aging

Heat shock proteins (Hsp) form a large family of proteins that are ubiquitously present in all organisms. In the absence of destabilising stimuli, Hsp are expressed at low levels, but their expression can be highly induced by various noxious conditions such as heat, oxygen stress and infection. Hsp have been reported to interfere with inflammatory processes and their induction is well known to decrease with aging. In the present study we have investigated Hsp 70 serum concentrations using an optimised ELISA in elderly patients, recruited from a geriatric University Hospital ward. Our results portray positive correlations between the serum levels of Hsp 70 and various markers of inflammation (monocyte count, serum concentration of TNF-alpha, plasma concentrations of C-reactive protein, and fibrinogen), explaining the difference in Hsp 70 serum concentrations in these subjects with various degrees of inflammation. We conclude that Hsp 70 is involved in inflammatory diseases and that the serum level of Hsp 70 is directly linked to the inflammatory status of the subject. However, the nature of this relationship remains to be elucidated.