外周血干细胞与组织工程骨复合移植过程中转化生长因子β在修复犬牙周骨缺损的表达

背景:外周血干细胞是一类具有多分化潜能的前体细胞,有分化为成骨的潜能,组织工程骨作为细胞移植的载体,与受体组织和种子细胞有良好的相容性.转化生长因子β是骨缺损修复的重要调节因子,有诱导外周血干细胞分化增殖为成骨细胞的作用.目的:观察外周血干细胞与组织工程骨复合移植修复牙周骨缺损中转化生长因子β的表达.设计:以细胞为对象的观察实验.单位:西安交通大学口腔医院.材料:实验于2003/2006年在西安交通大学口腔医院完成.实验动物由西安交通大学医学院(原西安医科大学)动物试验中心提供.实验动物均采用氯胺酮肌肉诱导后,肌内注射速眠新麻醉后进行手术或处死取材,对动物处置符合动物伦理学标准.方法:抽取犬外周血干细胞,制成细胞悬液备用.取健康仔猪髂骨制作脱钙脱蛋白生物组织工程骨,浸入犬外周血干细胞细胞悬液中备用.将10 只健康杂种犬分成实验组和对照组,每组5 只.自犬下颌左右侧尖牙之间沿唇侧牙龈沟处达牙槽嵴,再转向双侧前庭沟切开,形成一个梯形瓣,向下翻瓣暴露唇侧骨板,在下颌侧切牙之间用涡轮钻制备 2 cm×2 cm×1 cm 的骨缺损区,实验组植入外周血干细胞-组织工程骨,对照组不移植外周血干细胞,仅移植组织工程骨.术后2,3,4,8,12周采用免疫组织化学方法观察外周血干细胞分化增殖成为成骨细胞过程中转化生长因子β的表达.主要观察指标:①光镜和透射电镜观察外周血干细胞转化成为成骨细胞的形态学变化和细胞器的结构功能.②免疫组织化学方法测量外周血干细胞在转化成为成骨细胞的过程中转化生长因子β的表达.结果:实验组在外周血干细胞-组织工程骨移植后2 周,即见骨缺损区边缘转化生长因子β呈弱阳性表达,4～8 周骨缺损区中心区域可见大量的成骨细胞、成纤维细胞和胶原纤维呈现强阳性表达,12 周骨缺损区已完全修复.对照组组织工程骨移植后8～12 周,仅在骨缺损边缘区域呈转化生长因子β弱阳性表达.结论:当用外周血干细胞和组织工程修复犬牙周骨缺损时,转化生长因子β能诱导外周血干细胞分化和增殖为成骨细胞.     

应用骨髓基质细胞及组织工程方法修复兔桡骨实验性缺损

背景：应用干细胞移植及组织工程的方法修复骨缺损是近年来研究的热点。目的：观察应用自体骨髓基质细胞的组织工程骨修复骨缺损的效果。设计：左右侧对照实验。单位：哈尔滨医科大学第一临床医学院实验中心。材料：10-个月新西兰大白兔12只，雌雄不限，体质量2～2．5k。方法：实验于2002-06／2003-06在哈尔滨医科大学第一临床医学院实验中心完成。将兔自体骨髓基质细胞经淋巴细胞分离液分离培养、传代扩增。取兔12只行桡骨中段截取1．5cm骨质，造成完全骨缺损。于左侧缺损处植入载有骨髓基质细胞的胶原海绵，右侧植入单纯胶原海绵对照。12周后麻醉状态处死动物，比较基质细胞和胶原海绵复合物移植与单纯胶原移植治疗骨缺损的疗效。x射线片评价标准按骨缺损修复分期方法（分为0-5级，5级为骨缺损全部被新骨替代，0级为无新骨修复）。主要观察指标：兔桡骨缺损处大体观察，X射线观察，组织化学观察及电镜观察结果。结果：纳入12只兔均进入结果分析。①两侧兔桡骨缺损处大体观察：第12周实验组骨缺损处骨痂坚实突出于骨缺损处，与断端连续性好。对照侧无连续骨痂通过骨缺损处，断端间有纤维组织连接。②两侧兔桡骨缺损处X射线观察：在第12周实验侧有连续骨痂通过骨缺损处，髓腔通畅，塑形不完全。对照侧无连续骨痂通过断端。③两侧兔桡骨缺损处组织学观察：第12周实验侧骨缺损处可见大量成骨细胞及新生基质。对照侧仅在断端间见少量骨细胞，断端处为纤维组织充填。④兔桡骨缺损电镜观察：实验侧成骨细胞接近正常骨细胞可见大量丰富扩张内质网，蛋白合成旺盛，细胞器含量丰富。结论：骨髓基质细胞作为一种骨源干细胞，具有良好的成骨作用，经过扩增可以用作种子细胞，通过组织工程的方法可以修复骨缺损性疾病。     

转化生长因子β1基因修饰成骨细胞复合仿生基质材料治疗骨缺损

背景：通过分子生物学技术与组织工程技术相结合以修复骨缺损，是骨科当前重要的研究方向之一。转化生长因子β1作为重要的骨形成因子，在骨代谢和骨损伤修复中发挥着极为重要的作用。 目的：观察转化生长因子βl基因修饰的成骨细胞复合仿生基质材料修复鼠胫骨骨缺损的治疗效果。 设计：随机对照实验。 单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科。 材料：实验于2003-03／08在华中科技大学同济医学院附属协和医院完成。选用健康SD大鼠20只，雌雄不限，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。 方法：将转化生长因子βl基因转染的成骨细胞与涂覆多聚赖氮酸的聚DL乳酸仿生基质材料复合，植入鼠胫骨骨缺损模型，术后摄X射线片和组织学检查观察修复情况。 主要观察指标：术后4，8周X线摄片和组织学检查情况。 结果：20只SD大鼠均进如结果分析，无脱失。①实验组：4周时X线片可见骨痂形成，组织学观察有类骨组织和新骨形成，成骨细胞贴附于基质材料表面。8周时缺损基本修复，新骨密度与自体骨接近。②对照组：4周时X线片未见骨痂形成，组织学观察没有类骨组织形成，基质材料表面成骨细胞贴附较少，材料腔隙中有大量淋巴细胞浸润。8周时植入材料基本吸收，为纤维组织替代。 结论：将分子生物学和组织工程学结合修复骨缺损，获得理想的治疗效果。     

大鼠转化生长因子β1基因转染成骨细胞后的表达

背景：将生物材料复合细胞因子基因，或复合转入细胞因子基因的细胞植入骨缺损处可以促进骨修复。目的：观察将大鼠转化生长因子β1基因转染成骨细胞后进行骨缺损基因治疗的可行性。设计：对照观察实验。单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科。对象：新生SD大鼠5只，雌雄不限。方法：实验于2000—02／09在华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科实验室完成。通过脂质体介导将转化生长因子β1基因导人大鼠成骨细胞，并以质粒pcDNA，转染细胞作为对照。转染24h后通过链霉亲和素-生物素化过氧化物酶复合物法和原位杂交法检测目的基因瞬时表达的情况。采用G418筛选转染细胞2周，获得阳性细胞克隆，用链霉亲和素-生物素化过氧化物酶复合物法检测转染细胞稳定表达转化生长因子β1的情况。主要观察指标：链霉亲和素-生物素化过氧化物酶复合物法和原位杂交法检测转染细胞基因表达情况。结果：①pcDNA3-TGF-β1转染成骨细胞瞬时表达组化检测和原位杂交检测结果：24h转染成骨细胞胞浆中充满染色的棕黄色颗粒，对照组空载体转染细胞腧浆中刚没有棕黄倘．颗粒．说明转基因细胞中转化毕长因子β1 mRNA明显增高。②G418筛选转基因细胞组化检测：G418筛选2周后的转染细胞仍然有较高的转化生长因子β表达。结论：利用基因转染技术可使成骨细胞瞬时、高效表达细胞因子，转染后瞬时和筛选2周后，均呈现转化生长因子β1基因转染成骨细胞后稳定的高表达，说明采用细胞因子基因转染成骨细胞进行骨缺损的基因治疗具有可行性。     

转染血管内皮细胞生长因子骨髓间充质干细胞与牛松质骨支架复合组织工程骨的血管形成

背景：小块组织工程骨植入动物体内后,早期依靠组织液的渗透可获得营养,但大块组织工程骨的营养仅靠组织液的渗透是远远不够的,必须通过血管再生来获得。目的：观察转染血管内皮细胞生长因子表达载体骨髓间充质干细胞复合组织工程骨植入动物体内后的血管形成能力。方法：制作日本大耳白兔双侧尺骨中段骨缺损模型,左侧尺骨缺损植入转染血管内皮细胞生长因子表达载体的自体骨髓间充质干细胞复合脱钙脱脂去蛋白的牛松质骨支架组织工程骨为实验组,右侧尺骨缺损植入自体骨髓间充质干细胞复合脱钙脱脂去蛋白的牛松质骨支架组织工程骨为对照组。术后12周行X射线摄片观察、大体标本观察、苏木精-伊红染色和Masson染色组织切片观察、MiFas图像分析系统定量分析。结果与结论：实验组与对照组尺骨缺损处均有连续骨痂形成;组织切片经苏木精-伊红染色、Masson三色法染色及MiFas图像分析系统定量分析可见实验组和对照组均有大量的新生骨,但实验组新生血管明显多于对照组（P〈0.01）,且血管较粗大,而且与新生骨接近。说明将转染血管内皮细胞生长因子表达载体的骨髓间充质干细胞复合在组织工程骨上植入动物体内可明显促进新生血管的形成。     

应用骨髓基质细胞及组织工程方法修复兔桡骨实验性缺损

背景应用干细胞移植及组织工程的方法修复骨缺损是近年来研究的热点.目的观察应用自体骨髓基质细胞的组织工程骨修复骨缺损的效果.设计左右侧对照实验.单位哈尔滨医科大学第一临床医学院实验中心.材料10～个月新西兰大白兔12只,雌雄不限,体质量2～2.5 kg.方法实验于2002-06/2003-06在哈尔滨医科大学第一临床医学院实验中心完成.将兔自体骨髓基质细胞经淋巴细胞分离液分离培养、传代扩增.取兔12只行桡骨中段截取1.5 cm骨质,造成完全骨缺损.于左侧缺损处植入载有骨髓基质细胞的胶原海绵,右侧植入单纯胶原海绵对照.12周后麻醉状态处死动物,比较基质细胞和胶原海绵复合物移植与单纯胶原移植治疗骨缺损的疗效.X射线片评价标准按骨缺损修复分期方法(分为0～5级,5级为骨缺损全部被新骨替代,0级为无新骨修复).主要观察指标兔桡骨缺损处大体观察,X射线观察,组织化学观察及电镜观察结果.结果纳入12只兔均进入结果分析.①两侧兔桡骨缺损处大体观察第12周实验组骨缺损处骨痂坚实突出于骨缺损处,与断端连续性好.对照侧无连续骨痂通过骨缺损处,断端间有纤维组织连接.②两侧兔桡骨缺损处X射线观察在第12周实验侧有连续骨痂通过骨缺损处,髓腔通畅,塑形不完全.对照侧无连续骨痂通过断端.③两侧兔桡骨缺损处组织学观察第12周实验侧骨缺损处可见大量成骨细胞及新生基质.对照侧仅在断端间见少量骨细胞,断端处为纤维组织充填.④兔桡骨缺损电镜观察实验侧成骨细胞接近正常骨细胞可见大量丰富扩张内质网,蛋白合成旺盛,细胞器含量丰富.结论骨髓基质细胞作为一种骨源干细胞,具有良好的成骨作用,经过扩增可以用作种子细胞,通过组织工程的方法可以修复骨缺损性疾病.     

转染血管内皮细胞生长因子骨髓间充质干细胞与牛松质骨支架复合组织工程骨的血管形成

背景:小块组织工程骨植入动物体内后,早期依靠组织液的渗透可获得营养,但大块组织工程骨的营养仅靠组织液的渗透是远远不够的,必须通过血管再生来获得。目的:观察转染血管内皮细胞生长因子表达载体骨髓间充质干细胞复合组织工程骨植入动物体内后的血管形成能力。方法:制作日本大耳白兔双侧尺骨中段骨缺损模型,左侧尺骨缺损植入转染血管内皮细胞生长因子表达载体的自体骨髓间充质干细胞复合脱钙脱脂去蛋白的牛松质骨支架组织工程骨为实验组,右侧尺骨缺损植入自体骨髓间充质干细胞复合脱钙脱脂去蛋白的牛松质骨支架组织工程骨为对照组。术后12周行X射线摄片观察、大体标本观察、苏木精-伊红染色和Masson染色组织切片观察、MiFas图像分析系统定量分析。结果与结论:实验组与对照组尺骨缺损处均有连续骨痂形成;组织切片经苏木精-伊红染色、Masson三色法染色及MiFas图像分析系统定量分析可见实验组和对照组均有大量的新生骨,但实验组新生血管明显多于对照组(P<0.01),且血管较粗大,而且与新生骨接近。说明将转染血管内皮细胞生长因子表达载体的骨髓间充质干细胞复合在组织工程骨上植入动物体内可明显促进新生血管的形成。     

体外冲击波治疗对组织工程化骨修复节段性骨缺损的影响

目的探讨体外冲击波对组织工程化骨修复节段性骨缺损的影响及其作用机制。方法18只健康成年绵羊随机分为实验组与对照组，每组9只。对照组在骨缺损区植入β-磷酸三钙陶瓷与自体间充质干细胞复合体，实验组植入复合体后再适时进行体外冲击波（ESW）治疗。治疗后4，8，12周分批处死动物，行X线摄片、组织学、生物力学和扫描电镜观察。结果术后8周2组动物骨缺损愈合未见明显差异，12周后实验组动物骨缺损基本愈合，骨痂面积和密度均比对照组明显增高。结论冲击波疗法能促进组织工程化骨的成骨能力，其作用机制在于促进间充质干细胞向成骨细胞分化，加速陶瓷降解，改善血供。     

筋膜瓣包裹组织工程骨修复兔大段骨缺损的动态变化

背景:组织工程骨的血管化是构建过程中的关键环节.目的:动态观察带蒂筋膜瓣包裹组织工程骨的血管化过程,以及其修复大段骨缺损的一般规律.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2005-10/2006--04在南方医科大学南方医院创伤骨科实验室完成.材料:6月龄健康新西兰大白兔12只双侧髂骨抽取骨髓分离骨髓基质干细胞诱导分化成骨细胞.圆柱状(3×15)mm多孔β-磷酸三钙为法国贝奥路公司产品.方法:将成骨细胞与β-磷酸三钙复合培养7 d后细胞量达到1×109 L-1为组织工程骨,实验组兔左侧前肢内侧剥离带蒂筋膜瓣(2×1.5)cm包裹圆柱状组织工程骨植入1.5锄桡骨缺损处,对照组于同一只兔右侧桡骨1.5 cm骨缺损处植入未包裹组织工程骨.主要观察指标:植入后2,4,6,8,12周进行大体观察、组织学、放射学、骨密度和放射性核素骨显像检测.结果:①从第4周以后各时间点实验组修复效果均优于对照组,X射线相对阻射值定量分析实验组的评分高于对照组(P<0.05),骨密度值高于对照组(P<0.05),放射性强度高于对照组(P<0.05).②从第4周以后各个观察点实验组在血管化程度、新骨形成量、材料降解速度、骨缺损修复时间、骨修复改建质量都优于对照组.结论:采用蒂筋膜瓣包裹组织工程骨修复骨缺损,4周后,在血管化程度、新骨形成量、材料降解速度及骨缺损修复时间方面均优于无筋膜包裹的组织工程骨,提示早期的快速血管化直接影响到骨缺损修复的全过程.     

骨痂中转化生长因子β1基因表达及利用骨痂植骨对术后功能的影响

背景：在骨折愈合过程中，若将骨折端周围的骨痂组织去除，骨折端比较难完全吻合，可以推测这些骨痂组织是人体在修复过程中的必然产物，应该是有益的，拟将这些骨痂做组织学分析和冰冻切片的原位杂交，观察其组织学内容和转化生长因子β1的含量，并做为供骨植于骨折端，了解骨痂植骨在骨折愈合中的作用。目的：通过测定骨痂中的组织学内容和转化生长因子β1的含量来厂解延迟手术中骨折端周围骨痂组织的再利用价值。设计：采用骨痂组织原位杂交及随机分组对照的实验。单位：西安交通大学第二医院骨科、台州市中心医院骨科。材料：病例分别选择西安交通大学第二医院骨科和台州市中心医院骨科1994—07／2003—10骨折延迟手术的住院患者51例，在手术中取骨折延迟愈合的骨痂做标本（均已征得患者同意），Dig标记试剂盒购自Boehringer Mannheim公司，转化生长因子β1寡核苷酸探针的序列：CTT GCT GTA CTG TGT GTC CAA，由DNA合成仪合成，X线计算机系统（CR）购自日本富士公司。方法：在骨折后的2，4，6和8周，在手术中取出少量骨痂做标本，采用不脱钙的骨痂组织做冰冻切片，采用非同位素Dig标记原位杂交，观察转化生长因子β1在骨痂中的基因表达。术中将骨断端清理后，在骨折牢固固定的同时，再将原骨痂植于骨缺损处及骨折周围。对延迟手术的患者分别采用单纯骨痂植骨、髂骨植骨，骨痂加髂骨植骨，经1～4年患者复诊随访，平均1年9个月。主要观察指标：①骨折不同时期骨痂中的组织学内容和转化生长因子β1的含量。②不刚植骨方式对骨折愈合时间的影响。结果：参加治疗51例，有7例因死亡和到外地生活而未能进行随访，评定44例，纳入结果分析。④骨痂中转化生长因子β1的基因表达：骨折后第2周，骨折端有少量纤维骨痂，软骨骨痂较多，转化生长因子β1在软骨小岛内的软骨细胞中高表达。骨折后4周左右转化生长因子β1在成骨细胞内表达显著。8周左右大量骨痂生长，并以软骨化骨为主，成纤维细胞、骨痂、成骨细胞、骨小梁越来越多，术后6周转化生长因子β1在各种细胞内的表达消失，但随着骨重建过程增强，8周时骨基质中转化生长因子β1表达又有增高趋势。②不同植骨方式的愈合时间：不同的植骨方式在愈合时间上没有显著性差异。结论：转化生长因子β1在骨愈合的平衡中发挥重要作用，不同阶段骨痂的组织变化和转化生长因子β1量的变化有着必然的联系，骨痂是机体修复和重建的产物，骨痂植骨再利用是一种可行的方法．它对需要植骨的患者可减少其痛苦和损伤。     

体外构建人工仿生骨膜

背景：小肠黏膜下层既具有良好的生物相容性和降解性,又富含多种生长因子,能明显促进细胞的黏附、增殖及分化,在国外已被广泛应用于骨与软骨、血管、皮肤、膀胱、平滑肌及胰岛等组织的修复,且已表现出良好的组织工程化细胞支架性能。 目的：探讨兔骨髓间充质干细胞经体外诱导成成骨细胞与猪小肠黏膜下层复合构建组织工程骨膜的可行性。方法：采用贴壁筛选法分离2周龄健康新西兰大白兔骨髓间充质干细胞,并进行体外扩增培养、诱导分化及鉴定。将经成骨诱导分化的骨髓间充质干细胞与猪小肠黏膜下层复合构建组织工程骨膜,观察细胞在生物材料上的附着、生长、增殖情况。 结果与结论：接种5 d后,细胞散在附着于小肠黏膜下层材料上,细胞形态呈圆形,细胞之间无连接;10 d后细胞之间形成桥粒连接,成骨细胞伸出突起,与小肠黏膜下层贴附;15 d后细胞增殖,分泌基质,在小肠黏膜下层表面形成多层细胞组成的复层膜样结构。表明将骨髓间充质干细胞诱导成成骨细胞后与猪小肠黏膜下层复合可构建组织工程骨膜,有可能成为理想的组织工程支架材料。     

骨髓中一类新细胞群--神经组织定向干细胞的确立

背景：骨髓间充质干细胞和造血干细胞具有分化为神经类细胞的潜能己得到共识。另有研究者认为骨髓中除骨髓间充质干细胞和造血干细胞以外，还寄居着CXCR4阳性的组织定向干细胞，包括骨骼肌、心、肝及神经组织定向干细胞。 目的：实验拟进一步证实神经组织定向干细胞寄居于骨髓，并寻求确立神经组织定向干细胞分离、培养的新方法。 设计：开放性实验。 单位：解放军第二军医大学解剖学教研室。 材料：所用成年清洁级SD大鼠由解放军第二军医大学动物中心提供。DMEM/F12,B27，N2均购自Invitrogen公司；bFGF源于CytoLab Ltd;EGF源于Invitrogen公司；Nestin、CXCR4,β-Tublin Ⅲ，神经胶质纤维酸性蛋白等一抗为Santa Cruz公司兔抗鼠多克隆抗体；MAP2ab（Clonell—5B），CNPase（Clone AP20）为NeoMarkers公司小鼠抗大鼠单克隆抗体；荧光（FITC，Cy3）标记试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；免疫组化试剂盒购自Vector Laboratories公司。NycoPrep^TM分离液（1．077A）购自Axis-Shield公司。 方法：实验于2004-01／2006-12在解放军第二军医大学组织工程研究所完成。取SD大鼠双侧股骨及胫骨，冲洗骨髓腔，经NycoPrep^TM分离液分离单核细胞层，DMEM／F12（1：1）无血清神经干细胞培养液（内含2％B27，1％N2，20μg/L碱性成纤维细胞生长因子，20μg／L表皮生长因子，1×10^5U/L青霉素，100mg／L链霉素），通过先贴壁、后悬浮的方法从骨髓中分离、培养单克隆生长的神经组织定向干细胞。 主要观察指标：通过免疫细胞化学法检测神经组织定向干细胞细胞球CXCR4和nesfin蛋白，以及细胞球自然分化后神经元以及神经胶质细胞的标志蛋白。 结果：①神经组织定向干细胞细胞球表达神经干细胞标志蛋白nesfin和组织定向干细胞标志蛋白CXCR4。②神经组织定向干细胞细胞球在含15％胎牛血清的     

以带血管蒂筋膜瓣与人脐带间充质干细胞和重组人骨形成蛋白2构建活性组织工程骨

背景：构建的组织工程骨块植入体内后的存活是骨组织工程面临的一个重大课题,临床上尤其缺少可行性强、可以不经体外长时间构建及预血管化而可一期应用的组织工程骨。目的：探讨以带血管蒂的筋膜瓣作为膜包裹材料、以人脐带间充质干细胞作为种子细胞,以β-磷酸三钙生物陶瓷作为支架材构建组织工程骨的可行性及加入重组人骨形成蛋白2作为细胞活性因子、Ⅰ型胶原作为细胞活性因子缓释材料后成骨能力的变化。方法：Wistar大鼠左侧L1～6背部带血管蒂的筋膜瓣包绕由β-磷酸三钙生物陶瓷、人脐带间充质干细胞、重组人骨形成蛋白2、Ⅰ型胶原构建的组织工程骨作为实验侧,右侧带血管蒂的筋膜瓣包绕接种了人脐带间充质干细胞的β-磷酸三钙生物陶瓷作为对照侧。结果与结论：大鼠实验侧4周时幼稚骨组织连接形成原始层板骨样结构,形成的原始骨组织钙化程度低。8周时,大鼠两侧骨组织均基本成熟。成骨细胞位于骨陷窝中,周围有大量骨基质呈淡紫色,局部可见Ⅰ型胶原存在,有骨髓腔结构出现,但实验侧骨组织成熟度明显高于对照侧。实验侧骨组织哈夫氏小管清晰可见,形成多个骨化中心,骨小梁、骨岛遍布其中,可见成熟板层骨、立方状排列整齐的活性成骨细胞。8周时实验侧骨小梁成熟度高、典型、清晰可见,对照侧骨小梁成熟度稍差。但2组植入物的新骨形成面积接近。提示以带血管蒂的筋膜瓣作为膜包裹材料构建组织工程骨时,重组人骨形成蛋白2及缓释剂Ⅰ型胶原可促进其骨成熟度。     

藻酸钙复合材料构建组织工程化骨及软骨的实验

背景软骨组织工程的两个关键问题是种子细胞和支架材料,保证支架材料上有足够数量的功能细胞是体内形成骨和软骨组织的基础.目的对经体外培养的骨髓基质干细胞与藻酸钙载体及生长因子复合形成的组织工程性骨及软骨进行形态学观察.设计细胞形态对比,观察12周实验结果.单位郑州大学骨科研究所,上海第二医科大学骨科实验室.对象实验于2001-09/2002-06在上海第二医科大学骨科实验室完成.3月龄雄性新西兰大白兔9只,平均体质量3.2kg.方法复合材料分别为①藻酸钙.②藻酸钙+骨髓基质细胞.③藻酸钙+骨髓基质细胞+类胰岛素生长因子Ⅰ.④藻酸钙+骨髓基质细胞+转化生长因子β.⑤藻酸钙+骨髓基质细胞+转化生长因子β+类胰岛素生长因子Ⅰ.将5种组合注射于同一个体新西兰大白兔背部不同部位皮下组织中,每组各注射2处,共10处,每处0.2mL,分别做好标记.按组分别于术后4,8,12周取材,各时间点处死动物3只,取兔背部皮下增殖物进行骨和软骨组织生成物观察,应用苏木精-伊红、甲苯胺蓝、Masson、番红-O染色技术.主要观察指标兔背部皮下增殖物的组织学观察.结果兔背部皮下增殖物的组织学观察结果4周时可见藻酸钙+骨髓基质细胞+类胰岛素生长因子Ⅰ、藻酸钙+骨髓基质细胞+转化生长因子β、藻酸钙+骨髓基质细胞+转化生长因子β+类胰岛素生长因子Ⅰ组有岛状软骨样组织形成,软骨细胞包绕于碱性基质中,8周时复合物中形成大量的类软骨结构,并部分向骨组织转化,细胞周围有大量的基质分泌,部分软骨细胞呈簇状分布.12周时藻酸钙+骨髓基质细胞+转化生长因子β+类胰岛素生长因子Ⅰ组软骨组织基本转变为骨组织,并开始吸收.结论骨髓基质细胞-藻酸钙-生长因子复合材料能形成软骨及骨组织.藻酸钙适合骨髓基质细胞生长,是一种良好的骨及软骨组织工程载体.     

骨髓间充质干细胞联合可降解支架体外构建组织工程带瓣静脉

背景：临床上治疗慢性静脉功能不全的主要方法是静脉瓣膜修复及带瓣静脉段移植,但这些方法创伤较大,且带瓣静脉来源有限。组织工程学和再生医学在修复病变血管方面取得的进步,而以自体来源的内皮细胞为种子细胞的组织工程带瓣静脉也见于了报道,但存在排出反应。 目的：构建一个有可自我更新、修复、类似天然瓣膜结构并具有功能的带瓣静脉。 方法：麻醉取Beagle犬的骨髓获取骨髓间充质干细胞,采用密度梯度离心和贴壁法获取骨髓间充质干细胞,并进行细胞的传代、冻存复苏、流式细胞仪检测和定向诱导分化。采用热致相分离技术,以聚（乳酸-乙醇酸）共聚物为基材,利用自制带瓣静脉模具制备三维组织工程带瓣静脉支架,制备组织工程带瓣静脉支架,并研究其形态结构。将骨髓间充质干细胞种植在支架上构建可降解的带瓣静脉,在体外培养2周。 结果与结论：扫描电镜观察显示支架孔隙率高。培养的细胞符合骨髓间充质干细胞的形态特征,培养的细胞大部分表达CD29和CD44,不表达CD34和CD45。细胞毒性实验显示支架无毒性,有利于细胞增殖和迁移。将细胞种植在支架表面上培养后可形成单层细胞层。体外实验验证细胞支架复合物的瓣膜有一定的开闭功能。利用三维聚（乳酸-乙醇酸）共聚物支架和骨髓间充质干细胞可成功构建组织工程带瓣静脉,组织工程带瓣静脉将有可能作为静脉瓣膜的的替代物治疗静脉瓣膜疾病。     

自体外周血及骨髓干细胞移植治疗糖尿病下肢动脉闭塞：随机对照

目的：观察自体外周血干细胞和骨髓干细胞联合移植治疗糖尿病下肢闭塞症的临床疗效。 方法：选择2003—09／2007-01河南省人民医院二内内分泌科194例糖尿病下肢闭塞症患者，随机分为对照组（n=95）和干细胞移植组（n=99），2组均接受内科综合治疗，在此基础上对干细胞移植组进行干细胞移植，95例患者双侧肢体行自体干细胞移植，3例仅缺血较重的一侧肢体行自体干细胞移植，1例因一侧肢体截肢，另一侧行肢体干细胞移植，干细胞移植的肢体为194条，患者对治疗知情同意，并经医院伦理委员会批准。对干细胞移植组患者进行外周血干细胞动员，每天给予人重组粒细胞集落刺激因子450～600u，皮下注射，第5天局部麻醉下从髂骨处抽取自体骨髓血200mL，在实验室将骨髓沉淀、离心，分离等处理后制备40mL干细胞悬浊液备用。第6天应用COBE6．1血细胞分离机单采单个核细胞，总量60-120mL。将两种干细胞悬液按3cm×3cm距离进行缺血肢体移植术，移植后2周观察症状、体征改变。 结果：①干细胞移植组疼痛症状明显缓解、好转、无效的肢体分别为94个、96个、4个，对照组分别7个、156个、27个，2组间显效率及无效率差异显著（P〈0．01）。②干细胞移植组冷感明显缓解、好转、无效的肢体分别为126个、63个、5个，对照组分别为6个、158个、26个，2组间显效率及无效率差异显著（P〈0．01）。③干细胞移植组间歇性跛行明显缓解、好转、无效的肢体分别为138个、47个、9个，对照组分别为13个、152个、25个，2组间显效率及无效率差异显著（P〈0．01）。所有患者未出现并发症和不良反应。 结论：自体外周血干细胞移植治疗糖尿病足是一种简便、安全、有效的治疗方法。     

以部分脱钙冻干骨材料为支架组织工程骨移植早期兔外周血T淋巴细胞亚群的变化

背景:骨衍生材料中冻干骨异抗原去除不充分,免疫原性强烈;脱蛋白骨和完全脱钙骨基质抗原性较弱,但前者无成骨诱导能力,后者生物力学性能很差,临床应用受到限制.目的:观察以部分脱钙冻十骨材料为支架的组织工程骨移植后兔外周血T细胞亚群的变化及移植组织的组织学变化.设计、时间及地点:随机分组设计、动物对照观察,于2006-06/2007-06在四川大学华西医院,生物治疗国家重点实验室与干细胞与组织工程研究室完成.材料:组织工程骨以兔骨膜来源的成骨细胞为种子细胞,经抗原自消化、部分脱钙、冻干后的异体骨为支架材料于体外构建.方法:将48只兔按随机数字表法分为4组.每组12只.分别用部分脱钙冻干骨、组织工程骨、白体骨、同种异体骨植入兔桡骨1 cm节段性缺损处.主要观察指标;流式细胞仪检测4组植入前及植入后1,2,4蒯移植早期外蒯血T淋巴细胞亚群变化,并通过组织学检测观察植入后2,4,8,12周时4种材料的成骨作用.结果:①部分脱钙冻干骨组、组织工程骨组植入后1,2周外周血CD4 和CD8 T细胞较植入前明显升高(P<0.05).植入后4周CD4 T细胞较植入前偏高不显著(P>0.05).自体骨组植入后CD4 和CD8 T细胞升高不明显(P>0.05).同种异体骨组植入后1,2,4周外周血CD4 和CD8 T细胞较植入前及其他各组同期均明显增高(P<0.05).②组织工程骨组植入后2周与材料孔隙内有成骨细胞和成软骨细胞,可见骨及软骨混合性新生物形成,周边分布古破骨细胞,部分网架呈蚕食状被破坏吸收.植入后4周,形成的新生骨过渡为编织骨.植入后8周,形成板层骨,部分脱钙冻干骨支架材料已被完全降解,吸收.植入后12周,植入物均L三完全被板层样骨所替代,髓腔再通.结论:部分脱钙冻干骨为支架材料构建的细胞-材料复合体移植后外周血T淋巴细胞增高,但不影响其良好的修复骨缺损能力.     

骨髓间充质干细胞对CD117^＋心脏干细胞分化过程中转化生长因子βⅢ型受体表达的影响

背景：骨髓间充质干细胞能够促进心肌细胞、血管生成。减轻心肌重构、改善心功能。但其旁分泌作用能否能够通过影响转化生长因子βⅢ型受体促进CD117^＋心脏干细胞的分化尚不清楚。目的：观察骨髓间充质干细胞对CD117^＋心脏干细胞分化过程中转化生长因子3型受体表达的影响。设计、时间及地点：细胞学体外对比观察,于2008-02/2009-02在新华医院完成。材料：新生大鼠,体质量5-8g,用于心脏干细胞分离培养：4周龄SD大鼠,体质量200-250g,用于骨髓间充质干细胞培养。方法：分离大鼠心肌组织进行植块培养,体外磁珠分离培养大鼠心脏干细胞,免疫荧光鉴定其表型为CD117^＋。将获得的CD117^＋心脏干细胞吹打制成单细胞悬液,无血清同步化24h,PBS冲洗3次,加入DMEM／F12培养基,接种至破明胶包被的6孔板。实验分为对照组和共培养组,对照组用心肌球培养液诱导分化的心脏干细胞。共培养组用Transwell小室避免细胞融合建立心脏干细胞与骨髓间充质干细胞共培养体系。主要观察指标：①倒置显微镜下观察心脏干细胞生长情况。（2）Westernblot检测CD117^＋心脏干细胞向心肌细胞系分化过程中培养第1,3,5,7天心肌钙蛋白T、缝隙连接蛋白43、转化生长因子βⅢ型受体和smad2及其磷酸化程度的改变。结果：①植块培养和磁珠分离法结合分离出CD117心脏干细胞,传代后心脏干细胞分散生长,细胞略小于普通心肌细胞。②诱导分化后第5,7天,共培养组心肌钙蛋白T和缝隙连接蛋白43的表达高于对照组（P〈0．05）;诱导分化后第1—7天,转化生长因子βⅢ型受体的表达均高于对照组（P〈0．05）：同时,磷酸化smad2／smad2的值也高于对照组（P〈0．05）。结论：骨髓间充质干细胞旁分泌作用能够促进CD117^＋心脏干细胞内心肌钙蛋白T,缝隙连接蛋白43和转化生长因子βⅢ型受体的表达,并提高了smad2蛋白的磷酸化程度。     

骨痂中转化生长因子-β1基因表达及利用骨痂植骨对术后功能的影响

背景:在骨折愈合过程中,若将骨折端周围的骨痂组织去除,骨折端比较难完全吻合,可以推测这些骨痂组织是人体在修复过程中的必然产物,应该是有益的,拟将这些骨痂做组织学分析和冰冻切片的原位杂交,观察其组织学内容和转化生长因子β1的含量,并做为供骨植于骨折端,了解骨痂植骨在骨折愈合中的作用。目的:通过测定骨痂中的组织学内容和转化生长因子β1的含量来了解延迟手术中骨折端周围骨痂组织的再利用价值。设计:采用骨痂组织原位杂交及随机分组对照的实验。单位:西安交通大学第二医院骨科、台州市中心医院骨科。材料:病例分别选择西安交通大学第二医院骨科和台州市中心医院骨科1994-07/2003-10骨折延迟手术的住院患者51例,在手术中取骨折延迟愈合的骨痂做标本(均已征得患者同意),Dig标记试剂盒购自BoehringerMannheim公司,转化生长因子β1寡核苷酸探针的序列:CTTGCTGTACTGTGTGTCCAA,由DNA合成仪合成,X线计算机系统(CR)购自日本富士公司。方法:在骨折后的2,4,6和8周,在手术中取出少量骨痂做标本,采用不脱钙的骨痂组织做冰冻切片,采用非同位素Dig标记原位杂交,观察转化生长因子β1在骨痂中的基因表达。术中将骨断端清理后,在骨折牢固固定的同时,再将原骨痂植于骨缺损处及骨折周围。对延迟手术的患者分别采用单纯骨痂植骨、髂骨植骨,骨痂加髂骨植骨,经1～4年患者复诊随访,平均1年9个月。主要观察指标:①骨折不同时期骨痂中的组织学内容和转化生长因子β1的含量。②不同植骨方式对骨折愈合时间的影响。结果:参加治疗51例,有7例因死亡和到外地生活而未能进行随访,评定44例,纳入结果分析。①骨痂中转化生长因子β1的基因表达:骨折后第2周,骨折端有少量纤维骨痂,软骨骨痂较多,转化生长因子β1在软骨小岛内的软骨细胞中高表达。骨折后4周左右转化生长因子β1在成骨细胞内表达显著。8周左右大量骨痂生长,并以软骨化骨为主,成纤维细胞、骨痂、成骨细胞、骨小梁越来越多,术后6周转化生长因子β1在各种细胞内的表达消失,但随着骨重建过程增强,8周时骨基质中转化生长因子β1表达又有增高趋势。②不同植骨方式的愈合时间:不同的植骨方式在愈合时间上没有显著性差异。结论:转化生长因子β1在骨愈合的平衡中发挥重要作用,不同阶段骨痂的组织变化和转化生长因子β1量的变化有着必然的联系,骨痂是机体修复和重建的产物,骨痂植骨再利用是一种可行的方法,它对需要植骨的患者可减少其痛苦和损伤。