TLR7/8激动剂R848体外诱导记忆B细胞分化抗原特异性浆细胞的方法研究

目的为了从PBMCs获得病原体特异性浆细胞,我们建立了TLR7/8激动剂R848体外诱导记忆B淋巴细胞分化浆细胞的方法。方法使用TLR7/8激动剂R848联合细胞因子组合,诱导接种乙肝疫苗(3年及以上)的健康志愿者来源的PBMCs,进行体外活化和分化浆细胞。分别利用ELISA和ELISPOT检测培养液上清中总IgG、HBsAg特异性IgG以及总抗体分泌细胞(ASCs)和HBsAg抗原特异性ASCs。结果成功建立R848体外诱导PBMCs中记忆B淋巴细胞分化浆细胞的方法。R848(使用质量浓度在1～2.5μg/ml)仅与IL-2联合使用,最早在第5天即可检测到特异性ASCs。结论通过该方法可以从患者恢复期少量(仅需5～10 ml)的外周血中获得抗原特异性抗体分泌细胞用于分析和分选,为中和抗体的制备提供方法。     

记忆B细胞与血清记忆

记忆B细胞被认为是记忆干细胞,通过抗原依赖和非抗原依赖的方式,能转化为浆细胞而产生抗体.B细胞的记忆形成涉及静止记忆B细胞和长寿命浆细胞.尽管已知这些细胞来源于生发中心,但刺激生发中心B细胞进入并维持记忆池所需的信号和环境尚不清楚.且它们是怎样从生发中心迁出,哪些因素决定其长期存活,记忆B细胞池与浆细胞池的组成和容量是多少等都还不十分清楚.这些问题的解决对免疫调控,防治自身免疫性疾病有重要的价值.     

细胞因子及抗-CD3单抗对外周血单个核细胞活化作用

探讨联合应用ＩＦＮ γ、ＩＬ 2及抗 ＣＤ3单抗对分离自健康供血者的外周血单个核细胞 (ＰＢＭＣ)在体外的诱导活化作用 ,并以单独应用ＩＬ 2作比较 ,分析了细胞活化的特征性标志。同时通过动态测定这些标志 ,认识了免疫细胞活化的动态过程。现将研究结果报告如下 :材料与方法试剂 :基因重组人ＩＦＮ γ ,上海克隆生物高技术有限公司产品 ;基因重组人ＩＬ 2 ,中国军事医学科学院基础所及北京中化生物技术研究所联合研制产品 ;ＣＤ3单抗 ,古巴分子免疫中心产品 ;ＭＴＴ及ＤＭＳＯ均为美国Ｓｉｇｍａ公司产品 ;ＦＩＴＣ或ＰＥ标记鼠抗人ＣＤ3…     

B细胞记忆多样性

机体可产生多种类型的记忆B细胞,常见的是经由生发中心产生的长寿命浆细胞和记忆B细胞,还有非依赖生发中心产生的记忆B细胞,以及TI-B记忆细胞.不同类型的记忆B细胞无论在产生路径、BCR类型还是在归巢部位方面均存在差异.这些差异可由抗原性质所决定,也可能是因免疫记忆过程中固有机制在发挥作用.通过对记忆B细胞产生路径、类型及归巢位置等方面进行探索,可更好地了解B细胞记忆形成过程的细节,才能为研制出更有效、更安全的疫苗提供先机.     

人类B细胞转化为抗体分泌浆细胞的体外研究

目的体外示踪不同刺激条件下人类B细胞转化为抗体分泌浆细胞的能力。方法对5名健康自愿者采用B细胞阴性选择磁珠分离法分离和体外培养B细胞，观察4种培养条件下（培养液对照组、PWM组、细胞因子组及PWM＋细胞因子组）、不同时间点B细胞转化为抗体分泌浆细胞的能力。采用双荧光标记（FITC—CD27、PE—CD38）流式细胞技术监测B细胞4种表面标志物的动态变化；采用酶联免疫法（ELISA）测定不同时间点培养上清液中1只浓度；采用酶联免疫斑点法（ELISPOT）测定不同时间点抗体分泌B细胞数。结果B细胞产生抗体浓度明显与培养条件有关。PWM刺激的B细胞培养上清液中Ig浓度最高（P=0．003）；PWM＋细胞因子组次之；细胞因子组与对照组差异无统计学意义。流式细胞分析结果显示，培养第7天浆细胞前体达峰，第10天浆细胞百分率达峰。活细胞数以细胞因子组最多，培养10d后仍呈增殖状态；而PWM组很快下降。ELISPOT法测定的Ig分泌B细胞数也以PWM组最佳，PWM＋细胞因子组次之。结论从Ig产生能力看，以PWM组最佳；从细胞增殖和浆细胞的存活来看，以细胞因子组最佳。表明体外诱导B细胞产生抗体不仅需要有效的刺激原，同时还需要必需的细胞因子信号促使细胞增殖和维持细胞的存活。     

TIM-3 mRNA在外周血单个核细胞不同细胞亚群及活化的T细胞上的表达

目的观察健康人外周血单个核细胞(PBMC)不同细胞亚群和活化的CD4+、CD8+T细胞上TIM-3mRNA的表达,探讨TIM-3mRNA的表达与T细胞功能的关系。方法应用实时定量RT-PCR(realtimeRT-PCR)技术,检测健康人PBMC不同亚群和CD4+、CD8+T细胞受刺激后TIM-3mRNA的表达。结果健康人PBMC中CD14+单核细胞、CD4+T细胞TIM-3mRNA的表达量较高(分别为0.84±0.088、0.64±0.11),CD4+T细胞受非特异性刺激后TIM-3mRNA表达明显升高(0.57±0.065vs0.85±0.080,t=18.07,P<0.0001)。结论TIM-3mRNA可能优先表达在健康人PBMCCD14+单核细胞、CD4+T细胞上,活化后的CD4+T细胞TIM-3mRNA的表达增多,提示TIM-3的表达与TH细胞的功能有关,也可能与单核细胞中某些产生TH1型细胞因子的亚群有关。     

静脉注射活化B细胞诱导Mls特异性免疫耐受

在胸腺摘除的成年小鼠静脉内注射Ｍｌｓ＋的活化Ｂ细胞可诱导Ｍｌｓ特异性免疫耐受。来源于ＣＤＦ１小鼠（Ｍｌｓ－１ｂ／ａ）的脾脏Ｂ淋巴细胞用抗ＩｇＭ抗体加ＩＬ－４刺激后静脉注射给摘除胸腺的成年ＢＡＬＢ／ｃ小鼠（Ｍｌｓ－１ｂ），在注射后第７、１１、１５天淋巴结中ＣＤ４＋Ｖβ６＋Ｔ细胞显著减少，而ＣＤ８＋Ｖβ６＋Ｔ细胞数无明显改变；在注射后第３天，与对照组相比，ＣＤ４＋Ｖβ６＋Ｔ细胞增加，但这些细胞对Ｍｌｓ抗原的反应性明显低于对照组。这些结果清楚地表明，自反应Ｔ细胞不但在胸腺被排除或功能性“排除”，而且在外周通过同样的机制维持自身耐受。     

SARS康复者特异性细胞免疫和免疫记忆T细胞功能的研究

目的　观察完全康复期严重急性呼吸综合征 (SARS)患者外周血针对SARS冠状病毒(SARS CoV)S抗原多肽的特异性细胞免疫反应。方法　分离外周血单个核细胞 (PBMC) ,经混合S抗原多肽刺激后 ,采用酶联免疫吸附试验 (ELISA)和酶联免疫斑点试验 (ELISPOT)检测 ,分析完全康复期SARS患者抗原特异性T淋巴细胞应答反应。结果　当SARS CoV的S抗原混合多肽刺激后 ,只有SARS康复期患者的PBMC分泌大量的IFN γ。同时 ,IFN γ产生细胞的阳性率也显著高于健康对照组 (P <0 .0 5)。此外 ,当用多克隆刺激剂 (PMA +ionomycin)刺激后 ,正常人和康复期SARS患者的PBMC产生等量的IFN γ及IFN γ产生细胞 ,两者经统计学处理 ,差异无统计学意义 (P >0 .0 5)。结论SRAS CoV不仅能诱导中和抗体的产生 ,而且还可诱导抗原特异性细胞免疫应答反应 ,并可在体内长期维持免疫记忆功能。     

抗原特异性细胞毒性T细胞体外扩增方法的研究近展

抗原特异性细胞毒性T细胞(cytoxicTlymphocytes,CTLs)在细胞免疫应答中起着重要的效应功能,从而在抗肿瘤和抗感染免疫中发挥着重要作用。由于受到各种因素的限制和影响,抗原特异性CTLs无法在体内有效地诱导和扩增,因此,通过体外诱导和扩增CTLs后再将此CTLs回输到体内是一个比较理想的方法,且具有重要的应用价值,如何高效激活和扩增抗原特异性CTLs是此法能否成功应用的关键。     

超抗原SEA对外周血T细胞的活化作用

目的 研究超抗原SEA对外周血T淋巴细胞的活化作用。方法 用SEA刺激人外周血T淋巴细胞,观察细胞的DNA合成、形态、IL-2的产生、细胞表型以及凋亡情况。结果 SEA对T淋巴细胞的促增殖作用的浓度为100mg/mL最强,在第2、3d达高峰;首次或多次刺激不改变T淋巴细胞的CD4^ CD8^ 的表型;首次刺激24h内未见明显凋亡;但再次刺激24h内即有明显凋亡;加入rhIL-22d凋亡现象消失。结论 超抗原SEA对T淋巴细胞的促增殖作用与其浓度、作用时间有关,并且SEA首次或多次刺激对CD4^ T淋巴细胞和CD8^ T淋巴细胞起同等的活化作用。     

Frequencies of human influenza-specific antibody secreting cells or plasmablasts post vaccination from fresh and frozen peripheral blood mononuclear cells

The rise in influenza-specific neutralizing antibody levels is proceeded by a burst of antigen-specific antibody secreting cells (ASC) or plasmablasts identified in peripheral blood approximately 5-10 days post immunization. Blood antigen-specific ASC may function as an immune marker of vaccine responses in comparison to the pre- and post-neutralizing titers; however, some have questioned whether there is adequate survival of ASC isolated from peripheral blood after freezing, making multi-center vaccine trials difficult. Here, we demonstrate similar frequencies of influenza-specific ASC from fresh and frozen peripheral blood mononuclear cells (PBMC). Influenza Hemagglutinin (HA) H1, H3, and H7-specific ASC IgG ELISpots frequencies were compared from the same fresh and frozen PBMC 7 days after 2006 Trivalent Influenza Vaccine (TIV) in 10 young healthy subjects. H1-, H3-, and H7-specific IgG ASC spots/10⁶ from fresh PBMC on day 7 were 229 ± 341, 98 ± 90, and 6 ± 11 respectively. Total IgG ASC spots/million PBMC pre- and 7-day post-vaccination were 290 ± 188 (0.029% PBMC) and 1691 ± 836 (0.17% PBMC) respectively. There was no difference in the H1 -H3-, and total specific ASC IgG ELISpot frequencies from the fresh versus frozen PBMC on day 7 (p = 0.43, 0.28, 0.28 respectively). These results demonstrate feasibility of testing whether antigen-specific ASC from frozen PBMC are an early biomarker of long-term antibody responses in multi-center vaccine trials.     

Homocysteine accumulates in supernatants of stimulated human peripheral blood mononuclear cells

Moderate hyperhomocysteinaemia is associated with atherosclerosis, thrombosis and also with stroke and dementia. Elevated homocysteine concentrations are related to deficiency of folate and also vitamin-B12, as these two vitamins are essential co-factors in the remethylation of homocysteine to methionine. A causal role of homocysteine in the pathogenesis of vascular disease has been discussed over years. Immune activation appears to be involved strongly in atherogenesis as well as in other diseases found to be associated with moderate hyperhomocysteinaemia. To study a possible influence of immune stimulation on homocysteine metabolism, in vitro experiments were performed using peripheral blood mononuclear cells upon stimulation with mitogens concanavalin A, phytohaemagglutinin and pokeweed mitogen. In stimulated cells a dose-dependent increase of homocysteine concentrations was found. When cells were kept in medium supplemented with methionine, homocysteine concentrations increased further, while supplementation with folate had only a slight effect. We conclude that in supernatants of stimulated peripheral blood mononuclear cells homocysteine is accumulating. T cell activation could be involved in the development of moderate hyperhomocysteinaemia.     

慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞Toll样受体3的表达降低

目的 探讨慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞Toll样受体3(TLR3)的表达及其临床意义.方法 分别采集慢性乙型肝炎患者和健康志愿者外周血,荧光定量PCR法检测血清HBV DNA复制水平;使用RT-PCR、流式细胞术以及免疫印迹技术分别检测外周血单个核细胞TLR3的mRNA、蛋白的表达;使用ELISA法检测血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和干扰素β(IFN-p)水平.结果 慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞中的TLR3表达显著低于健康志愿者,且降低水平与血清HBV DNA复制水平相关;慢性乙型肝炎患者外周血TNF-α、IFN-β浓度显著低于健康志愿者,且降低的水平与血清HBV DNA复制水平相关.结论 慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞TLR3的表达与乙肝病毒的复制水平相关.     

HCV感染外周血单个核细胞及其对T淋巴细胞亚群的影响

目的：研究丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）感染外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）的情况及其对Ｔ淋巴细胞亚群的影响。方法：运用非同位素原位杂交（ＮＩＳＨ）法和链酶亲和素－生物素（ＳＡＢＣ）法分别检测２０例慢性丙型肝炎患者ＰＢＭＣ中的ＨＣＶ－ＲＮＡ和非结构（Ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ,ＮＳ）蛋白ＮＳ５抗原,同时用ＳＡＢＣ法检测其Ｔ淋巴细胞亚群。结果：８例（４０．０％）患者的ＰＢＭＣ中ＨＣＶ－ＲＮＡ呈构（Ｎｏｎｓｔｒｕ     

Modulation of in vitro immunoglobulin synthesis of human peripheral blood mononuclear cells by nicotine and cotinine

The influence of nicotine and its main metabolite cotinine on the spontaneous and cytokine-induced immunoglobulin synthesis was studied. The immunoglobulin (G,A) synthesis of peripheral blood mononuclear cells was altered by nicotine donor dependently in the concentration range from 10–6 to 10^–8 M. Cotinine also modulates immunoglobulin (G, A) synthesis. The effective concentration range is about 100 fold higher. Only marginal effects on IgM synthesis were observed. Neither nicotine nor cotinine showed any effect on IgE production or on the IgE class switch. Moreover, both agents induced the production of the cytokines interleukin-1, –2, –3, –4, and –6. Therefore it is suggested that the strongly donor-dependent heterogeneity in the response to nicotine or cotinine is the result of the fine balance of theinduced cytokines.Abbreviations IFN interferon - IL interleukin - PBMC peripheral blood mononuclear cells - TNF tumor necrosis factor Correspondence to: A. Fischer     

卡介苗多糖核酸对过敏性支气管哮喘外周血单个核细胞TH1/TH2反应的作用

目的观察卡介苗多糖核酸(BCG-PSN)对支气管哮喘患者外周血淋巴细胞TH1/TH2反应的作用,并与结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)进行比较. 方法缓解期过敏性支气管哮喘患者16例,对照组健康成人13例,分离外周血单个核细胞(PBMC),分别加入不同浓度的BCG-PSN(1、10、100、1000 μg/ml)、TB-PPD(10 μg/ml)、尘螨抗原(DerP, 10 μg/ml)体外培养4 d,不加刺激剂者为阴性对照.收集培养上清,ELISA检测IFN-γ、IL-5浓度的变化. 结果 PSN(1～100 μg/ml)刺激正常人PBMC分泌IFN-γ水平均高于哮喘患者(P＜0.05).BCG-PSN(10 μg/ml)可以刺激哮喘患者PBMC分泌IFN-γ(358.7 pg/ml,范围0～2433.0 pg/ml),但显著低于同等浓度的TB-PPD刺激作用(13 036 pg/ml,范围600.5～35 100.0 pg/ml,P＜0.01).PSN刺激PBMC分泌IFN-γ呈浓度依赖性,当浓度达到100 μg/ml时,与低浓度相比刺激作用显著增强(P＜0.01),与TB-PPD的刺激作用类似.DerP刺激哮喘患者PBMC分泌IL-5水平显著高于正常人(P＜0.05).BCG-PSN刺激PBMC分泌IL-5的作用较弱,显著低于TB-PPD和DerP的刺激作用. 结论 BCG-PSN具有一定的TH1刺激作用,但低于TB-PPD的刺激作用,有待对BCG-PSN组分进一步优化以增强疗效.     

羊水来源间充质细胞对于外周单核淋巴细胞增殖抑制作用的机制研究

目的鉴定羊水来源间充质细胞(AF-MCs)并探讨其对于外周单核淋巴细胞(PBMC)增殖活性的影响及机制。方法通过选择性消化和单克隆培养分离及培养人源羊水细胞(AFCs),而后通过核型分析细胞来源和流式分析细胞表型鉴定其为间充质细胞(MCs)。另一方面,将鉴定得到的AF-MCs与PBMC共培养,检测其是否具有免疫抑制功能。运用流式分析CD4~+CD25~+Foxp3~+T细胞频率在共培养前后变化,探讨AF-MCs具有免疫抑制功能的机制。结果AF-MCs来自于胚胎发育过程中的脱落细胞,其具有与骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)相似的表型,且其能上调CD4~+CD25~+Foxp3~+T细胞的频率而产生免疫抑制功能。结论AF-MCs具有与BM-MSCs类似的表型,并且在免疫调节方面与BM-MSCs类似。这为临床应用间充质干细胞提供了一个新的,安全的种子细胞来源。     

Polyclonal B cell activation for accurate analysis of pre‐existing antigen‐specific memory B cells

The enzyme‐linked immunospot (ELISPOT) assay is a widely used tool for enumeration of antigen‐specific memory B cells in several disciplines, such as vaccination, cancer immunotherapy and transplantation. For the accurate estimation of antigen‐specific memory B cell frequencies, a well‐defined B cell activation protocol is pivotal. In this study, we aimed to characterize a polyclonal B cell activation protocol to facilitate optimal monitoring of antigen‐specific memory B cell frequencies. Total, naive and memory B cells were activated polyclonally with an α‐CD40 monoclonal antibody, cytosine–phosphate–guanine (CPG) oligodeoxynucleotide (ODN) 2006, interleukin (IL)‐2, IL‐10 and IL‐21. Polyclonal activation of B cells resulted in equal cell death ratios in naive and memory B cells. When tested in an antigen‐specific system, immunoglobulin (Ig)G spots were detected only in the memory fraction. There was no change in B cell polyclonality due to in‐vitro activation. Our data show that the current polyclonal activation protocol may be used reliably to estimate the frequency of memory B cells in ELISPOT assays.