甲基丙烯酸环氧丙酯致人支气管上皮细胞恶性转化研究

目的 研究潜在致癌化学物甲基丙烯酸环氧丙酯(GMA)诱发人支气管上皮细胞恶性转化的作用.方法 分别采用1、2、4、8μg/ml浓度的GMA多次处理人支气管上皮细胞(16HBE),连续动态地观察细胞形态学的改变,通过刀豆凝集素A(conA)试验、软琼脂集落形成试验、电镜扫描和裸鼠体内致瘤性试验观察细胞的恶性转化表型,并运用免疫化学方法对细胞和肿瘤组织来源特性进行鉴定.试验同时设二甲基亚砜(DMSO)溶剂对照组和三甲基胆蒽(MCA)阳性对照组.结果 1～8 μg/ml浓度范围的GMA多次攻击可使16HBE细胞发生恶性转化,转化率随染毒剂量的增加而升高,其中8μg/ml染毒组的转化率(8.48×10-6)与对照组(4.5×10-7)相比差异有统计学意义(P<0.01).转化细胞失去接触抑制呈交错重叠生长并能在软琼脂上形成集落,各剂量组的集落形成率随染毒剂量的增加而升高,其中2、4、8μg/ml染毒组的集落形成率分别为1.20‰、2.35‰和5.70‰,与溶剂对照组(0.30‰)相比差异有统计学意义(P<0.01).转化细胞对conA的凝集敏感性增加,扫描电镜下细胞表面微绒毛增多、变粗、变长.将转化细胞接种于裸鼠皮下可形成肿块,经病理组织学检查诊断为鳞状上皮细胞癌.16HBE细胞和肿块组织经免疫组织化学检测角蛋白呈阳性表达.结论GMA可在体外诱发16HBE细胞发生恶性转化.     

长期砷暴露诱导人膀胱上皮细胞恶性转化的研究

目的构建低浓度长期亚砷酸钠(NaAsO_2)诱导人膀胱上皮细胞(SV-HUC-1)恶性转化模型,研究低浓度长期砷暴露对SV-HUC-1恶性转化过程的影响。方法 0和0. 5μmol/L NaAsO_2分别长期处理SV-HUC-1至40周(约80代,10个月),观察暴露组及对照组细胞在培养至10、20、30和40周时形态,四氮唑盐比色(MTT)验证细胞增殖速率;划痕实验、Transwell细胞迁移实验验证细胞迁移能力;软琼脂集落形成实验观察细胞肿瘤形成能力。结果随NaAsO_2处理时间的延长,细胞由连接紧密的扁平多变形状向松散的长梭型转变; 0. 5μmol/L NaAsO_2处理至20周后,细胞活力显著增强,与处理10周时比较差异有统计学意义(P0. 01);划痕愈合实验显示,砷暴露20周后,划痕愈合面积显著大于10周(P0. 01); Transwell细胞迁移侵袭能力30周时显著高于10周(P0. 01);软琼脂集落形成实验显示,砷暴露30周后软琼脂上出现大量明显的锚定生长集落,20、30、40周组集落形成数量分别为10周组的1. 85、9. 79和15. 36倍(P0. 01),未经砷暴露组各代数有极少集落,且体积小,故忽略不计。结论 0. 5μmol/LNaAsO_2长期处理的SV-HUC-1可逐渐恶转,在砷处理20～30周时已初具恶性表型,40周后细胞恶性转化。     

甲基丙烯酸环氧丙酯致人支气管上皮细胞恶性转化过程中P16基因的甲基化状态

目的 分析甲基丙烯酸环氧丙酯(glycidyl methacrylate,GMA)致人支气管上皮16HBE细胞恶性转化过程中不同时点P16基因甲基化状态的差异,探讨GMA诱导16HBE细胞发生恶性转化相关DNA甲基化机制.方法 收获GMA转化早期(染毒结束)、转化前期(第10代)、转化后期(第30代)的16HBE细胞,采用甲基化特异性聚合酶链反应(Methylation-specific PCR,MSP)检测该基因组P16基因启动子区的甲基化状态,并与未转化的16HBE细胞及同期培养的DMSO溶剂对照细胞进行比较.结果 转化早期及转化前期,正常对照组及DMSO溶剂对照细胞中该基因启动子区均表现为非甲基化,而GMA组细胞中表现为不同程度的甲基化,阳性对照表现为甲基化;转化后期,正常对照组细胞中该基因启动子区表现为非甲基化,而DMSO溶剂对照组及GMA组细胞中均表现为部分甲基化,阳性对照表现为甲基化.结论 在GMA诱导16HBE细胞恶性转化早期及前期P16基因的甲基化状态具有特异性,故可将其作为GMA诱导16HBE细胞发生恶性转化的一个早期敏感指标.     

JWA对N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍诱导人支气管上皮细胞恶性转化的影响

目的 探讨JWA对烷化剂N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)诱导人支气管上皮细胞(HBE)恶性转化的影响及可能机制.方法 建立JWA高表达HBE细胞株,用MNNG诱导HBE细胞恶性转化,用噻唑蓝(MTT)法检测MNNG诱导后细胞生长状况,用软琼脂集落试验检测细胞非锚着依赖生长能力,用Western blot法检测P53蛋白的表达变化规律.结果 经MNNG处理的正常HBE细胞恶性转化后生长速度明显快于高表达JWA的HBE细胞和未经MNNG处理的HBE细胞,差异有统计学意义(P＜0.05).经MNNG处理的JWA高表达的HBE细胞和未用MNNG处理的HBE细胞的克隆形成率(8.06%和10.14%)明显低于MNNG处理的恶性转化的HBE细胞(26.80%),差异有统计学意义(P＜0.01).MNNG诱导正常的HBE细胞恶性转化过程中,P53蛋白逐渐增加;而在JWA高表达HBE细胞,经MNNG处理后,P53蛋白早期(第1～2代)有一过性的表达增高,此后,随着传代数增加,P53表达则逐渐下降,细胞最终未显示恶性转化表型特征.结论 JWA可能通过P53蛋白表达调节MNNG诱导HBE细胞的恶性转化.     

反式BPDE诱发的转化细胞与成瘤细胞FHIT基因变化研究

目的:探讨苯并(a)芘[B(a)P]代谢产物反式二氢二醇环氧苯并芘[anti-7,8,-dihydrodiol-9,10-epoxidebenzo(a)pyrene,BPDE]引起的细胞FHIT基因突变情况。方法:PCR、RT-PCR、多聚酶链聚合反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)。结果:PCR-SSCP结果提示反式BPDE诱发的恶性转化细胞及其裸鼠成瘤细胞FHIT基因的Exon1-9出现了异常的小片断。结论:反式BPDE可作用于细胞染色体3p14.2的脆性部位FRA3B,引起FHIT基因的重排或缺失,导致FHIT基因功能失活。推测FHIT基因可能是反式BPDE致癌作用的靶分子之一。     

氟维司群对亚砷酸钠致人支气管上皮细胞恶性转化的抑制作用研究

目的 研究雌激素受体拮抗剂氟维司群对亚砷酸钠致人支气管上皮细胞恶性转化的抑制作用,为探讨雌激素受体在砷致肺癌发生中的作用提供实验依据。方法 单纯以2.5 μM亚砷酸钠对人支气管上皮细胞株16-HBE持续染毒者设为对照组,自染毒30代起加入不同剂量（10-11、10-9、10-7M）氟维司群与砷联合处理者设为低、中、高剂量拮抗剂组,同时设置溶剂对照组（DMSO）。各组细胞继续培养至60代时,利用qPCR和Western Blot测定氟维司群干预下细胞ERα、ERβ mRNA和蛋白的相对表达水平,软琼脂克隆形成实验和划痕实验分别测定氟维司群对细胞克隆形成能力和迁移能力的影响。结果 培养至60代时,各剂量拮抗剂组细胞ERα mRNA和蛋白表达均低于对照组和溶剂对照组(P＜0.05);中、高剂量拮抗剂组细胞ERβ mRNA表达均低于对照组和溶剂对照组(P＜0.05),各剂量拮抗剂组细胞ERβ 蛋白表达水平均低于对照组和溶剂对照组(P＜0.05)。各剂量拮抗剂组的软琼脂克隆形成数和细胞24 h迁移距离均低于对照组和溶剂对照组(P＜0.05)。结论 氟维司群通过下调雌激素受体表达抑制了亚砷酸钠诱导的人支气管上皮细胞株16-HBE恶性转化,雌激素受体可能参与了砷致细胞恶性转化。     

石英诱发人支气管上皮细胞恶性转化模型的建立

目的 研究石英诱发永生化的人支气管上皮细胞系(16HBE)的恶性转化作用.方法 用新研磨的浓度为300 mg/L的石英染毒16HBE细胞共10次,软琼脂集落形成实验和裸鼠成瘤实验鉴定转化细胞的恶性程度.结果 细胞培养至35代,发现石英可以诱导16HBE发生恶性转化.转化细胞排列紊乱,重叠生长,在软琼脂中的集落形成率显著高于对照组(P<0.01);转化细胞在裸鼠体内成瘤.结论 石英具有较强的诱导16HBE恶性转化能力.     

云锡矿粉诱导人肺上皮细胞转化和成纤维细胞活化过程中的相互作用

目的 探讨云锡矿粉诱导人肺上皮细胞转化及成纤维细胞活化过程中的相互作用.方法 常规培养永生化人支气管上皮细胞(BEAS-2B)及人胚肺成纤维细胞(WI-38),每6天传代1次;100μg/ml的云锡矿粉隔代诱导BEAS-2B及WI-38至第9代,共诱导5次,自第11代分组共培养至第40代.刀豆凝集素A及锚着独立性生长实验检测细胞恶性转化,流式细胞术检测细胞周期变化,免疫细胞化学法检测成纤维细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达.结果 (1)与正常BEAS-2B细胞相比,矿粉诱导的BEAS-2B细胞单独培养至第28代细胞形态开始出现改变;与WI-38细胞共培养后,细胞形态改变提早至第20代;与矿粉诱导的WI-38细胞共培养后,细胞形态改变进一步提早至第16代.矿粉诱导的BEAS-2B细胞培养至第26代时凝集实验出现阳性;与WI-38细胞及矿粉诱导的WI-38细胞共培养后,细胞凝集时间缩短.与WI-38细胞共培养的矿粉诱导BEAS-2B及与矿粉诱导WI-38细胞共培养的矿粉诱导的BEAS-2B细胞分别在第26及第36代锚着独立性生长实验出现阳性,第36代的克隆形成率分别为6.00‰±1.00‰和15.33‰±2.52‰,且差异有统计学意义(P<0.05).矿粉诱导的各组上皮细胞S期细胞所占比例随培养代数增加逐渐升高,细胞发生恶性转化.(2)100 μg/ml矿粉诱导的成纤维细胞培养至第26代出现α-SMA表达;与上皮细胞共培养后,成纤维细胞α-SMA表达增强,且随培养代数的增加,阳性表达细胞数明显增多,着色程度增强.结论 个旧矿粉能诱导支气管上皮细胞恶性转化及成纤维细胞活化;肺上皮细胞是矿粉诱癌的主要靶细胞;肺上皮细胞的转化和成纤维细胞的活化相互影响,相互促进.     

单核巨噬细胞在煤焦沥青烟提取物诱导永生化人支气管上皮细胞恶变中的作用

目的 探讨单核巨噬细胞(THP-1)在煤焦沥青烟提取物(coal tar pitch,CTP)致永生化人支气管上皮细胞(human bronchial epithelial cells,BEAS-2B)恶变过程中的作用及肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)在该过程中的表达.方法 以THP-1和BEAS-2B为研究对象,设立CTP组、苯并(a)芘[B(a)P]组(阳性对照组)、二甲亚砜对照组(溶剂对照组)、BEAS-2B与THP-1共培养组,建立细胞恶性变模型.应用软琼脂集落形成实验、染色体数目畸变分析、流式细胞仪测定细胞周期中不同培养时期(10、20、30代)细胞的恶变情况,利用ELISA方法测定CTP组及共培养组细胞培养上清中TNF-α的含量.结果 染色体数目异常在实验的早期(10代)已经显现,表现为非整倍体和多倍体比例增加,二倍体数目减少.在第20代:共培养组克隆形成率(17.63‰±0.97‰)明显高于CTP组(13.94‰±0.84‰)和阳性对照组组(12.96‰± 1.62‰),差异有统计学意义(P＜0.05);共培养组S期细胞比例(44.49％±0.68％)明显高于CTP组(38.19％±1.26％)和阳性对照组(36.41％±1.19％),差异有统计学意义(P＜0.05).共培养组细胞培养上清中TNF-α含量明显高于CTP组,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 THP-1能够加速CTP诱导的BEAS-2B恶变,增加TNF-α的表达水平.     

活性氧、丙二醛及超氧化物歧化酶在NaAsO_2致人角质形成细胞恶性转化过程中的动态变化

目的探讨氧化应激相关指标活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)在砷致人角质形成细胞(human keratinocytes,Ha Ca T)恶性转化不同阶段的动态变化。方法以含1.0μmol/L Na As O2的DMEM高糖完全培养基连续培养Ha Ca T细胞35代后,用基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达水平变化、细胞生长动力学改变和软琼脂集落形成实验鉴定其是否发生恶性转化。分别收集0、1、7、14、21、28和35代细胞,采用流式细胞仪检测不同代数细胞内ROS活性,生化法检测细胞内MDA含量及SOD活性变化。结果 1.0μmol/L Na As O2处理Ha Ca T细胞28代开始MMP-9相对蛋白水平明显上升,35代后细胞生长速度明显增快,倍增时间明显缩短;软琼脂集落形成数为(107±11)个,较对照组(24±7)明显增多(P<0.01)。ROS水平在染毒0到14代间呈先上升后下降随后再上升趋势,14代以后ROS水平逐渐降低。MDA含量在染毒1代时达到峰值,随后呈缓慢下降趋势。SOD活性在染毒0到21代呈先上升后缓慢下降趋势,21代以后其活性再次升高,呈持续上升趋势,且较0代明显升高(P<0.05)。结论低剂量亚砷酸钠长期诱导Ha Ca T细胞发生恶性转化过程中伴随细胞内氧化-抗氧化平衡失调,染毒后期SOD活性持续增加而ROS水平持续降低。     

人造矿物纤维诱导人支气管上皮细胞系恶性转化的研究

目的 比较温石棉、难溶性陶瓷纤维(RCF)、玻璃棉(GW)、岩棉(RW)对人支气管上皮细胞BEAS-2B细胞株的细胞毒性与致恶性转化的能力.方法 检测温石棉、RCF、GW、RW对BEAS-2B的细胞毒性;BEAS-2B细胞每10 d染毒24 h,共染毒6次,待细胞出现生长抑制后,用锚着不依赖性生长实验判断细胞恶性转化.结果 温石棉、RCF、GW、RW均对BEAS-2B细胞具有细胞毒性,并呈剂量一反应关系.染毒6次后,温石棉组、RCF组细胞生长速度加快,排列紊乱,失去接触抑制,出现复叠层生长,并可在软琼脂上生长,细胞集落形成率分别为4.6%和7.2%,与阴性对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);而GW组和RW组细胞集落形成率分别为0.6%和0.4%,与阴性对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论 温石棉组、RCF具有使BEAS-2B细胞发生恶性转化的能力,GW、RW染毒60 d未能使BEAS-2B细胞发生恶性转化.     

个旧矿粉诱导的支气管上皮转化细胞cDNA消减文库的构建

目的 构建永生化人支气管上皮细胞BEAS-2B与其受个旧矿粉体外诱导的恶性转化细胞之间差异表达的cDNA消减文库.方法 以BEAS-2B为对照组,以采自个旧井下作业面的矿粉为染毒物在体外成功诱导的恶性转化细胞为实验组.分别提取总RNA;应用SMART cDNA合成技术,获得充足的ds cDNA;应用抑制性消减杂交(SSH)技术分离BEAS-2B与其恶性转化细胞之间差异表达的基因片段;再通过T/A克隆和蓝白筛选实验,克隆BEAS-2B与其恶性转化细胞之间差异表达的基因片段,构建二者之间差异表达的cDNA消减文库.结果 通过SSH和T/A克隆等技术成功构建了具有较高消减效率的BEAS-2B与其恶性转化细胞之间差异表达的cDNA消减文库,文库经扩增后得到107个白色克隆和41个蓝色克隆.结论 应用SSH技术成功构建了具有较高消减效率的BEAS-2B与其恶性转化细胞之间差异表达的cDNA消减文库,为进一步研究个旧矿粉致肺癌发生的分子生物学机制奠定了基础.     

缺氧条件下前列腺上皮细胞体外培养雌雄激素受体的表达

目的 观察在缺氧条件下前列腺上皮细胞体外培养细胞核膜表面雌雄激素受体表达的变化.方法 前列腺上皮细胞株RWPE-1体外培养,在缺氧或有氧培养环境中分别于接种后4、8、12、24、48 h检测其核膜雌雄激素受体基因和蛋白表达.基因表达采用RT-PCR法检测,蛋白表达采用免疫组化法检测.结果 缺氧条件下接种4h前列腺上皮细胞雄激素受体mRNA表达为(0.32±0.01),后随时间逐渐上升至48 h为(1.13±0.08),显著高于同期有氧条件下的(0.26±0.02,P=0.01)和(0.31±0.01,P=0.003);免疫组化显示,缺氧条件下雄激素受体蛋白表达自12h开始较有氧条件下显著增加,分别为(42.08±1.58)/200个细胞和(26.37±6.76)/200个细胞(P=0.017).有氧条件下前列腺上皮细胞不论在基因还是蛋白水平雌激素受体几乎不表达;而缺氧条件下12 h可检测出雌激素mRNA表达为(0.15±0.01),至48 h升至(0.41±0.04),4h时雌激素阳性表达上皮细胞为(4.98±0.49 )/200个细胞,后逐渐升至48 h的(45.94±0.90 )/200个细胞.结论 缺氧可刺激前列腺上皮细胞核膜表面雌雄激素受体表达的上调.     

Lycopene inhibits the growth of normal human prostate epithelial cells in vitro

Lycopene has repeatedly been shown to inhibit the growth of human prostate cells in vitro. However, previous studies with lycopene have focused on cancer specimens, and it is still unclear whether this carotenoid affects the growth of normal human prostate cells as well. Therefore, we investigated the effects of lycopene on normal human prostate epithelial cells (PrEC) by treating them with synthetic all-E-lycopene (up to 5 micromol/L) and assessing proliferation via [3H]thymidine incorporation. The effects of lycopene on cell cycle progression were investigated via flow cytometry. To elucidate whether lycopene modulates cyclins involved in cell cycle progression, protein expressions of cyclins D1 and E were analyzed. The results show that lycopene significantly inhibited the growth of PrEC in a dose-dependent fashion. Flow cytometry revealed a significant cell cycle arrest in the G0/G1 phase. This effect was confirmed by inhibition of cyclin D1 protein expression, whereas cyclin E levels remained unchanged. The results demonstrate that lycopene inhibits growth of nonneoplastic PrEC in vitro. We hypothesize that lycopene might likewise inhibit the growth of prostatic epithelial cells in vivo. This might have an effect on prostate development and/or on enlargement of prostate tissue as found in benign prostate hyperplasia, a potential precursor of prostate cancer.     

烟草甲基亚硝胺吡啶基丁酮诱发HPV-18永生化人类支气管上皮细胞恶性转化

观察了烟草特异亚硝胺ＮＮＫ诱发ＨＰＶ－１８永生化人类支气管上皮细胞（ＢＥＰ２Ｄ）恶性转化过程中细胞生物学特征的变化。５００ｍｇ／ＬＮＮＫ处理ＢＥＰ２Ｄ细胞一天后,细胞在体外可连续传代,第５代细胞显示抗血清生长;第１５代细胞在半固体琼脂中的集落形成率（０．０３８％））为对照细胞（０．００３３％）的１１倍;第２５代细胞在裸鼠体内成瘤,组织学证实为高分化鳞状细胞癌。以上结果表明ＮＮＫ致ＢＥＰ２Ｄ细胞恶性转化是一种多阶段的发展过程。该培养体系为深入研究人类支气管上皮细胞多阶段癌变的细胞和分子机制提供了一种理想的生物材料。     

烟草甲基亚硝胺吡啶基丁酮诱发HPV—18永生化人类支气管上皮细胞恶性 …

观察了烟草特异亚硝胺ＮＮＫ诱发ＨＰＶ－１８永生化人类支气管上皮细胞（ＢＥＰ２Ｄ）恶性转化过程中细胞生物学特征的变化。５００ｍｇ／ＬＮＮＫ处理２ＢＥＰ２Ｄ细胞一天后,细胞在体外可连续传代,第５代细胞显示抗血清生长;第１５代细胞在半固体琼脂中的集落形成率（０．０３８％）为对照细胞（０．００３３％）的１１倍;第２５代细胞在裸鼠体内瘤,组织学证实为高分化鳞状细胞瘤,以上结果表明ＮＮＫ致ＢＥＰ２Ｄ细胞恶性转     

Effects of naturally occurring and synthetic organoselenium compounds on protein profiling in androgen responsive and androgen independent human prostate cancer cells

Prostate cancer represents a major clinical public health challenge. Both epidemiological and clinical intervention studies support the protective role of selenium against development of prostate cancer. However, the mechanisms responsible for the inhibitory activity by this micronutrient remain elusive. Furthermore, literature reports consistently have shown that the dose and form of selenium are important factors in cancer chemoprevention. Thus, in the present investigation using androgen responsive (AR) lymph node carcinoma of the prostate (LNCaP) and its androgen-independent clone (AI) LNCaP C4-2 human prostate cancer cells, we compared the effects of selenomethionine (SM) and 1,4-phenylenebis(methylene)selenocyanate (p-XSC) on cell growth, DNA synthesis, and on proteomic profiles. p-XSC (5-20 microM) significantly inhibited cell growth in both cell types in a dose-dependent manner; SM was also effective but at much higher doses (50-100 microM). We hypothesize that the inhibition of cell growth is due, in part, to selenium interaction with redox-sensitive proteins. Using 2D gel electrophoresis, both organoselenium compounds altered the expression, to a varied extent, of several unrecognized selenium-responsive proteins. Employing matrix-assisted laser-desorption ionization (MALDI) and time-of-flight (TOF; MALDI-TOF) followed by tandem mass spectrometric analysis, we identified the following proteins: cofilin-2, heterogeneous nuclear ribonucleoprotein, single-stranded mitochondrial DNA binding protein, chaperonin 10, nucleoside diphosphate kinase 6, and chain A Horf 6 human peroxidase enzyme. This is the first report showing that SM and p-XSC are capable of altering these proteins; their roles in prostate cancer prevention warrant further investigations.