采用单引物扩增法标记的基因芯片技术筛选乳腺原发癌与淋巴结转移癌的差异表达基因

目的比较乳腺原发癌与淋巴结转移癌的基因表达差异,筛选乳腺癌转移相关基因。方法采用单引物扩增(SPA)标记方法和含21000个人功能基因的Oligo芯片,比较10例淋巴结转移阳性乳腺癌患者的原发癌及淋巴结转移癌的基因表达差异,筛选至少5对样本中有1．5倍以上相同差异表达趋势的基因;采用实时定量RT—PCR方法对差异表达基因进行病例验证。结果SPA方法标记靶标可使用于一张芯片杂交的起始总RNA模板量减少至0．25μg;共筛选出57个基因在至少5对样本中有1．5倍以上相同的差异表达趋势,其中19个基因在转移癌中表达上调,38个基因下调,8个差异表达基因与细胞黏附和运动能力有关,14个与信号传导有关,14个与细胞生长代谢有关;实时定量RT—PCR检测30例乳腺癌原发癌与配对的淋巴结转移癌中纤维粘连蛋白(FN)的mRNA表达,转移癌中FN的mRNA表达平均相对表达量较原发癌下调3．6倍,配对t检验差异有统计学意义(t=-3．188,P=0．003)。结论(1)单引物扩增标记靶标的方法灵敏度高、重复性好。(2)以乳腺癌的淋巴结转移癌作为原发癌的转移亚克隆进行基因表达的差异比较,筛选得到的基因涉及了细胞黏附和运动能力、细胞信号传导、细胞生长代谢等与转移相关的生物学过程。(3)FN可能参与乳腺癌的转移过程,是潜在的预测乳腺癌转移和预后的分子标志。     

皮肤鳞状细胞癌相关差异表达基因及信号通路的生物信息学筛选

目的探讨皮肤鳞状细胞癌组织中的差异表达基因。方法从基因表达综合数据库(GEO)在线数据库中下载皮肤鳞状细胞癌(cSCC)组织相关的基因表达谱芯片数据集GSE42677和GSE53462,利用Limma包筛选肿瘤组织和正常皮肤组织之间的差异表达基因;利用DAVID工具对差异表达基因进行基因本体论(GO)和功能富集分析;利用STRING数据库分析差异表达基因之间的相互作用,并利用Cytoscape软件构建蛋白质之间相互作用网络,筛选核心基因和模块。结果两组芯片数据中共同上调表达基因43个,共同下调表达基因65个,这些差异基因主要富集在细胞增殖、皮肤发展、先天免疫反应、Toll样受体、趋化因子、转录调控、氨基酸代谢和p53信号通路;构建了这些基因之间的相互作用网络,获得cSCC相关前20核心基因,分别为CXCL8、 CCND1、 KIT、 PI3、 SPP1、 PLAU、 GATA3、 PLAUR、 CDKN2A、S100A7、KRT16、CXCL1、DEFB4A、ISG15、KRT2、S100A12、KRT6B、ISG20、OASL和IFI6。结论 cSCC组织与正常皮肤组织之间存在大量的差异表达基因,CXCL8、CCND1、KIT、PI3、SPP1、PLAU、GATA3、PLAUR、CDKN2A和S100A7等基因及其介导的信号通路在cSCC的发生过程中可能起着重要作用。     

用基因芯片筛选早期大肠癌相关基因

目的 用基因芯片技术筛选早期大肠癌相关基因. 方法 利用HG-U133Plus2.0基因芯片,对大肠腺瘤组织、癌组织和正常组织基因表达谱进行检测,并利用生物信息学方法对检测结果进行分析. 结果 腺瘤组织与正常组织比较,表达差异2倍以上基因及ESTs共有1892个,其中表达上调的485个,表达下调的1407个.腺瘤组织和癌组织同时与正常组织比较,有602个表达相同的基因及ESTs,其中表达上调2倍以上的125个,表达下调2倍以上的477个. 结论 602个腺瘤与癌表达相同的基因可能与早期大肠癌的启动和演化有关.     

正常妊娠晚期和子痫前期胎盘TAC3基因的表达

目的探讨子痫前期患者胎盘组织中TAC3基因的表达以及其影响因素。方法分别收集同期分娩的正常晚期妊娠和足月子痫前期患者的胎盘标本各12例，取胎盘母面绒毛小叶，进行细胞培养后，分别实时定量PCK检测胎盘的TAC3基因表达，以及由缺氧和氧化应激引发的TAC3基因在胎盘表达的改变，并用单向方差分析与t检验比较2组的差异。结果①对照组及子痫前期组的足月胎盘中均检测到TAC3基因。2组足月胎盘TAC3 mRNA在病例组高水平表达，为对照组的1．7倍，TACR3 mRNA在2组间差异无显著性。②低氧环境（2％氧气）细胞滋养层TAC3 mRNA的表达显著低于正常含氧环境生长的胎盘细胞滋养层（21％氧气）1．8倍。而在氧化或低氧应激下的合胞体滋养层TAC3的表达差异无显著性。同样条件下TACR3的表达也差异无显著性。结论TAC3表达的主要位点是胎盘，其表达在人子痫前期足月胎盘中极高，但低氧和氧化应激在体外不诱导TAC3的表达。     

宫内发育迟缓胎鼠肝脏PGC-1和PEPCK基因的表达变化

目的宫内发育迟缓(IUGR)是胰岛素抵抗的独立危险因素,通过检测IUGR胎鼠肝脏糖代谢相关酶的表达,探讨IUGR个体发生胰岛素抵抗的分子机制。方法通过孕期蛋白质营养不良法建立大鼠IUGR模型,孕21天时剖宫产,测量胎鼠的体重和肝重,采用RT-PCR和蛋白印迹技术检测胎鼠肝脏PGC-1和PEPCK的mRNA及蛋白表达的变化。结果与正常对照相比,IUGR胎鼠肝脏PGC-1的mRNA和蛋白表达水平明显增高(P<0.01),肝中PEPCKmRNA的表达也明显增高(P<0.01)。结论IUGR胎鼠肝脏PGC-1表达增加诱导了糖异生关键酶PEPCK的表达,促进肝脏糖异生,这是IUGR鼠成年后发生胰岛素抵抗的原因之一。     

差异表达基因的几种筛选方法

多种因素导致的基因差异性表达与疾病的发生发展密切有关,分离差异表达基因,对于研究细胞生命过程的调节机制及致病机制具有重要意义. 20世纪90年代以来,先后出现了mRNA差异显示PCR(mRNA DDRT-PCR)、代表性差异分析(RDA)、抑制性消减杂交(SSH)、基因表达连续性分析(SAGE)和DNA微阵列(DNA microarray)等多种分析差别表达基因的方法. 我们对以上方法的原理、基本步骤及其应用进行简要综述.     

孕中晚期胎儿畸形超声筛查的价值

目的探讨产前超声检查对胎儿显性畸形的诊断及价值。方法对16938例到中心检查的中晚期孕妇进行系统彩超筛查,与产后诊断相结合并进行回顾性分析。结果产前超声筛查的101例胎儿畸形全部经引产后证实,占全部筛查人数的5.96‰。结论产前超声系统胎儿筛查对显性胎儿畸形具有重要的诊断价值,是产前诊断的首选方法。     

利用全基因组寡核苷酸筛选大肠癌差异表达基因

目的筛查人大肠癌组织与相应正常大肠粘膜差异表达基因。方法应用美国AffymetrixHG—U133寡核苷酸芯片（代表迄今所知的32264个人类全基因．包括19308个已知的人类基因和12956个EST簇）检测9例大肠癌组织及相应正常大肠粘膜基因表达谱，并以实时荧光定量PCR技术对基因芯片检测结果进行验证；综合运用交集补集、秩和检验及t检验比较两组表达谱数据结果获得大肠癌组织与正常大肠粘膜组织差异表达基因和ESTs3125个（包括肿瘤上调基因ESTs974个、下调基因ESTs2151个）；大肠癌组织表达而相应正常粘膜不表达的ESTs245个：大肠癌组织不表达而正常粘膜表达的ESTs162个；最重要的大肠癌差异表达基因ESTs17个。本研究所筛得之大肠癌差异表达基因80．1％未见报道。结论综合运用交集补集分析、t检验、秩和检验对基因谱数据进行挖掘的策略，可为寻找大肠癌分子标记物和从整体上探讨大肠癌发生的分子机制奠定基础。     

利用全基因组寡核苷酸筛选大肠癌差异表达基因

目的 筛查人大肠癌组织与相应正常大肠粘膜差异表达基因。方法 应用美国AffymetrixHG-U133寡核苷酸芯片(代表迄今所知的32264个人类全基因,包括19308个已知的人类基因和12956个EST簇)检测9例大肠癌组织及相应正常大肠粘膜基因表达谱,并以实时荧光定量PCR技术对基因芯片检测结果进行验证;综合运用交集补集、秩和检验及t检验比较两组表达谱数据。结果 获得大肠癌组织与正常大肠粘膜组织差异表达基因和ESTs3125个(包括肿瘤上调基因ESTs974个、下调基因ESTs2151个);大肠癌组织表达而相应正常粘膜不表达的ESTs245个;大肠癌组织不表达而正常粘膜表达的ESTs162个;最重要的大肠癌差异表达基因ESTs17个。本研究所筛得之大肠癌差异表达基因80.1%未见报道。结论 综合运用交集补集分析、t检验、秩和检验对基因谱数据进行挖掘的策略,可为寻找大肠癌分子标记物和从整体上探讨大肠癌发生的分子机制奠定基础。     

人脑动静脉畸形差异表达基因的筛选和研究

目的应用基因芯片技术分析人脑动静脉畸形的基因表达谱。方法收集4例脑动静脉畸形样本和4例难治性癫痫患者行颞叶切除后显微分离的脑血管对照样本,提取组织中的总RNA,分别标记荧光探针后与含有21522个基因的寡核苷酸芯片进行杂交,SAM软件筛选差异表达基因,最后应用在线生物分子功能注释系统分析其可能参与的分子信号通路。结果脑动静脉畸形样本中118个基因的表达存在显著性差异,表达上调的45个,下调的73个。丝裂原活化蛋白激酶（MARK）信号通路富集基因最多,差异基因MAPK3、RPS6KA1、DUSP14、DUSP2参与ERK1/ERK2MAPK信号传导。ITGA4基因表达显著上调,其平均表达水平是对照组的6.15倍。一些血管生成相关基因如血管内皮生长因子、血管生成素和Ephrin家族基因表达未见显著性差异。结论ERK1/ERK2MAPK信号通路可能参与脑动静脉畸形的血管生成和血管重构。ITGA4基因可能通过其产物介导纤维结合蛋白信号,促进血管内皮细胞的增殖,在脑动静脉畸形的血管生成中发挥重要作用。     

抑制差减杂交方法筛选辐射诱导细胞恶性转化模型中的差异表达基因

目的:筛选辐射诱导的支气管上皮细胞恶性转化模型中的差异表达基因.方法:应用抑制差减杂交方法(SSH)构建辐射诱导的细胞转化模型差异表达基因的cDNA文库.对差减文库进行PCR筛选,对得到的差异片段进行测序及BLAST分析;对部分筛选出来的差异表达基因使用荧光定量PCR方法检测并确认其变化;将新的序列表达标签(EST)登录到GenBank上.结果:在80个进行测序的克隆中,得到确定序列的共73个.在转化细胞中表达下降的序列41条,BLAST比较分析结果:得到已知序列6条;未知基因的EST序列20条;空载体序列7条;8条为重复测定序列.在转化细胞中表达上升的序列32条,BLAST分析:已知序列14条;未知基因的EST序列9条;重复测定的序列9条.对其中的部分基因改变进行荧光定量PCR检测,结果表明辐射转化组中MY06、HACE1、ZNF143、HNRPH1的表达量明显增加(与对照组相比,转化组中的mRNA分别增加了3.49、29.38、12.99、5.00倍);而PCBP2、RPL15、TCERG1的表达量下降(与对照组相比,转化组中的mRNA分别减少了1.89、48.77、11.95倍).将得到的29个未知序列登录到GenBank,序列ID:EB643220～EB643248.结论:利用抑制差减杂交方法成功建立了恶性转化细胞模型差异表达cDNA文库,包含大量功能未知的新基因;ZNF143表达增加,其与细胞的增殖与分裂有关,TCERG1作为转录辅助激活因子在mRNA转录和后期的修饰过程中起到重要的作用,PCBP2是一个Polyc连接蛋白,具有蛋白翻译调节功能,这些基因在辐射致癌中尚无研究报道.     

正加速度重复暴露大鼠脑差异表达基因的筛选

目的 筛选大鼠经正加速度(Gosiliveacceleration， Gz)重复暴露后脑的差异表达基因，探讨 Gz重复暴露致脑损伤的分子机制。方法 应用抑制性消减杂交技术，构建高消减效率的 Gz重复暴露大鼠脑cDNA消减文库；用差异筛选技术筛选阳性克隆；用序列分析确定阳性克隆的性质；用RT—PCR证实阳性克隆的可靠性。结果 从消减库中获得70个阳性克隆；经差异筛选后，选取其中10个阳性克隆，序列分析表明，7个克隆与已知基因高度同源，3个为新的候选基因。RT—PCR证实了差异表达基因在 Gz重复暴露大鼠脑中高表达。结论 用抑制性消减杂交技术筛选发现的3个新的cDNA可能在 Gz脑损伤的病理过程中起重要作用。     

Development of gene microarray in screening differently expressed genes in keloid and normal-control skin

Background Keloid is an intricate lesion that is probably regulated by many genes. In this study, the authors used the technique of complementary DNA (cDNA) microarray to analyse abnormal gene expression in keloids and normal control skins.Methods The polymerase chain reaction (PCR) products of 8400 genes were spotted in an array on chemical-material-coated-glass plates. The DNAs were fixed on the glass plates. The total RNAs were isolated from freshly excised human keloid and normal control skins, and the mRNAs were then purified. The mRNA from both keloid and normal control skins were reversely transcribed to cDNAs,with the incorporation of fluorescent dUTP, for preparing the hybridisation probes. The mixed probes were then hybridised to the cDNA microarray. After thorough washing, the cDNA microarray was scanned for differing fluorescent signals from two types of tissues. Gene expression of tissue growth factor-β1 (TGF-β1) and of c-myc was detected with both RT-PCR and Northern blot hybridisation to confirm the effectiveness of cDNA microarray.Results Among the 8400 human genes, 402 were detected with different expression levels betweenkeloid and normal control skins. Two hundred and fifty genes, including TGF-β1 and c-myc, were upregulated and 152 genes were down-regulated. Higher expressions of TGF-β1 and c-myc in keloidwere also revealed using RT-PCR and Northern blot methods.Conclusion cDNA microarray analysis provides a powerful tool for investigating differential gene expression in keloid and normal control skins. Keloid is a complicated lesion with many genesin volved.     

甘草甜素诱导的大鼠肝星状细胞差异表达基因检测

目的:检测甘草甜素诱导的大鼠肝星状细胞的差异表达基因,为探讨甘草甜素抗肝纤维化的作用机制提供分子生物学依据.方法:大鼠肝星状细胞分2组培养,实验组在培养液中加入甘草甜素,终浓度达1.0 mmol/L:对照组不作处理.继续培养24 h,应用抑制性消减杂交技术构建甘草甜素诱导的肝星状细胞差异表达基因的cDNA文库,将杂交产物与pGEM-T载体连接,转化感受态DH5α,阳性克隆用PCR技术扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建了甘草甜素诱导的肝星状细胞cDNA消减文库.测序分析结果表明,在cDNA消减文库中包含3个铁蛋白重链基因的阳性克隆.结论:甘草甜素能诱导肝星状细胞铁蛋白重链的表达.调控铁蛋白重链基因的表达可能是甘草甜素抗肝纤维化作用的分子生物学机制之一.     

利用抑制性消减杂交技术筛选大鼠哮喘相关基因

目的:利用哮喘大鼠模型筛选与哮喘发病相关的差异性表达基因.方法:采用抑制性消减杂交技术,以哮喘大鼠肺组织总RNA为检验子,对照大鼠肺组织总RNA为驱赶子,将消减杂交获得的DNA片断与pGEM-T Easy Vector连接,构建cDNA文库后,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆.将获得的阳性克隆插入片段进行测序分析,测序结果与GenBank数据库中cDNA和EST序列进行相似性比对,获得差异性表达基因的信息.结果:扩增消减cDNA文库获得300余个白色克隆,随即挑选36个测序,除去重复序列,结果中含有已知的基因4 个,ESTs 2个及与任何序列无同源性的新基因片段3个.结论:成功构建了哮喘大鼠肺脏差异性表达基因的正向消减cDNA文库,筛选出数个与哮喘相关的差异表达基因.