组蛋白去乙酰化酶抑制剂MS-275提高宫颈癌SiHa细胞放射敏感性实验研究

【目的】探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂MS-275对人宫颈癌SiHa细胞放射敏感性的影响及其可能的机制。【方法】应用MS-275体外作用于人宫颈癌SiHa细胞,定量PCR方法检测NF-kB基因和PUMA基因mRNA的表达,Western blotting法检测细胞乙酰化组蛋白H4的表达,应用6MV直线加速器,分别以0、2、4、6、8 Gy不同剂量的X线照射细胞,流式细胞仪检测SiHa细胞凋亡率,克隆形成实验检测SiHa细胞的放射敏感性。【结果】人宫颈癌SiHa细胞经MS-275体外作用后,乙酰化组蛋白H4表达增加,并随MS-275剂量的增加而增加,同时细胞PUMA基因mRNA表达随MS-275剂量升高而增加,NF-κB基因mRNA表达随MS-275剂量增加而降低。与对照组相比,MS-275各组细胞凋亡率增高,并随MS-275剂量的增加而升高,SF2值降低。【结论】MS-275体外能提高人宫颈癌SiHa细胞对放射线损伤的敏感性;增加乙酰化组蛋白H4表达,下调NF-κB基因表达和上调PUMA基因表达是其可能的作用机制。     

组蛋白去乙酰化酶1基因沉默对人卵巢癌SKOV3细胞迁移及侵袭能力的影响

目的：观察组蛋白去乙酰化酶1（HDACl）基因沉默对人卵巢癌SKOV3细胞迁移及侵袭能力的影响.方法：体外合成针对HDAC1的小干扰RNA （siRNA）,利用脂质体转染入人卵巢癌SKOV3细胞;通过Western blot方法检测细胞内HDAC1蛋白和乙酰化组蛋白H4（Ac-H4）的表达,利用荧光定量PCR方法检测HDAC1、尿激酶型纤溶酶原激活因子（uPA）和尿激酶型纤溶酶原激活因子受体（uPAR）基因的mRNA表达;通过划痕实验检测细胞迁移能力,利用Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力.结果：经转染HDAC1基因siRNA后,卵巢癌SKOV3细胞HDAC1基因mRNA和蛋白表达水平均下调,细胞内组蛋白H4乙酰化水平增加;SKOV3细胞迁移速度降低,穿过Transwell滤膜的细胞数量减少;SKOV3细胞内uPA和uPAR基因mRNA表达也降低.结论：HDAC1基因沉默能够抑制人卵巢癌SKOV3细胞迁移和侵袭能力,机制可能与增加组蛋白乙酰化水平、抑制uPA和uPAR基因表达有关.     

DNA甲基化介导Id4在宫颈癌中的表观遗传沉默

目的:探讨宫颈癌中DNA结合抑制因子4(Id4)表达的启动子甲基化调控。方法:采用焦磷酸测序技术对17例散发性宫颈鳞状细胞癌及15例正常的宫颈组织标本进行Id4基因甲基化水平检测。实时荧光定量PCR检测组织和细胞中Id4表达水平。单独使用DNA甲基转移酶抑制剂(5Aza-dC)去甲基化处理宫颈癌细胞SiHa以及联合使用5Aza-dC和组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA)去甲基化处理SiHa后,检测Id4表达。结果:Id4甲基化水平在宫颈癌组织中显著高于正常宫颈组织[(65.0±24.7)%比(21.8±10.2)%,P<0.01]。在宫颈鳞状细胞癌组织和正常宫颈组织中,Id4的mRNA表达水平与其启动子甲基化水平呈负相关(Pearson test,r=-0.011,P<0.01)。单独使用5Aza-dC能使SiHa细胞中Id4的甲基化水平由98.23%降至50%左右,同时伴随Id4mRNA水平的显著提高(25倍),而单用TSA组甲基化水平及mRNA表达改变不明显。联合使用5Aza-dC和TSA时Id4甲基化水平的进一步下降(降至29.54%),及其mRNA表达水平的进一步升高(约35倍)。结论:Id4基因在宫颈癌中呈高甲基化状态,并介导Id4的表达沉默。组蛋白去乙酰化与DNA甲基化在Id4表观遗传沉默机制中起协同作用。Id4或可作为表观遗传治疗的作用靶点。     

核因子-κB在上颌窦鳞状细胞癌中的表达

目的探讨核因子-κB(NF-κB)在上颌窦鳞状细胞癌中的表达及其与主要临床指标间的关系.方法采用免疫组化SP法检测42例上颌窦鳞状细胞癌和20例正常上颌窦粘膜组织中NF-κB的表达情况.结果 20例正常上颌窦粘膜组织中NF-κB表达全部为阴性,42例上颌窦鳞状细胞癌中28例NF-κB表达上调.NF-κB的表达与肿瘤分期、淋巴结转移之间无明显相关性,而与组织分化程度显著相关,低分化上颌窦鳞状细胞癌NF-κB的表达较中、高度分化上颌窦鳞状细胞癌明显增高(P＜0.05).结论 NF-κB的表达在上颌窦鳞状细胞癌的发生发展中起一定作用,NF-κB可能成为上颌窦鳞状细胞癌治疗的新靶点.     

HDAC2 siRNA转染对人胰腺癌细胞增殖及凋亡的影响

［摘要］目的: 探讨RNA干扰沉默组蛋白去乙酰化酶2(histone deacetylase 2,HDAC2)基因表达对人胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法: 培养人胰腺癌PaTu8988细胞株,并将其随机分为5组:空白对照组,20 nmol／L HDAC2 siRNA阴性组,40 nmol／L HDAC2 siRNA阴性组,20 nmol／L HDAC2 siRNA组,40 nmol／L HDAC2 siRNA组。合成针对HDAC2基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),利用阳离子脂质体将HDAC2 siRNA瞬时转染人胰腺癌PaTu8988细胞,分别采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹法检测HDAC2基因及蛋白的表达;MTT比色法检测细胞的增殖率;流式细胞术测定细胞凋亡率。结果: 与空白对照组和阴性siRNA 组对比,HDAC2 siRNA组的HDAC2基因和蛋白的表达水平均明显下降(P均<0.05),细胞增殖率减慢(P<0.01),凋亡率明显升高(P<0.01)。结论: 采用RNA干扰沉默人胰腺癌细胞HDAC2基因表达,可抑制癌细胞增殖和诱导其凋亡。     

HPVE7介导HDAC抑制宫颈癌细胞MHC-Ⅰ基因转录的研究

目的探讨表达高危型人乳头瘤病毒(HPV)E7基因抑制宫颈癌细胞主要组织相容性抗原I(MCH-I)转录的机制。方法利用荧光素酶检测实验和染色质免疫沉淀试验(ChIP)确定MHC-I启动子中E7的作用位点;ChIP检测MHC-I启动子的乙酰化状态和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的结合;特异性siRNA干扰E7后,ChIP检测MCH-I启动子的乙酰化和HDAC结合的改变,流式细胞仪检测细胞表面MHC-I表达。结果 E7特异性结合在MHC-I启动子中的-184～-500bp区域;MHC-I启动子低乙酰化且HDAC结合在启动子上;E7干扰后MHC-I启动子高乙酰化,HDAC与启动子结合降低,细胞表面MHC-I表达上调。结论 E7通过募集HDAC到MHC-I启动子上,使启动子组蛋白去乙酰化,从而导致MHC-I转录抑制。     

siRNA沉默VEGF-C 基因对宫颈癌HeLa细胞的生物学特性影响

目的通过RNA干扰技术抑制宫颈癌细胞VEGF-C表达,探讨干扰后VEGF-C、NF-κB、bcl-2基因的表达。方法根据人VEGF-C mRNA编码序列,设计RNA干扰的靶点,并用脂质体转染人宫颈癌HeLa细胞,通过RT-PCR法观察转染后肿瘤细胞VEGF-C、NF-κB、bcl-2基因的变化。结果转染siRNA 24h、48h可以使HeLa细胞VEGF-C mRNA含量降低,在24h降低80.63%±0.24%(P<0.001);在48h降低38.9%±0.85%(P<0.01);NF-κB mRNA含量也分别降低,在24h降低37.55±2.76%(P<0.05);在48h降低30.5%±3.82%(P=0.056);bcl-2mRNA含量同时分别降低,在24h降低76.95%±1.91%,(P<0.01);在48h降低64.11%±2.96%,(P<0.05))。结论脂质体介导的VEGF-C siRNA转染HeLa细胞后,可以有效抑制VEGF-C的表达;可能通过下调转录因子NF-κB,抑制抗凋亡基因bcl-2的表达。     

RNAi抑制NF—KB基因增强肺癌细胞对TRAIL敏感性的研究

目的:探讨RNAi靶向沉默NF-κB基因对TRAIL诱导肺癌细胞凋亡的影响.方法:使用NF-κB p65 siRNA转染肺癌A549细胞48 h,实验分为空白对照、脂质体对照以及干扰实验3组.采用RT-PCR法测定肺癌A549细胞内NF-κB p65 mRNA的表达,MTT法检测siRNA转染前后TRAIL对A549细胞生长抑制作用的变化.结果:与空白对照和脂质体对照组相比,siRNA组具有明显抑制肺癌A549细胞NF-κB p65mRNA表达的作用(P<0.01).MTT实验表明,转染siRNA后TRAIL对A549细胞的生长抑制作用明显增强,但在同一浓度,转染NF-κB p65 siRNA的细胞与未转染组相比,细胞增殖活性明显下降(P<0.05).结论:应用RNAi技术可有效干扰NF-κB p65的表达,抑制肺癌A549细胞的增殖,并可增加肺癌细胞对TRAIL的敏感性.     

MCF-7/Adr细胞mdr-1基因启动子甲基化和组蛋白乙酰化状态与多药耐药的关系

目的：分析MCF-7/Adr及MCF-7细胞mdr-1基因启动子甲基化和组蛋白乙酰化状态,初步探讨乳腺癌多药耐药的表观遗传机制。 方法：用甲基化敏感PCR技术检测两个细胞系mdr-1基因启动子甲基化状态。实时定量PCR技术检测DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases,DNMTs) mRNA及组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases,HDACs) mRNA的表达。光密度值法检测组蛋白H3和H4乙酰化水平。 结果：MCF-7细胞mdr-1基因启动子呈现高甲基化,MCF-7/Adr细胞mdr-1基因启动子呈现低甲基化。与MCF-7细胞比较,MCF-7/Adr细胞DNMT1,DNMT3a及DNMT3b mRNA表达显著下降(P＜0.05)。MCF-7/Adr细胞组蛋白H3和H4乙酰化水平较MCF-7细胞明显升高(P＜0.01)。与MCF-7细胞比较,MCF-7/Adr细胞HDAC1,HDAC2,HDAC7及SIRT1 mRNA的表达显著下降(P＜0.01)。 结论：mdr-1基因启动子低甲基化、组蛋白H3和H4高乙酰化、DNMTs mRNA及HDACs mRNA低表达可能是介导MCF-7/Adr细胞MDR形成的重要表观遗传学因素。     

KiSS-1和NF-κB在食管鳞状细胞癌组织中的表达及临床病理意义

目的 探讨KiSS-1和NF-κB在食管鳞状细胞癌组织中的表达及临床病理意义.方法 应用免疫组织化学方法检测40例食管鳞状细胞癌和5例正常食管粘膜组织中KiSS-1和NF-κB的表达情况.结果 Kiss-1在食管鳞状细胞癌组织中表达降低,与淋巴结转移关系密切(P＜0.05);NF-κB的表达与病理组织分级、淋巴结转移有关(P<0.05);食管鳞状细胞癌中KiSS-1和NF-κB的表达呈负相关(r=-0.676,P＜0.05).结论 Ki s s-l基因的表达减低或者缺失与食管鳞状细胞癌的发生发展及浸润转移有关,Kiss-l基因可能通过抑制NF-κB从而发挥抑制食管癌转移的作用.     

组蛋白修饰对COPD大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞趋化因子表达的影响

目的探讨COPD大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)炎症因子表达是否与组蛋白修饰有关。方法熏烟法建立大鼠COPD模型。取大鼠肺组织进行病理观察,提取AECⅡ进行碱性磷酸酶染色鉴定和电镜鉴定;实时定量PCR检测AECⅡ三种趋化因子:单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、IL-8及巨噬细胞炎性蛋白2α(MIP-2α)的mRNA表达;Westernblot检测组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)蛋白表达;染色质免疫共沉淀(ChIP)检测趋化因子启动子区组蛋白H3、H4乙酰化和H4K9甲基化修饰情况。结果 COPD组IL-8、MCP-1、MIP-2αmRNA表达较正常对照组分别增加4.48倍、3.14倍、2.83倍;COPD组AECⅡ细胞HDAC2蛋白表达较正常对照组降低(0.25±0.15比0.66±0.15,P0.05),且HDAC2的下降程度与IL-8、MCP-1、MIP-2αmRNA表达增高程度呈负相关(r值分别为-0.960、-0.914、-0.928,P均0.05)。COPD组趋化因子基因启动子区H3、H4乙酰化水平较正常对照组均升高,H4K9甲基化水平则降低(P均0.05)。结论 COPD模型大鼠AECⅡ的IL-8、MCP-1、MIP-2α三种趋化因子基因表达增加,HDAC2介导的组蛋白修饰在COPD炎症反应中发挥重要作用。     

Survivin siRNA对肝癌细胞BEL-7402的增殖与对Survivin基因及蛋白表达的作用

目的:探讨小干扰RNA(siRNA)对BEL-7402细胞的生长抑制与生存素(Survivin)基因及蛋白表达的影响。方法:合成Survivin siRNA,以不同浓度转染BEL-7402细胞,MTT法测定细胞生长抑制率,RT-PCR、Western-Blot检测BEL-7402细胞Survivin mRNA及蛋白的表达差异。结果:BEL-7402细胞转染FAM荧光标记的siRNA后,细胞内有绿色荧光表达。分别以10、30、50nmol/LSurvivin siRNA转染细胞后,MTT测得的细胞生长抑制率分别为(38.80±1.71)%,(54.50±1.16)%,(66.79±1.10)%,RT-PCR测得的Survivin mRNA表达分别为0.42±0.02,0.28±0.01,0.12±0.01,Western-Blot测得Survivin蛋白表达分别为0.55±0.04,0.32±0.02,0.21±0.02,三项指标与空白对照组、阴性对照组、脂质体对照组比较有极显著性差异(P<0.01)。随着Survivin siRNA浓度的增加,细胞抑制率呈上升趋势,Survivin mRNA及Survivin蛋白的表达逐渐降低,呈浓度-效应关系。结论:Survivin siRNA能抑制BEL-7402细胞的增殖与Survivin基因和蛋白表达。     

脂质体瞬时转染siRNA抑制肾小管上皮细胞AngⅡ 1型受体表达

目的建立有效的脂质体瞬时转染法,转染小分子RNA（siRNA）,抑制人肾小管上皮细胞（human kidneytubular epithelial cells,HKC）血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）1型受体（AT1R）的表达。方法针对人AT1R mRNA135到156位点,由美国Ambion公司设计并合成AT1R siRNA序列,以脂质体法瞬时转染至HKC,利用RT-PCR及Western blot技术检测HKC内AT1R mRNA及蛋白表达。结果AT1R siRNA转染对人肾小管上皮细胞AT1R的抑制效果在48h达到最大抑制作用;转染后,HKC细胞AT1R mRNA表达下调（68.5±6.4）%,AT1R蛋白表达下调（80.7±5.3）%,与对照组比较存在显著性差异（P〈0.001）。使用AngⅡ刺激,特异性AT1R siRNA转染组AT1R表达明显下降,无转染及非特异性转染组AT1R表达升高。特异性AT1R siRNA转染HKC细胞后,其炎症因子单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）表达明显下降。结论本研究利用脂质体瞬时转染siRNA方法,成功抑制肾小管上皮细胞表达AT1R,为后续相关研究提供实验方法。     

混合游离脂肪酸对大鼠肺微血管内皮细胞Toll样受体4表达的影响及其介导的炎症反应机制

目的研究混合游离脂肪酸（FFA）对大鼠肺微血管内皮细胞（RRPMVECs）Toll样受体4（TLR4）的激活作用及其介导的链式炎症反应机制。方法以不同浓度的FFA处理体外培养的RPMVECs,Westernblotting检测TLR4蛋白的表达。用干扰小RNA（siRNA）转染体外培养的RPMVECs（TLR4 siRNA组和杂序siRNA组）,设立阴性对照组。分别用0．1mmol／LFFA、10ng／mL脂多糖（LPS）和5ng／mL肿瘤坏死因子-α（TNF-α）处理各组细胞,以未加药细胞作为相应的空白组。Real-TimePCR检测TLR4mRNA和NF-κB抑制蛋白激酶β（IKKβ）mRNA的表达,Westernblotting检测磷酸化核因子κB抑制因子（p-IκBα）和核因子κB（NF-κB）的表达,ELISA法检测细胞培养上清液中炎症因子白介素-1β（IL-1β）的表达。结果RPMVECs的TLR4蛋白相对表达量在0．1mmol／LFFA处理后显著增高（P〈0．05）,并随FFA浓度的升高而增加。在杂序siRNA和阴性对照组,TLR4mRNA的相对表达量在LPS和FFA处理后显著升高（P〈0．05）,TNF-α处理无明显变化;而在TLR4干扰组,3种处理后TLR4mRNA的表达均无显著变化。在杂序siRNA和阴性对照组,3种方式处理后RPMVECs的IKKβmRNA、p-IκBα及IL-1β的相对表达量均显著升高（P〈0．05）,而TLR4siRNA干扰抑制了其在FFA和LPS处理组的表达,但对TNF-α组无抑制作用。结论FFA通过TLR4／IKKβ／NF-κB信号通路介导RPMVECs的炎症反应。     

半乳糖凝集素3在宫颈癌转移中的作用

目的检测宫颈癌样本中半乳糖凝集素3（Gal-3）的表达水平,研究其在宫颈癌转移中的作用。方法选取2009年6月1日至2010年6月1日于广州市第一人民医院妇产科诊治的宫颈癌患者为研究对象。癌组织活体取材,结合病理切片及临床诊断,将患者分为正常宫颈组织组（n=8）,原位癌（CINⅢ）组（n=12）,鳞癌I期组（n=10）,鳞癌Ⅱ期组（n=9）。所取标本分别为正常对照宫颈组织和不同临床分期的宫颈癌组织标本。免疫印迹法检测Gal-3蛋白的表达情况。体外培养宫颈癌细胞株HeLa及SiHa细胞,转染siRNA（50nmol/L）抑制Gal-3表达后,采用MTT法、Transwell侵袭小室法观察其对宫颈癌细胞株增殖和侵袭的影响。结果随着宫颈癌临床分期升高,Gal-3蛋白表达水平随之增加,与正常宫颈组织组比较,CIN、鳞癌I期（S（I））、鳞癌Ⅱ期（S（Ⅱ））组Gal-3蛋白分别增加了（35.2±8.4）%、（97.6±18.2）%和（179.4±20.7）%,差异均有统计学意义（P〈0.05）。在培养的宫颈癌HeLa、SiHa细胞株上,与转染对照siRNA比较,转染Gal-3siRNA48h后可明显抑制Gal-3蛋白表达,抑制率分别为（81.6±4.7）%、（87.5±6.8）%。转染特异性siRNA48h后,以普通培养液（含10%胎牛血清）继续培养细胞24h,与对照组（转染非特异性siRNA组）比较,HeLa及SiHa细胞增殖率分别降低（42.4±6.4）%、（50.6±7.2）%,差异均有统计学意义（P〈0.01）,侵袭细胞数目分别降低（48.6±5.8）%、（52.4±8.3）%,差异均有统计学意义（P〈0.01）。结论 Gal-3蛋白表达与宫颈癌临床分期密切相关,Gal-3可能通过促宫颈癌增殖和侵袭能力,促进宫颈癌的恶性进展。     

阻断Smad3对转化生长因子β1诱导Ⅰ型胶原表达的影响

目的观察siRNA-Smad3对TGF-β1诱导的肌成纤维细胞（C2C12）分泌Ⅰ型胶原的影响。方法用不同浓度的TGF-β1（0、1、5和10ng/mL）干预C2C12细胞24h,200pmol/L siRNA-smad3转染C2C12细胞24h,用ELISA和RT-PCR方法测定Ⅰ型胶原蛋白和mRNA表达。结果0、1、5和10ng/mL TGF-β1干预C2C12细胞,Ⅰ型胶原蛋白（ng/mL）检测结果分别为（616±16）,（713±19）,（783±23）,（853±17）,Ⅰ型胶原mRNA表达（Ⅰ型胶原/β-actin光密度比值）分别为（0.93±0.08）,（1.83±0.17）,（2.50±0.29）,（2.94±0.14）,三组间相互比较P均〈0.01。200pmol/L siRNA-Smad3转染C2C12细胞24h后,用5ng/mL TGF-β1分别干预24h后检测Ⅰ型胶原蛋白：实验组、空白对照组、内对照组分别为（413±20）、（473±29）、（571±29）ng/mL;Ⅰ型胶原mRNA表达分别为（0.78±0.17）、（0.86±0.10）、（1.85±0.19）。内对照组表达增强（与实验组比较P〈0.05）。结论TGF-β1促进C2C12细胞Ⅰ型胶原合成与mRNA表达呈剂量依赖性;siRNA阻断Smad3表达,抑制了TGF-β1促进Ⅰ型胶原合成与mRNA表达的作用。     

益气活血复方含药血清对人脐静脉内皮细胞TLR4／NF—KB信号通路及TNF—a ICAM-1 mRNA表达的影响

目的：研究益气活血复方含药血清对脂多糖（LPS）诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）Toll样受体4（TLR4）／NF—KB及肿瘤坏死因子-a（TNF—a）、细胞间黏附分子（ICAM-1）mRNA表达的影响,探讨益气活血复方含药血清防治动脉粥样硬化（AS）的机制。方法：（1）选择新西兰大耳白兔20只,随机分为4组,即正常组、中药高浓度组、中药中浓度组、中药低浓度组,每组5只。以上各组白兔分别以生理盐水和高、中、低浓度益气活血复方连续灌胃7天。末次灌胃给药2h后,心脏采血,离心后分离血清。（2）体外培养人脐静脉内皮细胞,用LPS刺激后,分别加入高、中、低浓度益气活血复方含药血清干预24h,收集细胞,用荧光定量PCR方法测定TLR4、NF—KB、TNF—a及ICAM-1mRNA的表达。结果：用LPS刺激人脐静脉内皮细胞后,引起TLR4、NF-KB、TNF-a及ICAM-1 mRNA的高表达（与空白对照组比较P〈0．01）,用益气活血复方含药血清干预以后显著抑制TLR4、NF-KB、TNF-a及ICAM-1 mRNA的高表达（与模型组比较P〈0．01或P〈0．05）。结论：益气活血复方可阻断TLR4／NF—KB信号通路的高表达,同时抑制TNF—a及ICAM-1的表达,这可能是其发挥抗动脉粥样硬化作用的机制之一。