外源性神经节苷脂对神经干细胞增殖分化的作用

目的：探讨外源性神经节苷脂（GM1）对从大鼠分离培养的神经干细胞（NSCs）增殖及分化的作用。方法：①利用无血清培养技术从胎鼠大脑皮质和海马分离培养原代细胞，加血清诱导其分化。（④在NSCs培养基和DMEM／F12培养基中加入不同浓度的GM1，观察GM1对NSCs增殖和分化的作用。结果：①与不含GM1的NSCs培养基相比，在NSCs培养基中加入低浓度的GM1，NSCs的生长无明显改变，随着GM1浓度的增加，NSCs克隆球体积逐渐减小，细胞逐渐死亡；②在DMEM／F12培养基中单独加GM1而不加血清，NSCs克隆球均未见继续生长，也未见分化，而是迅速的死亡。结论：①在NSCs培养基中，低浓度（12．5μg／m1）GM1对NSCs的增殖无明显影响，但较高浓度的GM1对NSCs的增殖有抑制作用。②DMEM／F12培养基中单独加GM1，而不加血清和其他生长因子，既不能诱导NSCs分化，也不利于NSCs的继续生长。     

大鼠胚胎脑源性神经干细胞的分离培养和鉴定

目的:分离培养大鼠胚胎脑源性神经干细胞,并进行增殖分化鉴定。方法:实验于2005-06/12在中国科学技术大学生命科学学院周江宁研究室进行。①自孕14dWistar大鼠胚胎分离大脑皮质及皮质下组织,经机械吹打分离成单细胞后,利用无血清原代及传代培养方法,在添加重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人表皮生长因子和B27添加剂的DMEM/F12(1∶1)培养基中进行悬浮培养,获得具有克隆能力的细胞群;用有限稀释法,得到来源于同一细胞的亚细胞系克隆。②从培养基中撤除生长因子和B27添加剂,换成含体积分数为0.1的胎牛血清的DMEM/F12培养基,将培养的细胞球接种于预先铺有多聚赖氨酸盖玻片的培养皿,诱导分化。③以免疫荧光细胞化学技术,用神经干细胞的特异性单克隆抗体(巢蛋白)和增殖细胞单克隆抗体(5-溴脱氧尿苷嘧啶)鉴定克隆细胞,以鉴定神经干细胞的自我更新增殖能力。④以免疫荧光细胞化学技术,用神经细胞的特异性抗体(神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白、半乳糖脑苷脂)鉴定分化细胞,以鉴定神经干细胞的多向分化潜能。结果:①从胎鼠大脑皮质及皮质下分离的组织,经原代和传代培养均可形成细胞克隆,并具有增殖的能力,表达神经上皮干细胞蛋白抗原和增殖细胞抗原。②在血清诱导下,分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞3种神经细胞的特异性抗原。结论:运用上述方法分离培养的细胞具有自我更新和增殖能力,并具有多向分化潜能和具有神经干细胞的特异性抗原。     

大鼠胚胎脑源性神经干细胞的分离培养和鉴定

目的：分离培养大鼠胚胎脑源性神经千细胞，并进行增殖分化鉴定。 方法：实验于2005—06／12在中国科学技术大学生命科学学院周江宁研究室进行。①自孕14dWistar大鼠胚胎分离大脑皮质及皮质下组织，经机械吹打分离成单细胞后，利用无血清原代及传代培养方法，在添加重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人表皮生长因子和B27添加剂的DMEM／F12（1：1）培养基中进行悬浮培养，获得具有克隆能力的细胞群；用有限稀释法，得到来源于同一细胞的亚细胞系克隆。②从培养基中撤除生长因子和B27添加剂，换成含体积分数为0．1的胎牛血清的DMEM／F12培养基，将培养的细胞球接种于预先铺有多聚赖氨酸盖玻片的培养皿，诱导分化。③以免疫荧光细胞化学技术，用神经干细胞的特异性单克隆抗体（巢蛋白）和增殖细胞单克隆抗体（5一溴脱氧尿苷嘧啶）鉴定克隆细胞，以鉴定神经干细胞的自我更新增殖能力。④以免疫荧光细胞化学技术，用神经细胞的特异性抗体（神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白、半乳糖脑苷脂）鉴定分化细胞，以鉴定神经干细胞的多向分化潜能。 结果：①从胎鼠大脑皮质及皮质下分离的组织，经原代和传代培养均可形成细胞克隆，并具有增殖的能力，表达神经上皮干细胞蛋白抗原和增殖细胞抗原。②在血清诱导下，分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞3种神经细胞的特异性抗原。 结论：运用上述方法分离培养的细胞具有自我更新和增殖能力，并具有多向分化潜能和具有神经干细胞的特异性抗原。     

无血清条件下体外分离培养鼠胚胎脑组织神经干细胞

背景:神经干细胞的体外培养成功为治疗中枢神经系统疾病提供了新的思路,但神经干细胞的分化和功能修复机制尚不甚清楚.移植后的细胞能否与体内细胞结合以及建立起正常的神经系统突触联系急需解决.目的:在无血清条件下体外分离培养胚鼠神经干细胞,观察其生长及分化情况.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-03/2008-01在天津市环湖医院神经干细胞室完成.材料;孕14～16 d的SD大鼠,由北京维通利华实验动物中心提供.方法:取孕鼠胚胎的脑海马组织.通过机械分离和胰蛋白酶消化结合法体外分离培养神经干细胞,在含有碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子及B27的无血清DMEM/F12培养基中传代扩增.取原代培养7 d的神经干细胞,制备单细胞悬液,接种后加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液诱导3 d.主要观察指标:倒置显微镜下观察神经干细胞的增殖分化过程,并行免疫荧光染色鉴定.通过细胞免疫化学染色检测诱导分化后的细胞类犁.结果:分离培养的神经干细胞在无血清培养基中不断分裂增殖,8 d左右即可形成胞体透亮、折光性好的干细胞球,悬浮生长,免疫荧光染色巢蛋白呈阳性表达.神经干细胞球诱导5 d,免疫细胞化学染色后可见胶质纤维酸性蛋白及神经元特异性烯醇酶呈阳性表达的细胞.结论:体外无血清条件下,分离培养的神经干细胞生长状态良好,且具有自我更新和增殖能力.诱导后能够向神经元及星形胶质细胞方向分化.     

人胚胎脑皮质神经干细胞的体外分离及扩增特征

目的:观察从10￣12周胎龄人流产胚胎脑皮质分离、培养的神经干细胞的生长特性。方法:实验于2005-02/12在新桥医院神经外科实验室完成。实验对象为孕10￣12周流产的人胚胎脑皮质细胞,细胞的获取严格遵守医学伦理道德并得到医院许可。取胎龄10￣12周的流产胚胎皮质,吸管反复吹打机械分离制成单细胞悬液,使用DMEM/F12(1∶1)加B27的无血清培养基培养,同时加入碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子(均为20μg/L)以及白血病抑制因子(10μg/L)。连续传代培养,用有限稀释法观察神经干细胞的单细胞克隆情况。将部分经单细胞克隆扩增的细胞克隆种植于预先置有多聚赖氨酸涂布盖玻片的24孔培养板内,并加入新鲜培养基(体积分数为0.05的胎牛血清 DMEM/F12),采用免疫荧光细胞化学技术检测Nestin抗原和分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达情况。结果:①从人胚胎脑皮质分离得到的纯化的单个细胞可以增殖形成细胞克隆,即使在培养基中使用各种细胞因子而不使用胎牛血清,部分细胞团块也会贴壁。②经单细胞克隆方式扩增而来的细胞克隆在胎牛血清诱导分化及多聚赖氨酸辅助贴壁作用数小时后观察细胞已贴壁。③从皮质分离的细胞群保持着未分化状态,能够自我更新以及具有多向分化潜能,其生长需多种细胞因子的联合刺激。结论:从10￣12周胎龄人流产胚胎脑皮质分离的中枢神经系统的细胞具有自我更新能力和多向分化潜能,证实是神经干细胞。不论刺激因子及血清的有无,神经干细胞一旦贴壁就会启动其分化程序,而不再保持其干细胞特征,因此悬浮生长状态是神经干细胞体外培养生长的一种特性。     

无血清培养基体外分离培养人胶质瘤干细胞与鉴定

背景:最近有研究者采用神经干细胞的无血清培养基从脑肿瘤组织中培养出肿瘤干细胞.目的:探讨利用无血清培养基从原发胶质母细胞瘤组织中分离培养胶质瘤千细胞的可行性.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-08在山东省青岛市脑科研究所完成.材料:胶质瘤组织来自青岛大学医学院附属医院神经外科手术切除标本,DMEM/F12培养基、B27为GIBCO公司产品,碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子Peprotech公司产品.方法:无菌条件下取肿瘤深部无坏死囊变、来电凝组织,剪切消化成单细胞悬液后,加入含碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、B27添加剂的无血清DMEM/F12培养基,体外分离培养获得胶质瘤干细胞.待培养孔中细胞团数量增多、培养液刚刚变色时,吸取含有细胞团的培养液进行传代.取第3代胶质瘤十细胞,加入巢蛋白和CD133抗体行免疫荧光检测;加入含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM/F12培养基诱导5 d,行胶质纤维酸性蛋白免疫荧光染色观察分化情况.主要观察指标:原代与传代培养的胶质瘤干细胞形态及生长情况,胶质瘤干细胞巢蛋白、CD133的表达及其分化.结果:原代培养7-10 d可形成大小不一的细胞团,球形或近似球形,呈悬浮或半悬浮状态牛长.细胞形态均,折光性好:传代24 h后次代细胞团形成,细胞的大小,形态与原代无明显差别,连续传代5次后细胞团增殖活跃.第3代胶质瘤干细胞呈巢蛋白和CD133阳性表达,加入胎牛血清后细胞球贴壁分化,呈胶质纤维酸性蛋白阳性.结论:人脑胶质瘤组织中存在胶质瘤下细胞,在体外无血清条件下可保持未分化的悬浮状态;加入血清后贴壁分化呈胶质瘤细胞样或神经元样,符合于细胞的自我繁殖和多向分化特征.     

小鼠胚胎神经干细胞的体外培养及增强型绿色荧光蛋白基因转染研究

目的：探索小鼠胚胎神经干细胞（neural stem cells．NSCs）的体外培养，探讨NSCs作为基因靶细胞．以及增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）标记NSCs的可行性。方法：胚胎小鼠脑组织分离神经干细胞，无血清细胞培养，免疫细胞荧光染色技术鉴定。NucleofectorTM转染仪将增强型绿色荧光蛋白基因转导入NSCs，用G418筛选，在荧光显微镜下观察并挑选EGFP表达最强的克隆．并做免疫荧光鉴定及诱导分化细胞的鉴定。结果：从胚胎小鼠脑组织分离的细胞具有连续克隆能力。表达神经上皮干细胞蛋白，诱导分化后的细胞表达神经细胞和星形胶质细胞特异性的蛋白。增强型绿色荧光蛋白报告基因转染神经干细胞后能高效表达，且不影响其增殖、分化能力。结论：小鼠胚胎神经干细胞能够在体外适宜的条件下进行长期培养；神经干细胞可直接作为基因靶细胞；转染EGFP的神经干细胞表达稳定且对NSCs的增殖和分化无明显影响。     

新生大鼠海马区及室管膜下区神经干细胞的诱导分化：无血清培养条件下观察

背景:神经干细胞作为修复损伤神经组织的细胞源已引起学者的关注,如何有效的获取更多的神经干细胞逐渐成为重点解决的课题之一。目的:观察大鼠室管膜下区和海马回神经干细胞体外培养、传代和分化情况。设计:单一样本实验。单位:中山大学附属第三医院神经外科。材料:取出生后3dSD大鼠10只,雌雄不拘,由中山大学实验动物中心提供。巢蛋白抗体(兔抗大鼠)、神经微丝蛋白(NF-200)抗体(兔抗大鼠)、胶质纤维酸性蛋白抗体(小鼠抗大鼠)均购自Sigma公司。方法:实验于2006-09/12在中山大学基础医学院组织胚胎学实验室完成。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学要求。从新生大鼠海马、室管膜下区分离神经干细胞,采用DMEM/F12无血清悬浮的条件培养,同时在培养基中加入碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子代替血清中含有的分裂原,进行体外扩增培养、传代观察。主要观察指标:采用免疫荧光检测技术,通过检测神经干细胞表达的nestin、神经元细胞表达的神经微丝蛋白和星形胶质细胞表达的胶质纤维酸性蛋白,鉴定神经干细胞及其分化结果。结果:分离获取的细胞具有自我更新和增殖能力,原代及传代培养20代后,在倒置显微镜下仍保留典型的"细胞克隆球"特征,神经克隆球通过nestin免疫荧光染色,呈阳性反应。经诱导后,细胞克隆球细胞外迁贴壁生长,可分化为神经微丝蛋白阳性的神经元细胞和胶质纤维酸性蛋白阳性的星形胶质细胞。结论:实验分离培养出具有自我更新和增殖能力的神经干细胞,其可诱导分化为神经元样细胞和星形胶质细胞。     

不同剂量神经节苷脂对神经干细胞增殖和分化的影响

背景近年来研究表明神经节苷脂(gangliosides,GM-1)能够修复中枢神经系统中神经元的损伤.目的观察不同剂量神经节苷脂(GM-1)对神经干细胞增殖和分化的影响.设计完全随机对照的开放实验.地点与材料研究地点为郑州市第二人民医院脑外科和郑州大学医学生物工程研究所.材料为胎龄10周流产胚胎脑组织.方法与主要观察指标从人胚胎脑组织分离出神经干细胞,培养于含bFGF和B27的DMEM/F12细胞营养液中,实验组加入不同浓度的GM-1,用MTT比色分析法测定细胞增殖能力.用含3%血清的DMEM/F12营养液诱导细胞分化,每间隔6h于倒置相差显微镜下观察细胞分化情况.结果5 d,10 dMTT比色显示bFGF(20mg/L)+B27+DMEM/F12和GM-1(33.5mg/L)+B27+DMEM/F12两组间t检验,P值均＞0.05;GM-1(33.5mg/L)+B27+DMEM/F12与B27+DMEM/F12两组间t检验,P值均＜0.05;GM-1(0.335 mg/L)+B27+DMEM/F12,GM-1(3.35 mg/L)+B27+DMEM/F12与B27+DMEM/F12间t检验,P值均＞0.05.分化实验发现,接种6 h后,(3%)血清+DMEM/F12组神经球周边可见明显的细胞突起,呈放射状向周围伸出,而3个实验组和阴性对照组的细胞突起短且细小,随着培养时间的延长,各组的细胞突起均逐渐伸长,3个实验组分化能力低于对照组,与阴性对照组之间无明显差异.结论GM-1能够维持神经干细胞的原始神经状态,促进神经干细胞的增殖,对神经干细胞无明显的诱导分化作用.     

星形胶质细胞条件培养液体外诱导胎鼠室管膜前下区神经干细胞向多巴胺能神经元的分化

背景:在神经干细胞移植治疗神经系统退行性变及修复神经系统功能损伤过程中,有效的神经干细胞体外增殖与多巴胺能神经元的定向诱导分化尤为关键.目的:以星形胶质细胞条件培养液为诱导剂,观察胎鼠室管膜前下区神经干细胞体外向多巴胺能神经元的分化.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2006-12/2007-08在解放军第三军医大学新桥医院实验中心完成.材料:清洁级新生2d龄KM小鼠15只,孕16d Wistar大鼠40只,均由解放军第三军医大学实验动物中心提供.方法:采用差速黏附法和振荡分离法纯化培养KM小鼠星形胶质细胞,收集传至第3代、培养5d的星形胶质细胞条件培养液,-20℃冻存待用.体外分离Wistar胎鼠室管膜前下区神经干细胞,加入含B27和碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12无血清培养基进行原代培养,传至第3代后按0.5×108L-1密度接种,设立2组:对照组单纯加入含体积分数0.1为胎生血清的DMEM/F12培养基予以自然分化,实验组加入已制备的星形胶质细胞条件培养液进行诱导分化.主要观察指标:免疫细胞化学染色鉴定胎鼠室管膜前下区神经干细胞,流式细胞仪检测胎鼠室管膜前下区神经干细胞向多巴胺能神经元分化的阳性率.结果:培养的神经球细胞袁达巢蛋白,可分化为神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白阳性细胞.诱导分化7d后,实验组可见酪氨酸羟化酶阳性细胞,胞体呈圆形或椭圆形,酪氨酸羟化酶位于胞质及突起中;对照组酪氨酸羟化酶阳性细胞在数量、细胞成熟形态上均未达到实验组水平.实验组酪氨酸羟化酶阳性细胞分化率明显高于对照组(t=35.296,P<0.01).结论:在体外星形胶质细胞条件培养液可显著促进胎鼠室管膜前下区神经干细胞向多巴胺能神经元分化.     

新生小鼠海马源性神经干细胞体外分离培养细胞群的增殖分化

目的：从新生小鼠脑海马部取材进行大量细胞克隆，对体外分离培养的神经干细胞进行鉴定．检测所分离细胞群的增殖分化特性。 方法：实验于2005-07／10在解放军第三军医大学解剖学教研室实验完成。选用清洁级昆明种新生24h内小鼠12只，利用神经于细胞条件培养基和单细胞克隆技术，从小鼠脑海马分离并体外培养神经干细胞。连续传代20代后，以免疫荧光细胞化学方法及免疫组织化学方法检测克隆细胞Nestin、BrdU、NeuN、NF-200、MOSP及胶质原纤维酸性蛋白的表达。 结果：实验选用昆明种新生24h内小鼠12只，全部进入结果分析。①神经干细胞的培养及分化：神经干细胞以神经球的方式悬浮生长。无明显突起，原代细胞接种后于第3天开始形成神经球。组成细胞球的细胞圆润饱满，活力状态好，绝大多数在1d内贴壁，并从细胞球边缘伸出突起，加入含血清的培养基后克隆球48h内即可见到明显的细胞分化，克隆球周围有细胞移出，7d后原有的细胞球消失。②神经干细胞的鉴定结果：原代克隆及其亚克隆行Nestin免疫荧光染色。证实克隆内细胞均为Nestin抗原阳性；细胞经BrdU标记后，行BrdU免疫细胞化学染色，部分细胞呈阳性。③神经干细胞的分化鉴定：对诱导分化的细胞分别行NeuN、NF-200、MOSP及胶质原纤维酸性蛋白免疫细胞化学检测，表达均呈阳性。 结论：成功分离并获得新生小鼠脑海马神经于细胞，该细胞可连续传代，具备多向分化潜能。     

海马神经干细胞不同传代方法的比较

背景:体外培养神经干细胞,在悬浮培养时由于自身增殖特性会形成球,传代时将会面临如何将细胞球分离成单细胞的问题。目的:寻求理想的大鼠海马神经干细胞传代方法,以获得大量可增生的神经干细胞以供研究。方法:分离新生1dSD大鼠海马神经干细胞,原代培养至五六天时,分别用机械吹打法、胰蛋白酶、TrypLE和Accutase消化法分离神经干细胞球。之后每7d传代1次,连续传代3次。分别于每次传代后第1天和传代后第4天计数活细胞比例和细胞球数目,实验重复3次。结果与结论:神经干细胞球经3种酶消化后获得的均是单细胞;经机械吹打后既有单个细胞,也有小细胞球分布于培养液中。在酶消化法中,Accutase消化法传代后神经干细胞的活细胞比例明显高于胰蛋白酶消化(P<0.01)和TrypLE消化法(P<0.05)。同时,Accutase消化法传代后新形成的细胞球数目也较其余各组多(P<0.01)。提示在实验条件下,Accutase消化法能够较好地将神经干细胞球分离成存活率较高、能快速形成新的克隆球的单个细胞,是较为理想的神经干细胞分离传代方法。     

神经细胞黏附分子NB-3在调节胚胎来源神经干细胞分化和迁移中的作用

目的:探讨NB3基因在调节小鼠探讨神经干细胞分化和迁移中的作用。方法:分离培养来源于E14.5dNB3缺失和野生型小鼠海马的神经前体细胞,通过免疫荧光染色方法检测NB3缺失对神经干细胞(NSCs)诱导分化后神经元分化和迁移的影响。结果:①NB3在体外培养的神经干细胞中表达,并和干细胞的标记分子Nestin共定位;②NB3基因缺失后对神经干细胞的体外增殖能力无明显影响,但在用1%胎牛血清诱导分化后,NB3缺失的神经干细胞产生更多的神经元;③与对照组相比,从NB3基因缺失的神经干细胞分化而来的神经元表现为相互聚集而不向神经球外迁移。结论:NB3在神经元的再生和迁移中具有一定的调节作用。     

胎鼠侧脑室神经干细胞的培养及鉴定

目的：从胎鼠侧脑室中分离神经干细胞,并对其进行培养及鉴定。方法采用无血清培养基分离培养来自胎鼠侧脑室的神经干细胞,并诱导其分化,用免疫荧光细胞化学的方法检测BrdU、Nestin和SOX2以及神经元标记物TuJ1的表达。结果胎鼠的侧脑室能够分离培养出具有增殖能力的神经球,呈Nestin和SOX2阳性,分化诱导后产生TuJ1阳性的神经元。结论胎鼠的侧脑室能够分离培养出神经干细胞,并能够在体外增殖、诱导分化为神经元。     

表皮生长因子培养条件下脑源性神经生长因子诱导大鼠海马神经干细胞向神经元分化的最佳浓度

背景：目前神经干细胞的定向分化是神经干细胞研究的热点。脑源性神经生长因子作为诱导剂可否诱导神经干细胞分化为神经元。目的：观察在表皮生长因子培养条件下,不同质量浓度脑源性神经生长因子对成年大鼠海马神经干细胞向神经元分化的影响。设计：对比实验。单位：中国医科大学人体解剖学教研室。材料：实验于2007-08在中国医科大学神经解剖研究室完成。提取成年SD大鼠海马神经干细胞,无血清技术培养。清洁级成年SD大鼠3只,体质量200-250g,由中国医科大学实验动物部提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。实验过程中应用的表皮生长因子、脑源性神经生长因子均由R＆D公司提供。方法：①无菌条件下分离大鼠海马组织,用含碱性成纤维生长因子、表皮生长因子、B27的无血清细胞培养技术体外培养神经干细胞。②取第4代神经干细胞,利用有限稀释法进行单细胞克隆培养。将单细胞克隆传代后的克隆球细胞进行神经干细胞的鉴定。克隆球细胞行巢蛋白免疫细胞化学染色,诱导分化1周后进行神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白免疫细胞化学染色。③单细胞克隆的神经干细胞脑源性神经生长因子诱导分化实验,根据脑源性神经生长因子质量浓度不同分成0μg/L浓度的对照组和50、100、150、200μg/L浓度的4个实验组,各组的培养液中均加入表皮生长因子,诱导分化1周后进行神经元特异性烯醇化酶免疫细胞化学染色,检测神经干细胞向神经元分化情况。主要观察指标：神经干细胞分化为神经元的比例。结果：①神经干细胞免疫细胞化学染色结果显示,单细胞克隆培养后克隆球细胞表达巢蛋白,诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白均呈阳性表达。②50,100μg/L组脑源性神经生长因子组神经干细胞分化为神经元比例明显高于对照组、150,200μg/L脑源性神经生长因子组组（t=2.502-5.025,P〈0.05）;50,100μg/L脑源性神经生长因子组之间神经干细胞分化为神经元的比例差异不显著（P〉0.05）;对照组、150,200μg/L组3组间神经干细胞分化为神经元比例差异不显著（P〉0.05）结论：在20μg/L表皮生长因子培养条件下,脑源性神经生长因子促使神经干细胞向神经元分化的较佳质量浓度为50μg/L。     

GFP转基因胚胎大鼠神经干细胞生物学特性研究

目的 体外分离、培养、鉴定绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）转基因胚胎大鼠神经干细胞，研究其体外活性与生物学性状，为在体分化示踪研究奠定基础。方法 采用机械分离，无血清传代培养法从GFP胚胎大鼠海马获得神经干细胞，免疫荧光和免疫细胞化学法染色进行体外神经干细胞性质和分化活性鉴定，并利用流式细胞计数法行纯度检测。结果 成功从GFP胎鼠海马获得神经干细胞，体外生长情况与活性良好，能分化成神经元和胶质细胞；体外连续传代3次后绝大部分细胞Nestin表达阳性，且分化后细胞的GFP表达不受影响。结论 GFP胚胎大鼠来源神经干细胞具有普通胎鼠NSCs相同的自我更新和多向分化潜能，且能稳定表达GFP，因此它可以成为示踪神经干细胞研究的有效工具细胞。     

缺血缺氧性脑损伤后神经干细胞和脑组织再生的研究

目的：研究缺血缺氧性脑损伤（hypoxic-ischemic brain injure,HIBI）后神经干细胞（neural stem cells,NSCs）的增殖、迁移和分化及脑组织的再生能力。方法：大鼠缺血缺氧性脑损伤后腹腔注射5-溴脱氧尿苷（BrdU）,损伤后在各观察点,动物麻醉后取脑,石蜡包埋,冠状切片,行HE染色和免疫组织化学染色。结果：缺血缺氧性脑损伤后1周,海马颗粒细胞层下区（Subgranular zone,SGZ）和脑室管膜下区（subventricular zone,SVZ）可见小蓝紫色核的细胞;损伤后2周,海马可见具有毛刷状轴/树突层的神经元再生,大脑皮层未见神经元再生。缺血缺氧性脑损伤后,SGZ和SVZ的背外侧角及外侧壁处均可见BrdU＋细胞、Nestin＋细胞和BrdU＋-Nestin＋双阳性细胞;并可见这些细胞沿胼胝体向外迁移。结论：缺血缺氧性脑损伤后,海马颗粒细胞层下区和脑室管膜下区的神经干细胞增殖,脑室管膜下区的神经干细胞沿胼胝体向外迁移,海马神经元可完全再生,大脑皮层神经元未见再生。