小鼠白蛋白基因的特异性调控及其在转基因动物中的应用

白蛋白是肝脏表达的血清蛋白 ,其组织特异性表达的基础在于白蛋白基因存在特异性调控序列如启动子、增强子 ,可与肝脏富含的转录因子如 HNF1、C/ EBP及 e H- TF等特异性结合 ,刺激基因高效转录。自 1 989年 Izban克隆并提交了小鼠白蛋白调控序列 ,其在转基因动物及基因治疗中得到了广泛的应用 ,实现了基因转移的器官靶向性。近年的研究发现 ,与其他启动子如 CMV、PGK相比 ,白蛋白启动子引导的基因转移引起的免疫反应较轻 ,并可克服因启动子失活而导致的转基因沉默现象 ,相信随着转基因技术的不断发展 ,其将有越来越广泛的应用     

组织特异性转录调控序列及在肿瘤基因治疗研究中的应用

肿瘤特征性蛋白“持家基因”转录调控序列是肿瘤细胞内特异活化的基因调控序列，可使外源基因在肿瘤细胞中特征性地表达。本文综述了普通启动子及组织特异性启动子的基本结构与功能，转录调控因子对启动子的调节以及目前在肿瘤基因治疗研究领域中应用价值的人酪氨酸酶（Tyr）启动子，甲胎蛋白（AFP）启动子，癌胚抗原（CEA）启动子等的研究进展。     

肝脏特异性表达载体Kbpala/Alb-ATP7B 的构建及表达

目的：构建小鼠白蛋白启动子引导下携带野 生及常见突变型Arg778Leu、His1069Gln的人ATP7B cDNA的肝脏特异 性表达载体Kbpala/Alb-ATP7B，并检测其表达情况。方法:定点突变法获取人群中常见的Arg778Leu及His1069Gln两种ATP7B突变体，定向克隆将小鼠白蛋白启动子Alb序列及野生和突变的ATP7B cDNA依次亚克隆至转基因载体Kbpala上，得到可在肝脏特异性表达的正常及突变型人 ATP7B的转基因载体Kbpala/Alb-ATP7B。将其 短暂转染BRL细胞及BHK细胞，通过Western blotting检测其蛋白表达情况。结果:经酶切鉴定及定点测序证实，转基因载体Kbpala/Alb-ATP7B 构建成功；Western blotting显示仅在肝脏细胞实现表达。结论:带 有人类ATP7B cDNA的野生及常见致病突变型的转基因载体Kbpala/Alb -ATP7B构建成功并在肝脏细胞特异性表达。     

组织特异性转录调控序列及在肿瘤基因治疗研究中的应用

肿瘤特征性蛋白“持家基因”转录调控序列是肿瘤细胞内特异活化的基因调控离列，可使外源基因在肿瘤细胞中特征性地表达。本文综述了普通启动子及组织特异性启动子的基本结构与洋调控因子对启动子的调节以及目前在肿瘤基因治疗研究领域中的应用价值的人酪氨酸酶（Ｔｙｒ）启动了，甲胎蛋白（ＡＦＰ）启动子，癌胚抗原（ＣＥＡ）启动子等的研究进展。     

小鼠白蛋白基因启动子的克隆及其在不同细胞系中转录活性的检测

目的：对比小鼠白蛋白（mouse albumin promoter, ALB）启动子调控下的增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP）在不同细胞系中的转录活性。方法：以小鼠全血基因组DNA为模板,聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）扩增ALB启动子序列,克隆至pEGFP-1中,构建重组体pALB-EGFP;在Lipofectamine介导下将pALB-EGFP、pEGFP-N1转染人胎肝细胞L02、人宫颈癌细胞HeLa、人结肠癌细胞SW480、人胰腺癌细胞Bxpc-3;荧光显微镜和流式细胞仪对各转染细胞中EGFP的表达进行检测。结果：pALB-EGFP构建成功;L02转染pALB-EGFP 72 h后,ALB启动子可起始EGFP的表达,转录活性为人巨细胞病毒（cytomegalovirus,CMV）启动子的1/4,其它转染细胞的ALB不能起始EGFP的转录;稳定筛选后,ALB的转录活性达到与CMV相当的水平。结论：构建的重组载体在肝脏来源细胞中具有较高的转录活性, 为建立肝脏特异性表达目的基因的转基因小鼠模型奠定了基础。     

肝细胞特异性杀伤载体的构建和应用

目的间充质干细胞(MSC)有重要的免疫调节和组织再生作用,但其治疗肝损伤的机制尚不完全清楚,既可能通过旁分泌因子调节炎症,也可直接转分化为肝细胞。为明确这两种机制,拟构建巨细胞病毒(CMV)启动子驱动的膜定位绿色荧光蛋白(GFP)与白蛋白启动子调控的PE40毒素的共表达质粒,以期杀伤转染MSC中向肝细胞转分化的细胞。方法用PCR获得GFP以及DLL1(Delta-like 1)跨膜区基因片段,融合成膜定位GFP基因并插入pFlag-CMV-1载体。将白蛋白基因启动子和PE40基因片段插入已构建好的膜定位GFP序列下游,构建真核表达载体,荧光显微镜检测GFP的表达。应用可表达白蛋白的人正常肝脏细胞检测该载体对肝细胞的杀伤。结果成功构建肝细胞特异性杀伤载体,该载体转染后对正常肝脏细胞具有杀伤作用,提示该载体可用于探索MSC治疗肝损伤的机制。结论成功构建能特异性杀伤肝细胞的载体。     

神经组织特异性启动子的研究方法和进展

基因表达调控的机理是分子生物学研究的热点和前沿。而启动子的调控在转录环节中又占有十分重要的地位。因此,研究启动子的功能序列对于基因表达调控机制的研究具有十分重要的意义。在基因工程和基因治疗技术蓬勃发展的今天,启动子对外源基因的表达水平影响很大,是基因工程和基因治疗表达载体的一个重要元件。要使克隆的基因能够在目的细胞中表达,启动子最好是超强的组织特异性启动子。将外源基因有效的导入神经细胞并使其靶向、高效和长期稳定的表达是目前基因治疗神经系统疾病的主要靶点。随着研究的深入,越来越多的组织特异性启动子已被用于调控目的基因在靶细胞或靶组织中的表达,成为基因治疗研究领域的热点之一。现综述目前常用的几种中枢神经系统组织特异性启动子在基因治疗中的应用及其研究进展。     

肝癌靶向性超抗原表达载体的构建与鉴定

目的：设计并构建受AFP基因顺式作用元件调控，并经减毒处理的肝癌特异性超抗原表达载体。方法：用新设计的引物作PCR扩增截短的AFP基因启动子和增强子、linker-CD80tm和SEA（D227A）。将上述片段与逆转录病毒载体pLXSN的多克隆位点连接，构建成为AFP基因顺式作用元件调控的肝癌特异性减毒超抗原表达载体[pLXSN SEA(D227A)-Linker-CD80tm]，并用软件对其开放读框进行分析。结果：成功克隆了截短的AFP基因启动子、增强子、linker-CD80tm和SEA（D227A）。将上述序列连接到逆转录病毒载体pLXSN的多克隆位点，酶切鉴定和DNA序列分析无误。结论：AFP基因转录启动元件修饰的SEA表达载体，在基因转录水平定量、定向、特异性调控强有力的细胞和体液免疫活化剂（SEA），为下一步将其作为基因疫苗治疗肝癌奠定了基础。     

一例ABO血型系统B抗原减弱表达的分子机制

目的 研究1例B抗原减弱献血者的血清学特性和抗原减弱的分子机制.方法 应用单克隆抗体检测献血者红细胞ABO血型抗原,标准A、B、O红细胞检测其血清中的ABO抗体,并检测其血清转移酶活性.采用聚合酶链反应技术扩增ABO基因全部外显子序列和5′端非编码区序列并进行测序分析,应用逆转录-PCR和克隆测序技术分析献血者ABO cDNA转录剪接情况,采用重亚硫酸盐转化直接测序法分析ABO基因启动子区CpG岛甲基化水平.结果 献血者血清学表现为B抗原明显减弱,血清中无抗-B抗体,B转移酶活性降低.基因型为B101/O01,全部外显子序列和拼接接受位点碱基无任何突变.5′端非编码区序列多态性符合B101/O01的特征,启动子、增强子、负调控序列和微卫星重复序列未发现异常.献血者存在ABO基因全长cDNA转录本,未发现新的转录剪接体.与正常对照标本比较,在启动子区CpG岛内发现启动子附近有多个特异性半甲基化位点.结论 启动子区CpG岛中的甲基化位点可能是引起B抗原弱表达的原因.     

逆转录病毒介导的肿瘤坏死因子肝癌特异性基因治疗实验研究

为探讨肿瘤坏死因子基因对肝癌的治疗作用，分别构建ＳＶ４０早期启动子和白蛋白增强子／启动子调控小鼠肿瘤坏死因子基因的逆转录病毒载体ＭＮＳＴ和ＭＮＡＴ，以及ＳＶ４０早期启动子和人甲胎蛋白增强子／ＳＶ４０启动子调控的逆转录病毒载体ＬＴＳＮ和ＬＴＡＳＮ。构建物导入ＰＡ３１７细胞中包装成重组病毒，感染肿瘤细胞，证明白蛋白增强子／启动子和甲胎蛋白增强子均能使肿瘤坏死因子基因在肝癌细胞中高效特异表达。ＭＮＡＴ病毒和ＰＡ３１７／ＭＮＡＴ产病毒细胞ｉｎｖｉｖｏ法基因治疗有特异抗肝癌效果。提示组织特征蛋白“持家基因”转录调控序列在肿瘤组织特异性免疫基因治疗研究中有重要意义。     

人LAIR-1/CD305基因启动子的生物信息学分析

目的:研究人LAIR-1/CD305启动子及其5′上游调控序列。方法:通过检索NCBI中的人类基因组数据库,获得LAIR-1的转录本序列及翻译起始位点上游2500bp的序列。利用Promoter2.0等软件预测LAIR-1的启动子序列,然后利用MatInspector等软件对启动子序列的转录因子结合位点和启动子功能模块进行预测。结果:LAIR-1基因的核心启动子区位于翻译起始密码子上游的600～200bp区域内。在转录调控区发现了一些重要的转录因子结合位点,并预测到13种启动子功能模块。结论:LAIR-1基因的表达可能受到多种转录因子和5′端上游调控序列的调控。     

四环素诱导的基因表达系统研究进展

诱导性基因袁达系统可以从时间上调控基因的表达,是基因功能研究的重要工具之一,其中,四环素诱导的基因表达系统是应用最广泛的一种。在此基础上相继建立了双向启动子调控的转基因表达系统、与Cre／loxP系统结合的诱导性条件性基因敲除系统以及四环素控制的转录沉默系统（tTS）,它们在研究哺乳动物基因的功能及表达调控方面发挥了重要作用。本文就四环素诱导的基因表达系统的原理、改进及应用简要作一综述。     

SPA基因启动子的克隆及转录靶向活性分析

目的：克隆大鼠肺表面活性蛋白A（SPA）基因启动子并构建该启动子的荧光报告系统,探讨该启动子的活性及转录靶向性，为进一步研究SPA 基因的表达调控机制和探讨靶向性基因治疗奠定基础。方法:①从GenBank中获取大鼠SPA 基因序列，对其上游基因组序列进行计算机生物信息学分析，推断其上游序列约163bp的区域具有启动子功能。②利用PCR技术扩增SPA 基因上游启动子序列,将其亚克隆入pGL3-basic 中,构建pGL3-SPA 质粒，将其亚克隆于pGL3-control 中，构建pGL3-SPA-enhancer 质粒。③将构建pGL3-SPA质粒、pGL3-SPA-enhancer 质粒、pGL3-control质粒和pGL3-basic 质粒分别与内参质粒pRL-TK共转染入A549细胞和H441细胞, 用双荧光素酶报告系统检测该质粒在两种细胞中的荧光素酶活性表达。 结果:酶切及测序结果均证实成功克隆了SPA基因启动子序列,并已将该序列正确插入到荧光素酶报告基因系列载体中。重组的pGL3-SPA-enhancer 质粒、pGL3-SPA质粒转染H441 细胞后可以检测到荧光素酶的高表达。结论:成功构建了含有SPA 基因启动子序列的荧光素酶基因报告系统,证实了它在高表达SPA蛋白的细胞中有较高的转录活性， 为下一步研究SPA 基因功能及其转录调控以及探讨基因治疗的靶向性奠定了基础。     

Tet基因表达调控系统及其应用

 基因治疗中导入基因表达时间和水平的调控极其重要。哺乳动物细胞中用到的诱导型载体主要与启动子有关，如热休克蛋白（Hsp）启动子可在高温下被诱导，还有重金属、糖皮质激素诱导的启动子等，但这些系统均存在着诱导表达不具备特异性、系统处于关闭状态时表达有遗漏以及诱导剂本身具有毒性会对细胞造成损伤等缺陷。如果设置一种导入基因的“开关”，能调控基因的表达，则有望大幅度提高基因治疗在临床应用的安全性。1992 年，Gossen 和 Bujard^[1]首次成功地利用原核基因调控元件构建了真核细胞基因表达调控系统——四环素基因表达调控系统（Tet 系统），该系统能通过在培养基中加入或者去除四环素或其衍生物（如强力霉素）诱导或抑制所感兴趣基因的表达，故被广泛应用于基因表达调控、蛋白质功能和基因功能研究以及基因治疗研究中。本文就近年来 Tet 系统的研究进展等做一综述。 1 Tet 系统概述 1.1 Tet 系统作用原理 大肠杆菌转座子 Tn10 中 Tet 阻遏因子（TetR）负性调节四环素抗性操纵子，TetR 与四环素有很高的亲和性，在无四环素时，TetR 与 Tet 操纵因子序列（TetO）结合而阻断四环素抗性基因的表达；当四环素存在时，TetR 对 TetO 的阻遏解除，转录启动，从而调控基因的表达。....     

白细胞介素6基因表达的转录和转录后调控

ＩＬ—６基因启动子上有许多顺式调控序列，已经鉴定出ＮＦ－ｋＢ、ＮＦ－ＩＬ６、糖皮质激素受体等反式调节因子也作用于启动子上相应的调控序列。许多诱导剂通过其可诱导的反式调节因子作用于ＩＬ－６启动子，或选择性控制ＩＬ－６ｍＲＮＡ的稳定性从而实现转录和转录后水平的基因调控。     

AP-1在基因转录调控中的研究进展

AP- 1是一类二聚体的转录调控因子 ,其作用范围十分广泛 ,在基因转录的调控中有重要作用。 AP- 1对基因转录调控的作用是精细和复杂的 :首先 ,AP- 1家族各成员可以通过亮氨酸拉链形成同源或异源二聚体 ,它们之间的不同比例就包含着不同的调控信息 ;其次 ,AP- 1可与其他蛋白因子协同作用共同决定 AP- 1发挥功能的特异性 ;最后 ,AP- 1序列结合的选择性低 ,因此 AP- 1可以结合在很多基因的不同启动子上对其转录进行调控 ,因而作用范围十分广泛。 AP- 1对基因的转录调控也是多层次的 :如多因子协同作用 ,以及细胞间对话均通过信号传导途经来实现     

CaMK Ⅱα基因启动子的克隆和神经细胞特异性Cre表达载体的构建

目的克隆和鉴定CaMKⅡα基因启动子序列，构建神经细胞特异性Cre重组酶的真核表达载体。方法采用高保真PCR方法分步扩增CaMKⅡα基因5′端8．1kb的调控区DNA片段，该片段包括了CaMKⅡα基因5′端调控区的所有序列。经克隆和部分序列测定后，依次与pCre—IRES—EGFP质粒框架连接，构建载体。结果克隆的CaMKⅡα基因5′端侧翼区酶切图谱与公布的C57BL/6J小鼠相应序列的酶切位点相一致，其中文献报道的富含顺式调控元件的序列与公布的小鼠序列完全相同。CaMKⅡα基因启动子正确地连接于Cre基因的5′端，构建了目标载体。结论这一载体的构建为建立前脑神经细胞特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠奠定了基础，有助于神经系统相关疾病的研究。     

转移基因体内表达的时空特异调控

转移基因体内表达的时空特异调控黄长晖，傅继梁转基因小鼠作为一种在活体内研究特定基因功能的有用工具在发育遗传学、免疫学和医学遗传学等生命科学领域的应用愈来愈广泛，关于转移至体内的外源基因（简称转移基因）在特定组织或器官中的特异性表达，以及发育过程中特定...