胃癌组织原代培养技术的改进

胃癌组织原代培养可为研究胃癌细胞的分化、形态及功能异常、浸润性、转移性、遗传特征及临床用药提供一种简单而优良的实验模型。胃癌组织原代培养的工作，国外在60年代末已有尝试，但培养的成功率较低。本文是对原有的胃癌组织原代培养的体系及某些操作技术予以改进，建立起一套较完善的培养方法。为将来的研究工作打下基础。     

胃癌肿瘤组织原代培养法及其影响因素

原代培养已用于身体各器官来源的肿瘤细胞培养,如胃癌细胞、肝癌细胞及人白血病细胞等。培养方法主要包括组织块培养、酶消化培养法、物理机械法等。近几年来,关于胃肠道肿瘤细胞原代培养的报道较多,特别鉴于消化道肿瘤日趋常见,其肿瘤细胞本身的研究也成为热点,更是难点。本文就文献报道的消化道肿瘤细胞原代培养方法研究进展及在培养过程中常见的影响因素进行总结分析,以便在消化道肿瘤细胞原代培养研究中正确应用。     

胃癌组织中P-糖蛋白、肺耐药蛋白与化疗敏感性的相关性分析

目的:探讨P-糖蛋白(P-gp)、肺耐药蛋白(LRP)在胃癌组织中的表达及对体外培养胃癌原代细胞化疗药物敏感性的影响。方法:用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测胃癌组织中P-gp和LRP的编码基因mdr1和lrp的表达,用四氮唑蓝(MTT)快速比色法检测抗癌药物对胃癌原代细胞的IC50值。结果:与正常胃组织相比,mdr1和lrp在胃癌组织中的表达明显增加(P<0.01),两者之间mRNA表达量无相关性(P>0.05),但均与胃癌耐药密切相关(P<0.01)。结论:mdr1、lrp在胃癌组织中的高表达与肿瘤耐药密切相关,可作为肿瘤化疗时药物取舍的参考。     

胃癌组织的原代培养及细胞外基质和凝集素受体

应用倒置显微镜,HE和Masson’s染色,上皮膜抗原(EMA)和癌胚抗原(CEA)免疫组化染色及透射电镜等方法对胃癌组织原代培养的上皮细胞加以鉴定,应用免疫酶SP法和凝集素亲和组化染色对原代培养的胃癌细胞及4例胃癌细胞株进行初步研究。结果显示:原代培养的胃癌细胞从第3天起呈铺石样生长,细胞为多边形或三角形,细胞核圆且大,核仁明显。Masson’s染色阴性,EMA和CEA阳性,电镜观察可见到细胞内有多量粘液颗粒,粒溶现象,细胞间有紧密连接和桥粒样结构,并构成小腺腔,证实培     

大肠癌等组织原代培养的初步体会

为探索肠癌患者对各种治疗的反应,采用大肠癌组织块,短期原代培养是一种可行的实验手段。本室自1982年6月～1983年4月对大肠癌27例,胃癌6例,乳癌4例共37例实体瘤进行了体外原代培养。现将培养方法及结果简要报告如下。     

阿霉素杀伤原代胃癌细胞效应与P-糖蛋白和GST-π表达的关系

目的 评价阿霉素(DOX)对原代胃癌细胞的体内外杀伤效应及诱导细胞凋亡能力，同时研究上述效应与胃癌组织P-糖蛋白和谷胱甘肽S转移酶表达的关系。方法 将39例分离纯化后的人新鲜胃癌细胞，分别暴露于不同浓度的DOX溶液。用台盼蓝染色和MTT法检测经化疗药物作用后肿瘤细胞活力及代谢活性的变化；另用TdT法和正常免疫小鼠肾包膜种植法(SRC法)分别检测DOX体外促凋亡效应及体内抑瘤率：同时用SABC免疫组化法检测胃癌组织中GST-π和P—gp表达情况。结果 经阿霉素作用后，体外培养的原代胃癌细胞出现不同程度的形态学改变、代谢活性下降及细胞凋亡。不同个体肿瘤细胞对阿霉素的敏感性不同，血浆峰浓度下，低分化胃癌与高分化胃癌的平均抑制率分别为30．98％及27．42％。10倍血药浓度下阿霉素对肿瘤细胞的抑制率高于单倍浓度(41．81％vs29．86％，P=0．046)。阿霉素诱导原代胃癌细胞凋亡的平均凋亡率为19．86％，还能明显抑制体内移植瘤的生长。39例胃癌标本GST-π和P—gp的表达阳性率分别为66．67％(26／39)和58．97％(23／39)，前者表达阳性者与ADM耐药性无明显相关，而后者表达阳性者对ADM显示了较强的体外耐药性。结论 阿霉素可能通过包括诱导细胞凋亡在内的多种途径杀伤原代胃癌细胞，并呈现明显的剂量依赖性。P-gp表达检测结合MTT体外药敏试验有助于预测DOX化疗效果。     

人胃癌原代细胞培养方法的探讨

目的探讨一种经济、易行的人胃癌原代细胞培养的方法。方法培养瓶瓶底用鼠尾胶原包被,放置经过处理的1mm×1mm×1mm大小的人胃癌组织块数个,加入适量培养液使组织块底部刚好没入液体内,24小时换液一次,至大量肿瘤细胞培养出来。结果肿瘤细胞在2天￣3天后从组织块内爬出,呈半贴壁生长,并开始大量生长,蔓延至整个瓶底。结论利用经济易行的方法对人胃癌新鲜标本进行原代细胞培养,可以得到存活的肿瘤细胞。     

乳浆大戟抑制原代人胃癌多药耐药细胞增殖和诱导凋亡研究

目的:研究乳浆大戟抑制原代培养多药耐药人胃癌细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用。方法:制备人胃癌多药耐药原代培养细胞,用不同稀释度的乳浆大戟提取液处理人胃癌多药耐药原代培养细胞,MTT实验观察细胞生长抑制现象,吖啶橙染色荧光显微镜观察凋亡细胞的核形态改变并测定凋亡指数,流式细胞术检测细胞凋亡率;以不加乳浆大戟提取液的细胞作对照。结果:乳浆大戟对人胃癌多药耐药原代培养细胞有增殖抑制作用,该作用有时间和浓度依赖性。乳浆大戟处理后的人胃癌多药耐药原代培养细胞,荧光显微镜下观察可见细胞核固缩、染色不均匀和核碎片等细胞凋亡的形态学改变,凋亡形态显示的凋亡指数和流式细胞术显示的凋亡率均明显上升,均有时间和浓度依赖性;以上作用与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论:乳浆大戟提取液具有抑制人胃癌多药耐药原代培养细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用。     

原代培养建立哈萨克族食管癌细胞系的研究

目的：探讨应用原代培养技术建立哈萨克族食管癌细胞系。方法：取手术切除的哈萨克族食管癌癌组织标本6例，进行原代培养，并纯化。结果：建立了食管癌细胞体外培养方法及其相关技术与条件，培养出1例哈萨克族食管癌原代细胞。结论：新鲜癌组织、适宜的胎牛血清浓度及上皮细胞纯化是建立食管癌细胞系的关键性条件。     

人胃癌SGC7901/VCR裸鼠移植瘤模型的建立及耐药性检测

目的建立人胃癌SGC7901/VCR裸鼠移植瘤模型,并检测其多药耐药性,为进行肿瘤多药耐药逆转剂的筛选和体内实验研究奠定基础。方法采用皮下接种法建立裸鼠移植瘤模型;观察裸鼠生长状况;移植瘤生长情况;进行瘤重及瘤体积比较;移植瘤P-gp耐药蛋白表达;原代培养细胞,检测移植瘤模型多药耐药性。结果人胃癌SGC7901/VCR裸鼠移植瘤组织病理学检查为低分化腺癌,移植瘤组织原代细胞培养后,P-gp表达强阳性+++,具有多药耐药性,模型建立成功。结论成功建立了人胃癌SGC7901/VCR裸鼠多药耐药移植瘤模型,为胃癌耐药研究提供了较理想的动物模型。     

P-糖蛋白、多药耐药相关蛋白在胃癌的表达与化疗敏感性的相关性研究

目的：探讨胃癌组织中P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gP）、多药耐药相关蛋白（muhidrug resistance-associated protein,MRP）的表达及对胃癌原代细胞培养体外化疗药物敏感性的影响。方法：应用免疫组化法检测P-gP及MRP在48例胃癌及癌旁组织的表达,同时通过胃癌原代细胞培养MTT药敏试验,检测胃癌对7种临床常用化疗药物的敏感性及耐药性,进一步分析药敏试验结果与P-gp、MRP表达的相关性。结果：在48例胃癌中,P-gP及MRP阳性率分别为41．7％、29．2％,共同表达率为25．0％。癌旁组织与癌组织的P-gP、MRP阳性表达率无显著差异。在顺铂（DDP）、丝裂霉素（MMC）、阿霉素（ADM）、鬼臼乙叉甙（VP-16）、5-氟尿嘧啶（5-FU）、羟基喜树碱（HCVF）、甲氨蝶呤（MTX）中,ADM、VP-16、HCVF耐药组P-gP、MRP阳性表达及共表达率较敏感组显著升高。结论：胃癌组织P-gp、MRP表达可导致胃癌原发性耐药。P-gP、MRP介导的MDR是ADM、VP-16、HCPT耐药的重要因素．     

三磷酸腺苷法肿瘤药敏检测与胃癌个体化化疗的临床研究

目的采用三磷酸腺苷生物荧光法（ATP-TCA）对胃癌组织标本进行肿瘤药敏检测，为胃癌的个体化化疗选择提供依据。方法42例胃癌新鲜标本行肿瘤细胞分离，原代培养后用ATP-TCA技术对5种6组化疗药物进行检测。结果所有标本均顺利完成检测，可评估率为100％。不同胃癌患者对同一种化疗药物的敏感度显著不同，差异有高度统计学意义（P〈0．01）；不同胃癌患者对不同药物的敏感程度也不同，差异亦有高度统计学意义（P〈0．01）。结论ATP-TCA可为胃癌的临床个体化化疗提供重要的指导作用。。     

血管内皮和平滑肌细胞联合培养构建组织工程化血管的方法

目的：探讨组织工程血管种子细胞原代培养、传代扩增、鉴定的方法，为组织工程血管的构建提供理想的种子细胞。方法：无菌条件下取正常产妇分娩的脐带动静脉，ROSS法（即组织贴块法）原代培养混合血管细胞。倒置相差显微镜、免疫组化法对细胞进行鉴定。结果：倒置显微镜显示原代细胞及经传代培养后的细胞，呈现内皮样细胞、平滑肌样细胞混合生长的特征。免疫组化法检测示内皮细胞Ⅷ因子、平滑肌细胞α-肌动蛋白呈阳性反应。细胞经3次～5次传代，数量可增殖达到8×10^6—10×10^6。结论：使用组织贴块法原代培养可获得内皮细胞、平滑肌细胞混合体，细胞经体外联合培养、传代可以达到组织工程血管种子细胞所需的数量。     

一种简便人绒毛滋养细胞体外原代培养方法的建立

目的 探索一种简便、实用的原代人早孕滋养细胞培养方法。方法 原代组织块法培养人早孕绒毛滋养细胞，Ficoll离心及差速贴壁法进行纯化，CK-7及Vimentin检测细胞纯度。结果 所得人早孕滋养细胞纯度高达95％。结论 组织块法培养，Ficoll离心及差速贴壁法纯化是一种较有效的人早孕绒毛滋养细胞培养方法。     

一种改良的小鼠原代肝细胞培养方法

为寻求一种简易、价廉的原代小鼠肝细胞培养方法 ,采用非灌注法、冰浴操作处理肝组织块及改良低血清培养基进行了原代鼠肝组织块和鼠肝细胞单层培养。通过光镜观察细胞形态、电镜观察超微结构及检测培养上清白蛋白水平证实培养细胞为肝细胞。持续培养结果显示原代培养第 6～ 12 d左右为肝细胞功能最佳观察和实验阶段。     

人骨髓间充质干细胞体外培养及生物特性的观察

目的：观察人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs)在体外培养的生物学特性和作为组织工程的种子细胞的可能性。方法：将人骨髓MSCs自骨髓中分离、纯化和培养，观察原代和传代培养的增殖及生长特征。结果：原代培养及传代培养显示，在体外培养条件下人骨髓MSCS有活跃的增殖能力。结论：体外获得的人骨髓MSCs的生物年龄较为年轻，可以为组织工程的进一步研究提供种子细胞。     

顺铂杀伤原代胃癌细胞效应与P-糖蛋白和谷胱甘肽S转移酶表达的关系

目的：评价顺铂(CDDP)对原代胃癌细胞的体外杀伤效应，及其与胃癌组织P-糖蛋白和谷胱甘肽S转移酶表达的关系。方法：采用纯化后的人新鲜胃癌细胞，用台盼蓝染色法和MTT法检测经顺铂作用后细胞活力及代谢活性的变化，用TdT法检测顺铂体外促凋亡效应；同时用SABC免疫组化法检测GST-π和P-gp表达，以研究其间的关系。结果：经顺铂作用后，体外培养的胃癌细胞出现明显的形态学改变和代谢活性的下降；不同个体肿瘤细胞对顺铂敏感性不同，低分化胃癌细胞较高分化者更敏感(41．25％vs33.23％)。经顺铂作用后，肿瘤细胞凋亡率增加，为33．21％。39例胃癌标本GST-π和P-gp的表达阳性率分别为66．67％和58.97％，前者表达阳性者对CDDP显示了较强的体外耐药性，而后者高表达与CDDP体外耐药性无关。结论：顺铂可能通过包括诱导凋亡在内的多种途径杀伤原代胃癌细胞，尤对低分化者显示了明显的肿瘤杀伤效应。GST-π高表达可能影响CDDP对胃癌细胞的杀伤效应。     

兔膀胱移行上皮种子细胞的培养及扩增

目的 对膀胱移行上皮细胞进行原代及传代培养，探讨用于膀胱组织工程研究的移行上皮种子细胞的培养方法。方法 采用组织块培养法，将获取的移行上皮组织小块在添加附加成分的无血清F12培养基进行培养，观察培养细胞的形态及生长增殖情况，并对传代培养的细胞进行免疫组化染色鉴定。结果 原代移行上皮组织培养约9-10d时细胞可达90％的汇合，传代培养的移行上皮细胞生长稳定期较长，细胞至5—6代时生长状态仍然良好。免疫组化染色显示培养细胞为移行上皮细胞。结论 采用组织块培养法能成功地原代培养兔膀胱移行上皮细胞，在添加附加成分的F12培养基中移行上皮细胞能够稳定地传代培养，表明该法可为膀胱组织工程的研究提供一定数量活性良好的移行上皮细胞。     

白缘yang的原代细胞培养

对长江上游水系的冷水性野生白缘yang进行人工养殖，分别取肝脏、肾脏、尾鳍等组织在1640培养基中进行组织原代培养。经优化实验条件后，肝脏和肾脏组织的原代细胞培养获得成功。     

胃癌化疗体外药敏试验研究(附88例分析)

目的检测目前常用化疗药物对体外培养的原代胃癌细胞的敏感性.方法用改良MTT法对88例胃癌患者的新鲜标本进行体外肿瘤细胞原代培养和化疗药物敏感性检测,并对其结果进行比较.结果试验成功率为94.3%,以细胞抑制率30%为判断标准的14种化疗药物中,5-FU、MMC、PYM、VP-16和DDP具有较高的敏感性（P＜0.05）.以上5种药物之间比较,其敏感性差异无显著意义（P＞0.05）;肿瘤分化程度的高低与肿瘤药敏无明显关系.结论体外胃癌细胞原代培养及化疗药物敏感试验对指导临床医生选择敏感化疗药物开展个体化化疗具有指导作用.