弓形虫ROP2-SAG1重组复合蛋白及其重组质粒的免疫效应

目的研究弓形虫棒状体蛋白2(ROP2)和膜表面蛋白1(SAG1)重组复合抗原(ROP2-SAG1)的核酸和蛋白两种疫苗的免疫效应。方法 60只雌性BALB/c小鼠随机均分为4组(每组15只),即rROP2-SAG1蛋白组、无菌生理盐水组、pcROP2-SAG1质粒组和pcDNA3.1质粒组,rROP2-SAG1组以2.5μgrROP2-SAG1重组蛋白与等体积佐剂乳化后,背部皮下多点免疫小鼠;无菌生理盐水组以等体积无菌生理盐水替代重组蛋白,首次免疫使用福氏完全佐剂,其余使用福氏不完全佐剂。pcROP2-SAG1组和pcDNA3.1组分别以pcROP2-SAG1和空质粒pcDNA3.1腿部肌肉注射免疫,剂量为100μg/次;以上各组小鼠共免疫3次,每次间隔2周。采用间接ELISA方法检测免疫后25、45和70d小鼠血清中特异性IgG抗体,及末次免疫后2周小鼠血清特异性IgG1和IgG2a抗体。用CCK-8细胞增殖法检测小鼠脾细胞增殖,间接ELISA法检测小鼠脾细胞培养上清液中γ干扰素(IFN-γ)和白介素2(IL-2)表达水平。结果 rROP2-SAG1组小鼠血清特异性IgG抗体水平随着免疫时间的延长持续升高,pcROP2-SAG1质粒组抗体则随着免疫时间的延长相对稳定。末次免疫后2周,rROP2-SAG1组小鼠血清IgG1抗体水平(1.538±0.183)显著高于IgG2a(0.618±0.122)(P0.05),而pcROP2-SAG1组IgG1抗体水平(1.107±0.137)与IgG2a(0.830±0.185)间的差异无统计学意义(P0.05)。以特异性抗原rROP2-SAG1为刺激物时,rROP2-SAG1组小鼠脾细胞受特异性抗原刺激的增殖效果(A450值=0.348±0.042)显著高于pcROP2-SAG1组(0.123±0.018)(P0.05)。rROP2-SAG1组小鼠脾细胞培养上清液中IFN-γ含量[(149.37±30.51)pg/ml]、IL-2含量[38.58±9.10)pg/ml],分别与pcROP2-SAG1组IFN-γ[(138.58l±29.92)pg/ml]、IL-2[37.47l±9.26)pg/ml]比较,差异均无统计学意义(P0.05)。结论 ROP2-SAG1重组复合蛋白诱导的抗体水平、脾细胞增值效应显著高于重组质粒pcROP2-SAG1。     

大肠埃希菌肠毒素B亚基对弓形虫速殖子SAG1-ROP2复合基因免疫效果的影响

目的研究大肠埃希菌不耐热肠毒素B亚基(LTB)对弓形虫速殖子SAG1-ROP2复合基因免疫效果的影响。方法构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-SAG1-ROP2和pEASY-E1-LTB。BALB/c小鼠88只,随机均分为4组,分别用PBS(A组)、pcDNA3.1空质粒(B组)、pcDNA3.1-SAG1-ROP2质粒(C组),以及pcDNA3.1-SAG1-ROP2质粒和pEASY-E1-LTB质粒(D组)进行滴鼻免疫,每种质粒20μg/(只·次)。每组小鼠随机抽取15只,每周免疫1次,共4次,末次免疫后2周,测定其血清IgG和IgA抗体水平,气管和小肠黏膜冲洗液分泌型IgA(sIgA)水平,以及脾细胞培养上清中γ干扰素(IFN-γ)和白细胞介素4(IL-4)水平;每组中余7只小鼠,每周免疫1次,共3次,末次免疫后4周,弓形虫速殖子腹腔接种感染(1×103/鼠),观察比较各组生存时间。结果成功构建pEASY-E1-LTB重组表达质粒。D组小鼠血清IgG(0.626±0.100)和IgA抗体水平(1.086±0.138),气管和小肠黏膜冲洗液sIgA水平(0.886±0.164),以及细胞因子IFN-γ[(2017±266)pg/ml]和IL-4水平[(203±31)pg/ml]均显著高于其他各组(均P0.05)。感染弓形虫速殖子后,A、B、C和D组小鼠的生存时间中位数分别为3、4、6和10d,D组的生存时间长于其他各组(均P0.05)。结论LTB能明显增强弓形虫速殖子SAG1-ROP2复合基因的免疫效果。     

黄芪对弓形虫wx2b2a表位疫苗免疫小鼠后抗急性弓形虫感染的免疫调节作用北大核心CSCD

目的探讨黄芪对弓形虫wx2b2a表位疫苗免疫小鼠后抗急性弓形虫感染的免疫保护作用。方法将小鼠随机分成pcDNA3-W2b2a组、pcDNA3-W2b2a+黄芪治疗组、pcDNA3+黄芪治疗组、黄芪治疗组、pcDNA3及生理盐水对照组。将弓形虫pcDNA3-W2b2a肌注免疫pcDNA3-W2b2a组、pcDNA3-W2b2a+黄芪治疗组小鼠3次,末次免疫后4周,每组小鼠腹腔注射102个速殖子,感染后2d起,pcDNA3-W2b2a+黄芪治疗组、pcDNA3+黄芪治疗组及黄芪治疗组小鼠给予黄芪75mg/d灌胃治疗,连续用药7d,用ELISA法测定免疫前、末次免疫后4周、感染后6d小鼠血清IgG水平及免疫前、末次免疫后2周、感染后4、6、8d小鼠IFN-γ、IL-18水平,并观察弓形虫感染后小鼠的生存时间。结果 pcDNA3-W2b2a免疫小鼠后血清IgG抗体水平均高于其它组(P<0.05),末次免疫后4周,感染后第6dpcDNA3-W2b2a、pcDNA3-W2b2a+黄芪治疗组小鼠特异性IgG抗体水平无显著性差异(P>0.05);末次免疫后2周、感染后4d、6d、8dpcDNA3-W2b2a+黄芪治疗组小鼠血清IFN-γ水平分别高于其它组(P<0.05);感染后各组小鼠血清IL-18水平持续上升,但感染后8d,黄芪治疗后小鼠血清IL-18水平显著低于pcDNA3和生理盐水对照组(P<0.05);小鼠RH株速殖子感染后,pcDNA3-W2b2a+黄芪治疗组小鼠存活时间明显长于pcDNA3-W2b2a组、pcDNA3+黄芪治疗组及黄芪治疗组(P<0.05)。结论黄芪可增强弓形虫wx2b2a表位疫苗免疫小鼠后抗急性弓形虫感染的免疫调节作用。     

多房棘球绦虫elp基因核酸疫苗诱生免疫应答的实验研究

目的观察多房棘球绦虫elp基因核酸疫苗免疫BALB/c小鼠引起的体液和细胞免疫应答。方法30只BALB/c小鼠随机分成3组:Ⅰ组,肌注空质粒(pcDNA3.1)100μg/鼠;Ⅱ组,肌注多房棘球绦虫elp基因真核表达重组质粒(pcD-ELP)100μg/鼠;NS组,肌注等体积生理盐水。每2周免疫1次,共3次。ELISA方法检测免疫后不同时间产生的特异性IgG1,IgG2a和IgG 2 b水平。双抗体夹心ELISA法检测免疫鼠脾脏单个核细胞(PMNC)在受到特异抗原刺激后,产生IL-4I、L-12和IFN-γ的能力,3H-TdR掺入法检测脾淋巴细胞的增值能力。结果首次免疫后4周,Ⅱ组小鼠血清可检测到特异性IgG1I、gG2a和IgG2b抗体,随免疫时间和免疫次数的增加3种特异性抗体的OD值逐渐增高,实验结束时(首次免疫后7周)3种特异性抗体OD值均最高。Ⅰ组和Ⅱ组小鼠脾PMNC培养上清中IFN-γ浓度分别为50 pg/ml和55 pg/ml,受特异抗原刺激后分别为44 pg/ml和101.5 pg/ml。NS组IFN-γ及各组IL-4和IL-12均未检出。Ⅰ组和Ⅱ组小鼠脾淋巴细胞增殖能力增高,其淋巴细胞CPM值分别为NS组的85倍和123倍,受到特异抗原或刀豆素刺激其淋巴细胞增殖更明显。结论多房棘球绦虫elp基因核酸疫苗可刺激BALB/c小鼠同时产生很强的细胞免疫和体液免疫应答。     

日本血吸虫多价DNA疫苗免疫保护作用的研究

目的研究日本血吸虫多价DNA疫苗诱导BALB/c小鼠的免疫保护作用.方法65只BALB/c雌性小鼠随机分为5组,各组小鼠分别肌肉注射纯化的质粒DNA pcDNA3.1(对照组)、pcDNA3.1-TPI(TPI)、pcDNA3.1-(CDR3)6[(CDR3)6]、pcDNA3.1-TPI-linker-(CDR3)6(TLC)和pcDNA3.1-(CDR3)6-linker-TPI(CLT),每鼠100μg.每隔2周加强免疫1次,共3次.末次免疫后4周每鼠经腹部皮肤攻击感染(45±1)条日本血吸虫尾蚴,45 d后剖杀,计数成虫及肝脏虫卵数.首次免疫前2天及感染前2天经尾静脉采血检测IgG抗体水平、抗体亚类IgG1、IgG2a.末次免疫后2周取小鼠脾脏制备单个脾细胞,检测细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ的水平.结果TPI、TLC组和CLT组小鼠血清都检测到特异性IgG抗体,抗体亚类IgG2a/IgG1的比值分别为1.71、2.71和4.70,而其他两组则未检测到特异性IgG抗体;TPI、TLC组和CLT组小鼠的IL-2、IFN-γ较对照组均有不同程度的升高,IL-4则无明显差异.多价DNA疫苗TLC组和CLT组减虫率分别达到37.30%、39.09%,减卵率分别为41.61%、49.54%,均显著高于TPI组和(CDR3)6组(P均＜0.05).结论多价DNA疫苗相对于单价DNA疫苗能诱导小鼠产生较高的免疫保护作用,且诱导宿主产生较高的以Th1为主的免疫应答.     

免疫刺激序列增强日本血吸虫DNA疫苗的免疫保护作用

目的　探讨免疫刺激序列在日本血吸虫Mr 23 000膜蛋白 (SjC23)DNA疫苗诱导BALB/c小鼠抗血吸虫感染中的作用。　方法　将SjC23基因片段克隆到增加了免疫刺激序列的真核表达质粒 pcDNA3.1-CpG中,构建pcDNA3.1-SjC23/CpG。 40只雌性BALB/c小鼠随机分为 4组 ,① pcDNA3.1对照组 ;②pcDNA3.1-SjC23组 ;③ pcDNA3.1-CpG组 ;④ pcDNA3.1-SjC23/CpG组。每鼠经两侧股四头肌注射质粒DNA共100 μg ,隔 2周加强免疫 1次 ,共 3次。末次免疫后 4周经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴 45条 /鼠 ,45d后计数成虫及肝脏虫卵数。首次免疫前和感染前 2d分别经尾静脉采血 ,检测IgG及IgG1、IgG2a。末次免疫后 3周取小鼠脾细胞 ,检测经伴刀豆球蛋白和SjC23重组蛋白刺激后小鼠白细胞介素 2 (IL-2 )、白细胞介素 4(IL-4)和γ干扰素 (IFN-γ)。用51Cr释放法检测经SjC23重组蛋白刺激后脾细胞对小鼠淋巴瘤细胞的杀伤作用。　结果　②组和④组减虫率分别为 2 8.1%和 3 5.1% ,减卵率分别为 2 1.6%和 2 6.5 %。④组减虫率显著高于②组 (P <0.0 5 )。这两组均检测到特异性IgG ,IgG2a/IgG1比值分别为 10.1和 12.2。脾细胞经伴刀豆球蛋白和SjC23重组蛋白刺激后的IL-2水平 ,②组较①组、④组较③组均有升高。②组脾细胞对靶细胞的杀伤活性为9.7%, ④组为40.0%。 结论 疫苗载体中增加免疫刺激序列，可提高SjC23 DNA 疫苗在BALB/c小鼠中诱导产生的免疫保护作用。     

猪囊尾蚴病重组DNA疫苗pcDNA 3.1-TSO45W在小鼠体内诱导的体液免疫效应

目的观察基于六钩蚴期的猪囊尾蚴病基因疫苗TSO45W诱导的小鼠体液免疫应答。方法碱裂解法大量制备重组质粒pcDNA3.1-TSO45W及对照质粒pcDNA3.1。将45只雌性昆明小鼠(4~6周)随机分为3组,每组15只。A组(生理盐水组):每只小鼠肌肉注射生理盐水100μl;B组(空质粒pcDNA3.1对照组):每只小鼠肌肉注射空质粒100μg;C组(重组质粒pcDNA3.1-TSO45W组):每只小鼠肌肉注射重组质粒100μg。分别于免疫后2、4、6、8、10周以ELISA方法检测小鼠血清免疫球蛋白IgG,IgM及IgA含量。结果 pcDNA3.1-TSO45-4B免疫组小鼠血清IgG、IgM、IgA均于第4周开始升高,分别为(17.36±1.85)μg/ml、(9.25±1.78)μg/ml和(9.41±0.88)μg/ml,并分别于第8、第6、第8周达到最高,含量分别为(24.26±2.52)μg/ml、(10.69±0.52)μg/ml和(11.22±1.23)μg/ml,与空质粒对照组(B组)和生理盐水对照组(A组)比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论猪囊尾蚴保护性抗原TSO45WDNA疫苗能在小鼠体内诱导体液免疫效应。     

CpG免疫刺激序列增强日本血吸虫TPIDNA疫苗免疫保护作用的研究

目的研究CpG免疫刺激序列对日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶DNA疫苗诱导BALB/c小鼠免疫保护的增强作用.方法设计合成一对含6个免疫刺激序列的寡脱氧核苷酸,克隆到真核表达载体pcDNA3.1第5314碱基Ssp I酶切位点,改建为pcDNA3.1-CpG.再将SjCTPIDNA片段克隆到pcDNA3.1-CpG的多克隆位点区,构建为pcDNA3.1-TPI/CpG.56只BALB/c雌性小鼠随机分为4组,各组小鼠分别肌肉注射pcDNA3.1、pcDNA3.1-TPI、pcDNA3.1-CpG、pcD-NA3.1-CpG/TPI质粒DNA,每鼠100 μg.每隔2周加强免疫1次,共3次.末次免疫后4周每鼠经腹部皮肤攻击感染(45士1)条日本血吸虫尾蚴,45 d后剖杀,计数成虫及肝脏虫卵数.首次免疫前2d及攻击感染前2 d经尾静脉采血检测抗体水平、抗体亚类IgG1、IgG2a.末次免疫后2周制备脾细胞,检测细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ的水平.结果 pcDNA3.1-TPI组和pcDNA3.1-TPI/CpG组小鼠血清都检测到特异性IgG抗体,抗体亚类IgG2./IgG1的比值分别为1.76和2.67,而其他两组则未检测到特异性IgG抗体;pcDNA3.1-TPI组和pcDNA3.1-TPI/CpG组小鼠的IL-2、IFN-γ较对照组均有不同程度的升高,IL-4无明显差异;pcDNA3.1-TPI组和pcDNA3.1-TPI/CpG组分别获得了25.98%和34.54%的减虫率,后者高于前者,并分别获得了27.68%和29.50%的减卵率.结论 CpG免疫刺激序列似能增强DNA疫苗在小鼠体内诱导的Th1型免疫应答,并提高DNA疫苗的免疫保护作用.     

日本血吸虫SjC23 DNA疫苗基因枪免疫小鼠诱导免疫保护作用的研究

目的研究日本血吸虫中国大陆株23 kDa膜蛋白DNA疫苗基因枪免疫诱导BALB/c小鼠产生的抗血吸虫感染作用.方法60只雌性BALB/c小鼠随机分为6组:pcDNA3.1组(对照组),每只小鼠用基因枪经腹部皮肤免疫pcDNA3.1质粒DNA 2次,共2 μg;SjC23基因枪(gg)组,每鼠用基因枪免疫pcDNA3.1-SjC23质粒DNA 2 μg;SjC23肌注(im)组,每鼠肌注100 μg pcD-NA3.1-SjC23质粒DNA;SjC23/CpG(gg)组,每鼠用基因枪免疫pcDNA3.1-SjC23/CpG质粒DNA2μg;SjC23/CpG(im)组,每鼠肌注100μg pcDNA3.1-SjC23/CpG质粒DNA;联合免疫组,每只小鼠先肌注100μg pcDNA3.1-SjC23/CpG质粒DNA,第2天用基因枪免疫2 μg.各组小鼠隔2周加强免疫1次,共3次.末次免疫后4周每鼠经腹部皮肤攻击感染(45±1)条日本血吸虫尾蚴,45 d后剖杀,计数成虫及肝脏虫卵数.首次免疫前2天及感染前2天经尾静脉采血检测IgG抗体水平及抗体亚类IgG1、IgG2a.末次免疫后3周检测脾细胞经ConA和rSjC23-HD刺激后培养上清中鼠IL-2、IL-4和IFN-γ的水平.结果SjC23(gg)组、SjC23/CpG(gg)组及联合免疫组小鼠所检成虫数均低于对照组(P均＜0.01),减虫率分别为19.57%、25.38%和32.31%;SjC23(gg)组、SjC23/CpG(gg)组及联合免疫组小鼠检获虫卵数均低于对照组(P均＜0.05),减卵率分别为16.92%、19.56%和27.73%.SjC23(im)组和SjC23/CpG(im)组分别获得了28.07%和35.14%的减虫率及21.56%和26.52%的减卵率.抗体检测结果,SjC23(gg)组、SjC23/CpG(gg)组、SjC23(im)组、SjC23/CpG(im)组和联合免疫组均诱导小鼠产生了特异性IgG抗体.SjC23(gg)组IgG1的A450值为0.102,而IgG2a几乎检测不到;SjC23/CpG(gg)组IgG2a/IgG1比值为2.01;联合免疫组IgG2a/IgG1比值为5.18;SjC23(im)组和SjC23/CpG(im)组IgG2a/IgG1的比值分别为10.06和12.15.脾细胞经ConA和rSjC23-HD刺激,联合免疫组检测到较高水平的IL-2.SjC23(gg)组小鼠脾细胞经特异及非特异性抗原刺激均产生较高水平的IL-4.脾细胞经ConA刺激,IFN-7的水平SjC23/CpG(gg)组较SjC23(gg)组有所升高.结论SjC23 DNA疫苗通过基因枪免疫也能产生部分免疫保护作用,但明显低于肌肉注射的方法.     

日本血吸虫表位肽-DNA颗粒性疫苗对小鼠免疫应答的影响

采用已构建的日本血吸虫Sj22.6抗原CTL、Th和B细胞表位肽-DNA颗粒性疫苗(PDDV)及其混合疫苗免疫C57BL/6小鼠。36只小鼠随机均分6组,即18K对照组([K]_(18)-空质粒PDDV)、PBS对照组、C组(C-PDDV)、T组(TPDDV)、B组(B-PDDV)和C-T-B组(C-PDDV、T-PDDV和B-PDDV等量混合),每鼠分别在第0、3和6周麻醉下经尾脊部皮下注射100μl PDDV(含10μg DNA和28μg肽),对照组注射等量的空质粒DNA和[K]_(18)肽或PBS。末次免疫后7d,脱颈处死,制备脾细胞悬液,经日本血吸虫成虫抗原(SWA)刺激后根据~3H标记的胸腺嘧啶核苷(~3H-TdR)检测脾细胞增殖反应,ELISA法检测脾细胞培养上清中γ干扰素(IFN-γ)和白细胞介素-4(IL-4)的含量。ELISA结果显示,T组小鼠脾细胞中IFN-γ的含量[(76.0±11.2)pg/m1],高于PBS[(13.0±2.1)pg/ml]和18K对照组[(14.0±3.2)pg/ml](P<0.01),T组和C-T-B组小鼠脾细胞中IL-4的水平分别为(152.0±21.1)和(8...     

可溶性虫卵抗原和成虫抗原刺激日本血吸虫感染小鼠肠系膜淋巴结Th17细胞的免疫应答

目的研究可溶性虫卵抗原(SEA)和可溶性成虫抗原(SWA)刺激日本血吸虫(Schistosoma japonicum)感染小鼠肠系膜淋巴结(MLN)Th17细胞的免疫应答。方法新西兰大白兔2只,经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴(约1 000条/兔),45 d后收集成虫及虫卵,制备SWA和SEA。20只C57BL/6小鼠按随机数字表法随机分为感染组和健康组(10只/组),感染组小鼠经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴,(40±5)条/鼠,感染后5~6周ELISA检测血清中SEA和SWA特异性IgG抗体。分离两组小鼠MLN中的淋巴细胞,均给予4种不同条件刺激:无刺激组(A组),SEA(100μg/ml)+抗-CD28 mAb(1μg/ml)(B组),SWA(100μg/ml)+抗-CD28 mAb(1μg/ml)(C组),抗-CD3 mAb(1μg/ml)+抗-CD28 mAb(1μg/ml)(D组)。培养9 h后,流式细胞仪检测Th17细胞;培养72 h后,ELISA检测细胞培养上清中的白细胞介素(IL-17)和γ干扰素(IFN-γ)。结果 ELISA检测结果显示,感染组小鼠血清SEA、SWA特异性IgG抗体的吸光度(A_(450)值)分别为2.66±0.20和1.68±0.66,高于健康组的0.19±0.05和0.25±0.12(P0.01)。流式细胞术检测结果显示,B组刺激后,感染组淋巴细胞中CD4~+IL-17~+和CD4~+IFN-γ~+细胞分别占0.43%和0.56%,高于健康组的0.05%和0.20%(P0.05);C组刺激后则分别占0.39%和0.76%,高于健康组的0.04%和0.19%(P0.05)。两组小鼠的淋巴细胞体外经SEA(B组)刺激后,感染组淋巴细胞产生的IFN-γ和IL-17分别为(49.13±14.71)和(41.73±2.42)pg/ml,高于健康组的(3.27±0.33)和(9.22±0.58)pg/ml(P0.01);经SWA(C组)刺激后则分别为(46.92±16.73)和(36.14±4.82)pg/ml,高于健康组的(3.38±0.34)和(8.78±0.93)pg/ml(P0.01)。B组的IL-17含量高于C组(P0.05)。结论SEA和SWA能体外诱导日本血吸虫感染C57BL/6小鼠肠系膜淋巴结的淋巴细胞分泌IL-17和IFN-γ,SEA刺激淋巴细胞产生IL-17的含量明显高于SWA;SEA和SWA均能诱导淋巴细胞分化为CD4~+IL-17~+细胞和CD4~+IFN-γ~+细胞。     

SAG1-MIC8复合DNA基因疫苗免疫小鼠诱导抗弓形虫感染的保护性研究(英文)

目的观察弓形虫SAG1-MIC8复合DNA基因疫苗对C57BL/6J小鼠的免疫保护作用。方法构建重组质粒pcDNA3.1-SAG1、pcDNA3.1-MIC8和pcDNA3.1-SAG1-MIC8,并分别转染Hela细胞体外表达蛋白,蛋白质印迹(Westernblotting)分析鉴定。将70只小鼠随机均分为5组,分别为PBS组、空质粒组、pcDNA3.1-SAG1组、pcDNA3.1-MIC8组和pcDNA3.1-SAG1-MIC8组,每2周肌注免疫(100μg/只)1次,共3次,于免疫前和初次免疫后13、27、41和55d采血分离血清。初次免疫后56d,每组小鼠中7只剖杀后分离脾细胞,另7只经腹膜感染弓形虫RH株速殖子(1×104/只),观察各组生存时间。ELISA法分别检测各组小鼠血清IgG、IgG1、IgG2b和IgG2c水平,以及干扰素γ(IFN-γ)和白介素4(IL-4)水平。放射法检测T淋巴细胞增殖情况。结果Westernblotting分析结果显示,重组质粒pcDNA3.1-SAG1、pcDNA3.1-MIC8和pcDNA3.1-SAG1-MIC8均能在Hela细胞表达,蛋白相对分子质量(Mr)分别为34000、74000和109000。pcDNA3.1-SAG1-MIC8组初次免疫后41d和55d血清中IgG,末次血清中IgG2b、IgG2c和IFN-γ,以及T淋巴细胞增殖能力均显著高于其他各组(均P0.05)。各组的末次血清中IgG1和IL-4水平差异均无统计学意义(均P0.05)。5组小鼠感染弓形虫速殖子后生存时间中位数分别为3、4、7、7和10d,各组间差异有统计学意义(P0.01)。结论弓形虫SAG1-MIC8复合DNA抗原较SAG1和MIC8单基因抗原有更好的免疫保护性。     

HBV相关慢加急性肝衰竭患者血清IL-32和IL-10水平变化及意义

目的探讨HBV相关慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)患者血清IL-32和IL-10水平的变化规律及临床意义。方法选取2012年9月-2014年3月在苏州大学附属第一医院住院治疗的38例HBV-ACLF患者、20例慢性乙型肝炎(CHB)患者及20例健康对照者,采用ELISA法动态监测血清IL-32和IL-10水平变化,同时比较HBV-ACLF早中晚期、感染组与非感染组、存活组与死亡组IL-32、IL-10水平。计量资料2组间比较采用t检验,多组间比较采用方差分析,进一步2组间比较采用SNK-q检验。结果 HBV-ACLF组IL-32水平[(500.98±152.33)pg/ml]显著高于CHB组[(281.72±99.28)pg/ml]及健康对照组[(178.16±50.54)pg/ml](P值均<0.05);HBV-ACLF组IL-10水平[(4.82±1.03)pg/ml]显著高于CHB组[(3.15±0.98)pg/ml]及健康对照组[(1.62±0.43)pg/ml](P值均<0.05)。动态监测HBV-ACLF组IL-32水平显示,HBV-ACLF早期高于中期[(540.69±155.71)pg/ml vs(498.43±135.56)pg/ml,P<0.05],中期高于晚期[(498.43±135.56)pg/ml vs(450.77±102.33)pg/ml,P<0.05];比较IL-10水平,HBV-ACLF早期低于中期[(1.94±0.44)pg/ml vs(2.83±0.97)pg/ml,P<0.05],中期低于晚期[(2.83±0.97)pg/ml vs(3.69±1.23)pg/ml,P<0.05]。HBV-ACLF感染组IL-32水平高于非感染组[(553.41±158.65)pg/ml vs(482.54±110.16)pg/ml,P=0.021];HBV-ACLF存活组IL-32水平低于死亡组[(481.95±100.67)pg/ml vs(540.62±112.45)pg/ml,P=0.011],存活组IL-10高于死亡组[(4.21±1.27)pg/ml vs(3.61±1.05)pg/ml,P=0.038]。结论细胞因子网络在HBV-ACLF发病机制中发挥重要作用,血清IL-32及IL-10参与疾病的进展过程,动态监测其水平有助于判断预后。     

黏膜佐剂大肠埃希菌不耐热肠毒素B亚单位优化的淋病奈瑟菌孔洞蛋白B核酸疫苗的构建及其诱导小鼠的免疫应答

目的 分析黏膜佐剂大肠埃希菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)辅佐的淋病奈瑟菌孔洞蛋白B(PorB)核酸疫苗诱导小鼠的免疫应答水平.方法 PCR法扩增目的 基因porB、ltB、ltB-porB,分别构建3种相应的peDNA3.1(-)真核重组表达载体,经PCR、双酶切及基因测序鉴定后转染Hela细胞,用细胞免疫荧光法鉴定质粒的蛋白表达.将核酸疫苗经鼻饲免疫雌性BALB/c小鼠,检测体液免疫及细胞免疫应答水平,同时用免疫组织化学法检测porB、ltB、ltB-porB基因在小鼠鼻黏膜内的表达.组间均数比较采用方差分析.结果 构建的真核重组质粒均能在Hela细胞内及小鼠鼻黏膜组织内表达.核酸疫苗免疫组小鼠的生殖道灌洗液PorB特异性sIgA及血清porB特异性IgG水平明显高于对照组(P＜0.01;P＜0.05),且ltB-porB融合基因组特异性sIgA明显高于porB组(P＜0.05);pcDNA3.1(-)/porB组小鼠脾淋巴细胞培养上清液中IFN-γ、IL-4和脾淋巴细胞刺激指数(SI)分别为(170.04±23.89)pg/mL、(114.68±14.27)pg/mL和1.68±0.19,pcDNA3.1(-)/ltB-porB组分别为(161.42±27.50)pg/mL、(124.16±19.04)pg/mL和1.73±0.28,均高于对照组pcDNA3.1(-)和PBS,差异均有统计学意义(P＜0.01;P＜0.05),高于对照组pcDNA3.1(-)/ltB,差异均有统计学意义(均P＜0.05),但两核酸疫苗免疫组间差异无统计学意义(均P＞0.05).结论 所构建的核酸疫苗分别在Hela细胞及小鼠鼻黏膜组织内获得了表达,经黏膜途径免疫能诱导小鼠产生较高水平的特异性体液免疫和细胞免疫应答,尤其是黏膜免疫应答;证实黏膜佐剂LTB可辅佐PorB诱导小鼠产生高水平的生殖道黏膜免疫.

Abstract：

Objective To investigate the specific humoral immune response and cellular immune response induced by DNA vaccine with Neisseria gonorrhoeae porin B (PorB) fused with B subunit of Escherichia coli heat-labile enterotoxin B (LTB) in mice. Methods Target genes of porB, ltB and ltB-porB were amplified by polymerase chain reaction (PCR) and cloned into eukaryotic vector pcDNA3.1(-). The recombinants were identified by PCR, enzyme digestion and DNA sequencing.The vectors were transfected into Hela cells, and expressed proteins were checked by cytoimmunofluorescence. Female BALB/c mice were intranasally immunized with recombination vectors. The humoral immune response and cellular immune response were detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) colorimetric assay. The expressions of recombination vectors in intranasal mucosal tissues of the immunized mice were detected by immunohistochemistry. The means between groups were compared by analysis of variance. Results All the three recombinants were expressed in Hela cells and intranasal mucosal tissues. The PorB specific IgG in serum and sIgA in vaginal secretions in DNA vaccine immunized mice were significantly higher than those in controls (P＜0.01 ; P＜0.05). Moreover, the sIgA level in pcDNA3.1 (-)/ltB-porB group was higher than that in peDNA3, 1(-)/porB group (P＝0. 002). The levels of interferon-gamma (IFN-γ) and interleukin-4 (IL-4) in the supernatants and stimulation index (SI) of spleen lymphocyte culture in pcDNA3, 1(-)/porB group were (170.04±23.89) pg/mL, (114.68±14.27) pg/mL and 1. 68±0.19, respectively; and those in pcDNA3, 1(-)/ltB-porB group were (161.42±27.50) pg/mL, (124.16±19.04) pg/mL and 1.73±0.28, respectively; which were both higher than those in pcDNA3.1(-)/ phosphate buffered saliae (PBS) group (P＜0. 01; P＜0.05) and pcDNA3.1 (-)/ltB group (all P＜0.05), while there was no significant difference between pcDNA3.1 (-)/ltB-porB group and pcDNA3. 1 (-)/porB group (0. 998, 0. 696, 0. 994; all P＞0.05). Conclusions The constructed DNA vaccines are all successfully expressed in Hela cells and murine intranasal mucosal tissues. The mucosal immunization of the vaccines [pcDNA3. 1 (- )/porB and pcDNA3.1 ( -)/ltBporB] could induce humoral immune response and cellular immune response, especially mucosal immune response. It is confirmed that mucosal adjuvant LTB could promote PorB to induce higher level of mucosal immune response in mice.     

自然杀伤细胞在小鼠脑型疟中对CD4~+T细胞亚群的免疫调节作用

目的探讨自然杀伤(NK)细胞在小鼠脑型疟中对CD4~+T细胞亚群的免疫调节作用。方法雌性C57BL/6小鼠随机分为健康对照组、感染组与NK消除组,每组14只。感染组与NK消除组小鼠经腹腔内注射伯氏疟原虫ANKA株(Pb A)感染红细胞1×106个;NK消除组小鼠在感染前1 d和感染后2 d腹腔内注射NK细胞封闭抗体anti-Asialo GM-1, 15μl/只,健康对照组和感染组注射等体积的PBS。感染后3 d起,采集小鼠尾静脉血,血涂片检测原虫血症,记录死亡情况。感染后3 d和5 d,各组剖杀小鼠3只,取脾脏,制备脾细胞悬液,流式细胞术检测脾细胞中Th1型细胞和调节性T细胞(Tregs);体外培养脾细胞,48 h后收集上清,ELISA检测γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素10 (IL-10)的水平。感染后6 d,各组取3只小鼠,用伊文思蓝(EB)染液处理后,取脑,体外孵育脑组织,48 h后收集上清,酶标仪检测通过小鼠血脑屏障的EB含量。结果感染组感染后6 d开始出现死亡,并伴有神经症状,8 d全部死亡;NK消除组感染后7 d开始出现死亡,12 d全部死亡。感染后7 d, NK消除组原虫血症为5.2%～10.5%,高于感染组的2.4%～5.0%(P 0.05)。感染后5 d,感染组Th1型细胞的百分率和绝对计数分别为(2.65±0.06)%和(2.09～2.25)×10~6,高于健康对照组[(1.37±0.02)%和(0.41～0.47)×10~6](P 0.01); NK消除组分别为(1.82±0.07)%和(1.48～1.86)×10~6,低于感染组(P 0.01或P 0.05)。感染后3 d和5 d,感染组Tregs的百分率分别为(1.21±0.06)%和(1.70±0.13)%,高于健康对照组[(0.90±0.01)%和(0.91±0.02)%](P 0.01);感染组Tregs的绝对计数分别为(0.63～0.73)×10~6和(1.39～1.62)×10~6,高于健康对照组[(0.27～0.31)×10~6和(0.47～0.56)×10~6](P 0.01); NK消除组Tregs百分率分别为(1.86±0.07)%和(2.15±0.04)%,绝对计数分别为(0.77～0.90)×106和(1.68～2.15)×106,均高于感染组(P 0.01或P 0.05)。感染后3 d和5 d,感染组脾细胞培养上清中的IFN-γ分别为(790.75±84.80)和(989.58±199.59) pg/ml, TNF-α分别为(2 637.47±283.50)和(3 124.58±964.70) pg/ml,均高于健康对照组[(73.69±16.67)和(75.19±15.97) pg/ml、(290.01±187.46)和(290.51±186.76) pg/ml](P 0.01或P 0.05);NK消除组培养上清中的IFN-γ分别为(15.83±4.27)和(266.63±108.62) pg/ml, TNF-α分别为(165.89±71.02)和(842.77±311.94) pg/ml,均低于感染组(P 0.01或P 0.05)。感染后3 d, NK消除组IL-10为(3 588.20±1 436.38) pg/ml,高于感染组[(1 255.77±190.01) pg/ml](P 0.05)。感染后5 d,感染组IL-10为(4 991.36±1 030.89) pg/ml,高于健康对照组[(848.50±501.79) pg/ml](P 0.05); NK消除组为(9 317.95±1 077.89) pg/ml,高于感染组(P 0.05)。感染后6 d,感染组脑组织EB含量为(4.02±0.10)μg/ml,高于健康对照组[(2.09±0.06)μg/ml](P 0.05), NK消除组为(3.14±0.02)μg/ml,低于感染组(P 0.05)。结论NK细胞消除可减弱脑型疟小鼠Th1免疫应答,增强Tregs免疫应答,降低血脑屏障通透性,延长小鼠生存时间。     

细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗诱导小鼠脾细胞因子变化的研究

目的探讨细粒棘球绦虫(Eg)重组双歧杆菌(Bb)-Eg95-EgA31疫苗免疫和Eg原头节攻击后小鼠脾细胞因子的变化。方法 56只雌性BALB/c小鼠随机均分7组,A组和B组分别皮下和肌肉注射5×106蛋白克隆形成单位(CFU)疫苗悬浮于100μl双歧杆菌液体培养基(MRS)、C组鼻腔内接种5×105CFU+10μlMRS、D组经口灌胃5×108CFU+100μlMRS、E组(空载体对照组)5×106CFUBb(pGEX-1λT)+100μlMRS、F组为双歧杆菌(Bb)对照组和G组为双歧杆菌液体培养基(MRS)对照组。免疫后8周各组鼠攻击感染50个Eg原头节,感染后25周剖杀小鼠,取脾,分离脾细胞,用Eg粗抗原(EgAg)刺激培养,同时设伴刀豆球蛋白A(ConA)或脂多糖(LPS)刺激对照和非刺激组。收集脾细胞培养上清液,ELISA法检测脾细胞培养上清液中γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-12(IL-12)、α肿瘤坏死因子(TNF-α)和IL-10水平。结果 A、B、C和D组小鼠脾细胞培养上清液中,IFN-γ水平分别为(137.5±23.2)、(162.5±23.2)、(250.0±53.5)和(215.0±37.4)pg/ml,均高于MRS对照组(50.0±10.7)pg/ml(P0.01);IL-12水平分别为(27.5±4.6)、(32.5±4.6)、(45.0±5.4和(35.0±5.4)pg/ml,均高于MRS对照组(15.0±5.4)pg/ml(P0.01);TNF-α水平分别为(275.0±46.3)、(325.0±46.3)、(450.0±53.5)和(350.0±53.5)pg/ml,均高于MRS对照组(150.0±53.5)pg/ml(P0.01);IL-10水平分别为(37.5±4.6)、(35.0±5.4)、(25.0±5.4)和(32.5±4.6)pg/ml,均低于MRS对照组(45.0±5.4)pg/ml(P0.05或P0.01)。结论细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗可诱导小鼠产生Th1型保护性免疫应答。     

周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂和3-磷酸甘油醛脱氢酶复合基因真核表达载体的构建及免疫研究

目的 构建周期型马来丝虫(Bm)半胱氨酸蛋白酶抑制剂(CPI)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)重组复合基因真核表达质粒,观察其在小鼠体内的细胞免疫应答效应.方法 将重组质粒pGEM-T/BmCPI和pGEM-T/BmG APDH以及真核重组表达载体分别进行双酶切,构建真核重组表达质粒pcDNA3.1 (+)-BmCPI/BmGAPDH.将纯化的pcDNA3.1(+)-BmCPI/BmGAPDH和含非甲基化胞嘧啶和鸟嘌呤的寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)免疫BALB/c小鼠,并设PBS对照组及空质粒对照组,共免疫3次,每次间隔2周.采用RT-PCR方法检测肌肉组织内的目的基因,采用四甲基偶氮唑盐( MTT)法和ELISA法分别检测免疫小鼠T淋巴细胞刺激增殖指数和血清中IFN-γ、IL-4水平.统计学分析采用t检验.结果 pcDNA3.1 (+)-BmCPI/BmGAPDH复合基因真核表达载体免疫小鼠后,从小鼠肌肉组织内扩增出目的基因.免疫6周后,pcDNA3.1(+)-BmCPI/CpG组和pcDNA3.1(+)-BmCPI/BmGAPDH/CpG组T淋巴细胞刺激增殖指数分别为1.466±0.635和1.610±0.112,显著高于PBS组的1.004±0.019和pcDNA3.1(+)-CpG组的1.078±0.129(t=64.438、45.318、42.749、34.314,均P＜0.05).免疫4周后,pcDNA3.1(+)-BmCPI/BmGAPDH/CpG组IFN-γ、IL-4水平均高于pcDNA3.1(+)-CpG组(t=288.053、76.453,均P＜0.05),其中IFN-γ水平与pcDNA3.1(+)-BmCPI/CpG组相比也有明显提高(t=129.642,P＜0.05).结论 pcDNA3.1(+)-BmCPI/BmGAPDH重组复合基因真核表达载体能在小鼠体内表达,并可有效诱导特异性细胞免疫应答.     

HPV16 E2与IL-12联合基因疫苗的免疫效果初步研究

目的将HPV16E2与IL-12真核表达载体联合免疫小鼠,检测小鼠产生的特异性体液免疫和细胞免疫应答水平,为HPV16诱发的宫颈癌治疗性核酸疫苗的研制奠定实验基础。方法40只BALB/c小鼠随机分成PBS组、pcD-NA3.1(+)空质粒组、pcDNA3.1(+)/IL-12组、pcDNA3.1(+)/HPV16E2组以及pcDNA3.1(+)/HPV16E2+pcD-NA3.1(+)/IL-12联合组,每组8只,共免疫4次,每2周1次。于免疫前1d及第8周采血,分离血清,-20℃保存;颈椎脱臼处死小鼠,无菌取脾脏,制备脾细胞悬液。ELISA法测定小鼠血清HPV16E2IgG抗体水平及脾细胞培养上清IFN-γ、IL-4水平;MTT比色法检测脾淋巴细胞的增殖。结果免疫8周后,血清IgG抗体A450值E2组和联合组与PBS组和空质粒组比较差异有统计学意义(P<0.05);但在每个时间点,联合组与E2组比较差异无统计学意义(P>0.05)。IL-12组、E2组、联合组脾淋巴细胞培养上清中的IFN-γ和IL-4含量与PBS组和空质粒组比较差异有统计学意义(P<0.05);联合组与E2组比较IFN-γ含量差异有统计学意义(P<0.05),两组的IL-4含量差异无统计学意义(P>0.05)。IL-12组、E2组、联合组脾淋巴细胞SI值与PBS组和空质粒组比较差异有统计学意义(P<0.05);联合组与E2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论HPV16E2单基因疫苗及其与IL-12联合基因疫苗能刺激小鼠产生特异性抗体,脾淋巴细胞培养上清IFN-γ含量升高,且联合基因疫苗优于E2单基因疫苗。     

慢性乙型肝炎患者血清IL-12、IL-18水平和外周血单个核细胞FOXp3基因水平研究

目的探讨慢性乙型肝炎(CHB)患者血清白细胞介素-12(IL-12)、IL-18和外周血单个核细胞叉头蛋白P3(Foxp3)基因水平变化及其临床意义。方法 2015年7月～2018年3月我院收治的CHB患者78例和同期健康体检者25例,采用ELISA法检测血清IL-12和IL-18水平,分离外周血单个核细胞,采用RT-PCR法检测细胞Foxp3 mRNA水平。结果在78例CHB患者中,经肝组织活检诊断G1组21例,G2组24例,G3组19例,G4组14例;CHB患者血清ALT和AST水平分别为(278.3±89.4)U/L和(305.3±84.6) U/L,显著高于健康人的[(25.3±7.6) U/L和(20.3±6.5) U/L,P0.05];G4组血清ALT和AST水平分别为(563.5±132.4) U/L和(513.3±102.5) U/L,显著高于G1组[(113.2±67.4)U/L和(73.5±25.3) U/L]或G2组[(153.6±45.3) U/L和(113.8±35.2)U/L]或G3组[(240.5±56.6) U/L和(156.7±51.2) U/L,P0.05];CHB患者血清IL-12和IL-18水平及单个核细胞Foxp3 mRNA水平分别为(198.3±19.6) pg/ml、(408.6±91.2)pg/ml及(4.5±0.7),显著高于健康人[(64.5±10.9) pg/ml、(127.3±15.7) pg/ml、(3.3±0.4),P0.05];G4组血清IL-12、IL-18及Foxp3基因水平分别为(237.5±23.6) pg/ml、(431.5±106.3) pg/ml、(5.1±0.3)],显著高于G1组[(146.3±15.2) pg/ml、(390.2±90.3) pg/ml、(3.7±0.6)]或G2组[(185.2±13.6)pg/ml、(403.6±93.2)pg/ml、(3.9±0.5)pg/ml]或G3组[(203.2±18.3)pg/ml、(414.3±105.4) pg/ml、(4.3±0.7),P0.05]。结论 CHB患者外周血单个核细胞Foxp3基因及血清IL-12和IL-18水平显著升高,且肝组织炎症活动显著者,其水平更高,提示其参与了CHB的发病过程。及时检测这些指标可能对监测病情变化和判断治疗应答有帮助。     

普罗布考对急性冠脉综合征患者抗氧化、抗炎作用的研究

目的:观察普罗布考对急性冠脉综合征(ACS)患者血氧化低密度脂蛋白抗体(oxLDL-Ab)、高敏C反应蛋白(hs-CRP)和白介素18(IL-18)水平的影响。方法:ACS患者81例,随机分为普罗布考组(41例)和常规治疗组(40例),用药治疗前检测外周血oxLDL-Ab、hs-CRP和IL-18的水平,用药治疗1周后复查hs-CRP和IL-18,治疗4周后复查oxLDL-Ab,观察治疗前后各指标变化。并分析两组治疗结束前一周心绞痛发作的频率。结果:治疗后普罗布考组较常规治疗组oxLDL-Ab[(56.20±14.56)U/ml∶(88.65±11.23)U/ml]、hs-CRP[(8.78±5.61)mg/L∶(14.23±9.79)mg/L]及IL-18[(88.54±17.74)pg/ml∶(141.83±19.52)pg/ml]浓度明显降低(P均0.05)。普罗布考组治疗第4周平均心绞痛发作频率较常规治疗组显著降低[(2.5±1.5)次/周∶(4.7±1.7)次/周,P0.05],次数减少与oxLDL-Ab减少有明显相关性(r=0.60,P0.05)。结论:普罗布考对急性冠脉综合征患者具有抗氧化、抗炎作用,可减少心绞痛发作频率。