异甘草素抗肿瘤活性及初步机制研究

目的探讨异甘草素(isoliquiritigenin,ISL)抗肿瘤活性及初步机制。方法采用SRB法检测ISL对A549、SW620和HMEC-1细胞增殖的抑制作用;Transwell小室检测ISL对HMEC-1细胞迁移能力的影响;明胶酶谱法检测ISL对HMEC-1细胞MMP-2和MMP-9的表达;管样结构形成实验测定ISL对HMEC-1细胞管样结构形成能力;细胞内活性氧(ROS)通过荧光探针DCFH-DA进行测定;流式细胞术检测ISL对HMEC-1的细胞周期。鸡胚绒毛尿囊膜血管生成实验检测ISL体内抗血管生成作用。结果 ISL可明显抑制A549、SW620和HMEC-1细胞的增殖、HMEC-1细胞的迁移、管样结构形成以及细胞内MMP-2和MMP-9的表达,且均呈现浓度依赖关系。同时,ISL还可抑制HMEC-1细胞内由VEGF诱导产生的ROS量,且存在浓度依赖关系。流式细胞术检测发现高浓度ISL可将HMEC-1细胞阻滞于S期,而低浓度ISL通过诱导细胞凋亡来抑制HMEC-1细胞的增殖。ISL能明显抑制鸡胚尿囊膜新生毛细血管的生成。结论ISL具有明显的抗肿瘤活性,能抑制血管生成,其机制可能与清除HMEC-1细胞内ROS生成,诱导细胞凋亡有关。     

RNAi体外沉默淋巴管内皮祖细胞VEGFR-3基因表达

目的应用聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)包裹淋巴管内皮祖细胞(lymphatic endothelial progenitor cells,LEPCs)血管内皮生长因子受体3(vascular endothelial growth factor receptor-3,VEGFR-3)基因siRNA,体外沉默VEGFR-3基因表达,研究抑制LEPCs分化抗肿瘤淋巴管新生的作用。方法 Ficoll法分离人脐血单个核细胞,流式细胞仪、免疫荧光分选并鉴定LEPCs。PEI包裹VEGFR-3siRNA并转染入LEPCs,流式细胞仪检测转染效率。RT-PCR和Western blot检测mRNA和蛋白质水平VEGFR-3基因沉默效果。结果 VEGFR-3siRNA成功转入LEPCs,转染效率30%。VEGFR-3siRNA转染组LEPCs VEGFR-3mRNA和蛋白表达均降低(P0.05)。结论体外经由PEI介导的siRNA能有效的抑制LEPCs VEGFR-3的表达,为以LEPCs为靶点抑制肿瘤淋巴管新生提供了实验依据。     

高盐对血管内皮生长因子受体-3+巨噬细胞表型及功能的影响

目的 观察高盐对血管内皮生长因子受体（VEGFR）-3+巨噬细胞表型、淋巴管内皮细胞特性及功能的影响。方法 利用流式分选将小鼠RAW264.7巨噬细胞中VEGFR-3+亚群分选出来，分为Control组、低盐组（LS组，20mmol/L NaCl）和高盐组（HS组，40 mmol/L NaCl）。利用CCK-8法观察不同组VEGFR-3+细胞活性；Real-time PCR检测NaCl干预后VEGFR-3+巨噬细胞表型变化及淋巴管内皮细胞标志物mRNA表达水平；Transwell实验检测各组细胞的迁移功能，流式细胞术检测不同组细胞的吞噬能力。结果 与Control组相比，高盐干预可以使VEGFR-3+巨噬细 胞的白细胞介素（IL）-1β、肿瘤坏死因子（TNF）-α、CC类趋化因子配体（CCL）2、血管内皮生长因子（VEGF）-C及张力应答性增强子结合蛋白（TonEBP）mRNA表达水平上调（P＜0.05）；HS组在高盐干预24、48 h后细胞活性均显著低于LS组（P＜0.05）；同时，HS组细胞迁移能力及细胞的吞噬能力与Control组相比显著增强，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论 高盐可使VEGFR-3+巨噬细胞向M1型巨噬细胞偏移并表现出促淋巴管生成的特性，其迁移及吞噬能力显著增强，为进一步研究该亚群与淋巴管生成及心血管疾病的关系提供了依据。     

CCL5对人肺腺癌细胞增殖、凋亡的影响及机制研究

目的:研究敲低CC基序趋化因子配体5(CCL5)在非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞中的表达及对A549细胞增殖、迁移、凋亡等生物学活性的影响,探讨CCL5促进A549细胞上皮间质软化(EMT)的可能分子机制。方法:体外培养肺腺癌A549细胞,应用shRNA敲低A549细胞中CCL5基因,分为阴性对照组(siRNA-NC)及实验组(siRNA-CCL5)。应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞中CCL5mRNA表达;CCK-8、Transwell实验观察下调CCL5表达后细胞增殖、迁移、侵袭能力的变化;流式细胞术检测细胞凋亡的变化;蛋白印迹法(Western blot)检测E-钙黏附蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)及TGF-β信号通路TGF-β蛋白表达量的变化。结果:与对照组相比,敲低CCL5表达后实验组A549细胞CCL5mRNA表达下调(P<0.05);CCK-8实验结果显示A549细胞的增殖受到抑制(P<0.05);Transwell实验显示A549细胞的迁移、侵袭明显抑制(均P<0.05);A549细胞凋亡增加;West...     

甲硫氨酸限制对口腔癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响北大核心CSCD

目的探讨甲硫氨酸限制对人口腔鳞状癌细胞CAL-27的增殖、迁移和侵袭的影响。方法采用计数法检测甲硫氨酸限制对口腔癌细胞CAL-27增殖的影响;平板克隆法检测CAL-27细胞克隆形成;流式细胞术结合PI单染法检测CAL-27细胞的周期;Annexin V-PE/7AAD双染法检测CAL-27细胞的凋亡;划痕与Transwell实验检测CAL-27细胞的迁移和侵袭能力;Western blot检测细胞凋亡蛋白Bcl-2和Bax、细胞周期蛋白CDK2和CDK4以及迁移侵袭蛋白N-cadherin和E-cadherin的表达水平的变化。结果甲硫氨酸限制明显抑制口腔癌CAL-27细胞的增殖和克隆形成(P<0.01);甲硫氨酸限制将口腔癌细胞CAL-27阻滞在G_(0)/G_(1)期(P<0.01);甲硫氨酸限制明显诱导口腔癌细胞CAL-27细胞发生凋亡,抑制细胞的迁移和侵袭能力(P<0.01);Western blot结果表明甲硫氨酸限制明显下调口腔癌CAL-27细胞的凋亡蛋白Bcl-2的表达以及周期蛋白CDK2和CDK4的表达,并且明显下调迁移和侵袭蛋白N-cadherin以及上调E-cadherin的表达水平。结论口腔癌细胞CAL-27具有甲硫氨酸依赖性;通过甲硫氨酸限制明显抑制口腔癌细胞CAL-27细胞的增殖、迁移和侵袭,可为甲硫氨酸限制疗法应用于口腔癌的治疗提供理论依据。     

刺梨果多糖对黑素瘤A375细胞的作用及其机制

目的:探讨刺梨果多糖对黑色素瘤A375细胞增殖、迁移、侵袭、周期以及凋亡的影响。方法:通过细胞增殖试验、划痕试验、Transwell试验检测刺梨果多糖对A375细胞增殖、迁移、侵袭的作用;流式细胞术、实时荧光定量PCR技术和蛋白质免疫印迹技术检测刺梨果多糖对黑素瘤A375细胞周期和凋亡相关调控因子表达的影响。结果:刺梨果多糖显著抑制黑素瘤A375细胞增殖、迁移和侵袭,且呈时间和剂量正效应;抑制A375细胞CDK-1和CyclinB1的表达,阻滞细胞周期于G₂/M期;显著上调凋亡相关蛋白Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的表达量,下调抗凋亡Bcl-2蛋白的表达,诱导A375细胞凋亡。结论:刺梨果多糖能够抑制黑素瘤A375细胞的增殖并促进细胞凋亡。     

特异沉默人核糖核苷酸还原酶M2基因对人骨肉瘤细胞生物学特性的影响

目的 探讨小干扰RNA(siRNA)沉默核糖核苷酸还原酶M2(RRM2)基因表达对入骨肉瘤细胞Saos-2生物学影响及分子机制.方法 利用小干扰RNA技术,观察沉默Saos-2细胞中RRM2基因的表达,用实时荧光定量PCR(Real time-PCR)及Western blot技术检测人骨肉瘤细胞Saos-2和人正常成骨细胞hFOB1.19的mRNA及蛋白的表达;用CCK-8方法检测si-RRM2对Saos-2细胞增殖的影响;用Transwell细胞迁移系统检测si-RRM2对Saos-2细胞迁移能力的影响;用酶联免疫吸附试验(ELISA法)检测Saos-2细胞凋亡;采用Western blot技术检测细胞周期调控因子细胞周期素D1(Cyclin D1)和抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)蛋白水平变化.结果 Saos-2细胞RRM2 mRNA和蛋白比hFOB1.19细胞高表达;用si-RRM2转染Saos-2细胞后,Real time-PCR结果证实能时间及剂量依赖性下调RRM2基因表达;CCK-8方法结果显示下调RRM2基因会时间及剂量依赖性抑制Saos-2增殖,而人正常成骨细胞增殖抑制没有显著变化;Transwell细胞迁移系统检测显示下调RRM2基因后,显著抑制了Saos-2的迁移能力;si-RRM2联合化疗药物阿霉素促进Saos-2细胞凋亡;Western blot结果显示沉默RRM2后细胞周期调控因子Cyclin D1和抗凋亡蛋白Bcl-2均下调.结论 RRM2的过表达与人骨肉瘤细胞Saos-2的高增殖和迁移能力有关,抑制RRM2的功能是治疗人骨肉瘤的一个潜在的治疗策略.     

洛伐他汀联合顺铂对人肝癌HepG2细胞生物学特性的影响及其机制

目的 研究洛伐他汀单用或与化疗药物顺铂联用时对人肝癌HepG2细胞生物学特性的影响,初步探索其抗肿瘤作用机制。方法 不同浓度洛伐他汀、洛伐他汀联合顺铂处理细胞 48 h后,CCK-8法检测HepG2细胞的增殖抑制作用,金氏公式计算联合应用效果;平板克隆形成实验评价药物作用于肝癌细胞的远期效应;划痕实验检测药物对细胞迁移能力的影响;Transwell小室法检测药物对细胞侵袭能力的影响;流式细胞术检测药物处理后细胞周期和凋亡情况;蛋白印迹技术（Western-blot）检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达水平变化。结果 洛伐他汀呈浓度依赖性抑制HepG2细胞的增殖,金氏公式计算结果显示洛伐他汀可协同增强顺铂的抗肿瘤作用;平板克隆形成实验结果表明洛伐他汀能显著抑制HepG2细胞克隆形成率;划痕实验提示洛伐他汀能显著降低肝癌细胞的迁移率;Transwell小室侵袭实验结果发现洛伐他汀能明显减少穿膜细胞数量;流式细胞检测发现洛伐他汀可引起G0/G1期细胞增加,S期细胞减少,细胞凋亡率增加;Western-blot检测结果显示洛伐他汀可下调Bcl-2蛋白表达,同时上调Bax和Caspase-3蛋白表达。结论 洛伐他汀可明显抑制HepG2细胞增殖、迁移和侵袭能力,与顺铂联用可增强顺铂体外抗肿瘤效果,通过线粒体途径诱导肿瘤细胞凋亡是其可能的抗肿瘤作用机制之一。     

双氢青蒿素对人骨肉瘤细胞株143B增殖和凋亡的作用

目的观察双氢青蒿素(dihydroarteminin,DHA)对人骨肉瘤细胞143B的增殖和凋亡的影响以及可能的机制。方法体外培养人骨肉瘤细胞株143B;MTT比色法和克隆形成实验检测不同浓度DHA对骨肉瘤细胞存活与克隆形成能力的影响。Hoechst 33258染色法观察细胞凋亡的形态变化。构建β-Catenin荧光素酶报告基因(β-Catenin-Luc,p-Top)检测DHA作用143B后细胞内β-Catenin活性变化。不同浓度的DHA作用后,Western blot检测与细胞增殖(如PC-NA、Cyclin D1、c-Myc)、凋亡(如Bad、Bcl-2、Caspase-3)密切相关的标志物蛋白质表达变化。结果 DHA作用于143B细胞24 h后,MTT结果显示143B细胞的增殖活性受到明显抑制,且其克隆形成能力减弱(P<0.05),在DHA浓度达35μmol.L-1时,抑制效率最明显。Western blot结果显示PC-NA表达下调;而促凋亡蛋白Bad和Caspase-3表达上调,Bcl-2蛋白表达明显减弱。结论双氢青蒿素具有较明显的抑制人骨肉瘤细胞的增殖且促进其凋亡的作用,可能通过下调细胞增殖相关蛋白PCNA、Bcl-2和上调促凋亡蛋白Bad和Caspase-3,启动凋亡程序,致143B细胞发生凋亡。     

NVP-BEZ235抑制肝癌细胞HepG2的增殖和迁移及机制研究

目的探究NVP-BEZ235对肝癌细胞Hep G2增殖和迁移的影响及其机制。方法 NVP-BEZ235 (0、25、50、100、250、500 nmol·L-1)处理Hep G2细胞48 h后,采用MTT法检测细胞的活性;通过形态学观察和Hoechst 33342染色法,检测NVP-BEZ235对Hep G2细胞增殖、凋亡的影响;采用划痕实验、Transwell迁移实验,检测NVP-BEZ235对Hep G2细胞迁移能力的影响;免疫印迹法检测PI3K/Akt/m TOR信号通路、上皮-间质转化(EMT)以及Six1/Ezrin信号轴等标志物的表达情况;采用免疫荧光实验检测EMT相关标志物的表达情况。结果 NVP-BEZ235可明显抑制HepG2细胞的增殖,且呈浓度依赖性;NVP-BEZ235可诱导HepG2细胞发生凋亡;NVP-BEZ235可抑制HepG2细胞的迁移能力。在NVP-BEZ235的作用下,p-Akt~(Ser473)、p-S6~(Thr389)、p-4E-BP1~(Thr37/46)的表达下调,上皮标志物E-cacdherin表达上调,间质标志物Vimentin、Snail表达下调,Six1和p-Ezrin~(Tyr353)表达下调。结论NVP-BEZ235可有效抑制HepG2细胞的增殖和迁移,其机制可能与NVP-BEZ235降低p-Akt~(Ser473)、p-S6~(Thr389)、p-4EBP1~(Thr37/46)的表达,抑制Six1/Ezrin信号轴及逆转EMT的进程有关。     

诺帝对血管内皮生长因子诱导的人脐血源性内皮祖细胞功能的影响

探讨手性化合物诺帝(Nordy)对血管内皮生长因子(VEGF)诱导的人脐血源性内皮祖细胞(EPCs)功能的影响及其意义。应用密度梯度离心法分离新鲜人脐血的单个核细胞，接种于EGM-2培养液中培养7～10 d获得内皮祖细胞(EPCs)。分别采用MTT法、Millicell-PCF培养小室系统和Matrigel内小管形成试验检测诺帝对VEGF刺激下EPCs增殖活性、迁移能力和体外形成小管样结构能力的影响。结果表明，100 μmol·L^-1诺帝作用24 h明显抑制EPCs增殖活性(P<0.05)，诺帝(25～50 μmol·L^-1)作用48～72 h也明显抑制EPCs增殖活性(P<0.05)。诺帝(25～100 μmol·L^-1)显著抑制VEGF诱导的EPCs迁移活性和体外形成小管样结构的能力(P<0.05)。诺帝能抑制体外VEGF诱导的人脐血源性EPCs增殖、迁移和体外小管形成能力，提示其具有抗EPCs效应。     

The effect of acute exposure to coarse particulate matter air pollution in a rural location on circulating endothelial progenitor cells: results from a randomized controlled study

Abstract

Context: Fine particulate matter (PM) air pollution has been associated with alterations in circulating endothelial progenitor cell (EPC) levels, which may be one mechanism whereby exposures promote cardiovascular diseases. However, the impact of coarse PM on EPCs is unknown.

Objective: We aimed to determine the effect of acute exposure to coarse concentrated ambient particles (CAP) on circulating EPC levels.

Methods: Thirty-two adults (25.9?±?6.6 years) were exposed to coarse CAP (76.2?±?51.5?μg?m^?3) in a rural location and filtered air (FA) for 2 h in a randomized double-blind crossover study. Peripheral venous blood was collected 2 and 20 h post-exposures for circulating EPC (n?=?21), white blood cell (n?=?24) and vascular endothelial growth factor (VEGF) (n?=?16–19) levels. The changes between exposures were compared by matched Wilcoxon signed-rank tests.

Results: Circulating EPC levels were elevated 2 [108.29 (6.24–249.71) EPC?mL^?1; median (25th–75th percentiles), p?=?0.052] and 20 h [106.86 (52.91–278.35) EPC?mL^?1, p?=?0.008] post-CAP exposure compared to the same time points following FA [38.47 (0.00–84.83) and 50.16 (0.00–104.79) EPC?mL^?1]. VEGF and white blood cell (WBC) levels did not differ between exposures.

Conclusions: Brief inhalation of coarse PM from a rural location elicited an increase in EPCs that persisted for at least 20 h. The underlying mechanism responsible may reflect a systemic reaction to an acute “endothelial injury” and/or a circulating EPC response to sympathetic nervous system activation.     

Decreased mobilization of endothelial progenitor cells contributes to impaired neovascularization in diabetes

• 1 Circulating bone marrow (BM)‐derived endothelial progenitor cells (EPCs) play an important role in neovascularization. In the present study, we investigated the mechanisms underlying the reduction in circulating EPCs in a mouse model of diabetes induced by streptozotocin.
• 2 Compared with non‐diabetic controls, diabetic mice had reduced circulating EPCs (0.59 ± 0.11 vs 0.94 ± 0.21%, respectively; P < 0.01) and increased plasma endothelial microparticles (18 642 ± 6809 vs 5692 ± 1862/mL, respectively; P < 0.01). In a mouse bone marrow (BM) transplantation model, increased adhesion of transplanted BM cells to aortas of diabetic mice was observed compared with control (900 ± 194 vs 431 ± 109 cells/mm², respectively; P < 0.01).
• 3 Following hindlimb ischaemia, diabetic mice exhibited suppressed EPC mobilization, a reduction in the expected increase in capillary density and suppressed restoration of transcutaneous oxygen pressure in the ischaemic tissue. Diabetic mice also showed impaired ischaemia‐induced upregulation of vascular endothelial growth factor (VEGF), hypoxia‐inducible factor (HIF)‐1α and interleukin‐1β, an exaggerated increase in matrix metalloproteinase (MMP)‐2 and ‐9 and a suppressed increase in tissue inhibitor of matrix metalloproteinase (TIMP)‐1. On multivariate analysis, VEGF expression was the only independent factor related to circulating EPC count.
• 4 In conclusion, the data indicate that the decrease in basal circulating EPCs in diabetes may be attributable, in part, to consumptive loss of EPCs due to increased endothelial damage. Impairment of ischaemia‐induced EPC mobilization in the diabetic mouse model is associated with altered HIF‐1α/VEGF and MMP/TIMP regulation and represents a novel mechanism underlying defective postischaemic neovascularization in diabetes.

     

血管内皮生长因子对兔肾血管内皮细胞体外培养的影响

目的 探索血管内皮生长因子（VEGF）对兔肾血管内皮细胞（MVECs）体外培养的影响。方法采用三步梯度筛网法,获得纯度较高的肾血管球,0．5％胶原酶Ⅳ37℃消化15～20min,离心沉淀获取血管内皮细胞,分加与不加VEGF培养。对培养的细胞用倒置显微镜观察常规形态,用免疫组化法进行第Ⅷ因子相关抗原鉴定,用透射电镜观察细胞浆Weibel-Palade小体,用间接免疫荧光法检测CD31、CD34及CD44的表达。结果加VEGF的MVECs原代3d铺满瓶底,3～4d传一代;不加VEGF的MVECs原代7～12d铺满瓶底,7～8d传一代。鉴定时两种培养的MVECs表达是一致的。倒置显微镜观察细胞铺满瓶底时呈典型的铺路卵石样结构,免疫组化法第Ⅷ因子相关抗原阳性,透射电镜观察到细胞浆中的Weibel-Palade小体,间接免疫荧光法检测CD31、CD34表达阳性,CD44阴性。结论VEGF对MVECs体外培养的影响无显著意义。     

蜕皮甾酮对内皮细胞凋亡保护作用的研究

目的　初步探讨缺氧对培养人脐静脉内皮细胞 (HU VECs)凋亡的影响及蜕皮甾酮的干预性作用。方法　①人脐静脉内皮细胞的培养及鉴定 ;②建立人脐静脉内皮细胞缺氧模型 ,TUNEL法观测不同的缺氧时间 ( 0、12、2 4、4 8h)及蜕皮甾酮对内皮细胞凋亡的影响 ;③内皮细胞在常氧与缺氧状态下 ,实验组分别给于蜕皮甾酮 ( 10 0mg·L-1)刺激 ,2 4h后检测细胞中血管内皮生长因子 (VEGF)的表达。结果　随缺氧时间延长 ,HUVECs凋亡率显著升高 ;蜕皮甾酮能抑制缺氧导致的内皮细胞凋亡 ;蜕皮甾酮刺激内皮细胞VEGF表达上调。结论　缺氧作为一种致病因素 ,对内皮细胞凋亡的促发作用是随缺氧时间的延长而加重的。内皮细胞的过度凋亡是引起内皮功能障碍的一个重要因素 ,蜕皮甾酮通过抑制内皮细胞凋亡而具有内皮细胞保护作用 ,而此作用是由蜕皮甾酮刺激内皮细胞VEGF表达上调所介导的。     

内外源性EETs对血管内皮一氧化氮合酶的表达及其在Thr-495位磷酸化的作用

目的　研究细胞色素P4 5 0表氧化酶基因转染和直接加入EETs对内皮细胞eNOS表达及其在Thr 4 95位磷酸化的影响。方法　在原代培养的牛主动脉内皮细胞中 ,分别加入生理浓度的 8,9 EET(1 0 0nmol·L-1 )、1 1 ,1 2 EET(1 0 0nmol·L-1 )、1 4 ,1 5 EET(1 0 0nmol·L-1 )孵育 4h ,或直接用重组腺相关病毒介导的花生四烯酸表氧化酶转染牛主动脉内皮细胞2wk ,以产生内源性EETs ,用Westernblot法检测总eNOS蛋白的表达及eNOSThr 4 95磷酸化的水平 ;此外 ,从大鼠尾静脉注射真核表达质粒pCB6、pCB6 2C1 1OR、pCB6 2J2和pCB6 F87V ,2wk后检测大鼠主动脉总eNOS表达及eNOSThr 4 95磷酸化的水平。结果　与空白和溶媒组比较 ,外源性EETs明显促进内皮细胞总eNOS表达 ,增加eNOSThr 4 95的磷酸化 ,而CYP4 5 0抑制剂 (1 7 ODYA)则可明显降低eNOS表达和eNOSThr 4 95的磷酸化水平 ;与相应的对照组比较 ,体内和体外转染不同的表氧化酶基因均能明显上调内皮细胞eNOS的表达 ,增加eNOSThr 4 95的磷酸化水平。结论　EETs和CYP表氧化酶不仅能明显促进血管内皮细胞总eNOS蛋白的表达 ,而且还通过其翻译后修饰来增加其Thr 4 95位蛋白磷酸化水平     

普伐他汀对人内皮祖细胞一氧化氮合成的影响

目的观察普伐他汀对人内皮祖细胞（EPCs）一氧化氮（NO）合成的影响。方法密度梯度离心法获取外周血单个核细胞,培养7d后,收集贴壁细胞并分别加入普伐他汀,10μmol/L及100μmol/L干预48h,免疫组化、荧光显微镜和流式细胞仪鉴定EPC,用RT-PCR方法测定对细胞内皮型一氧化氮合酶（eNOS）mRNA表达的影响,并用硝酸还原酶法测定培养液中一氧化氮（NO）的水平。结果普伐他汀组的人内皮祖细胞eNOS mRNA的表达、NO的合成明显增加。结论普伐他汀可增加人内皮祖细胞eNOS mRNA的表达和NO的合成