脓毒症大鼠脾脏淋巴细胞凋亡的实验研究

目的 观察脓毒症大鼠脾脏T、B淋巴细胞的数量变化及细胞凋亡情况,探讨脓毒症时免疫失衡的机制.方法 健康雄性Wistar大鼠80只,按随机数字表法分为假手术组(30只)、模型组(50只).采用盲肠结扎穿孔术(CLP)制备脓毒症大鼠模型,于制模后6、12、24、48、96 h活杀动物取脾脏,行苏木素-伊红(HE)染色,光镜下观察脾脏组织病理变化;采用免疫组化法检测脾脏CD4~+、CD8~+T淋巴细胞和B淋巴细胞以及Bax、Bcl-2蛋白表达;采用原位末端缺刻标记法(TUNEL)检测脾脏细胞凋亡指数.结果 光镜下观察模型大鼠脾脏白髓逐渐萎缩,淋巴小结结构破坏.制模6、12、24、48、96 h,模型组大鼠脾脏CD4~+T淋巴细胞数、B淋巴细胞数、Bcl-2蛋白表达均较假手术组明显降低(P均<0.01),CD8~+T淋巴细胞数与假手术组比较差异无统计学意义(P均>0.05),细胞凋亡指数及Bax蛋白表达均较假手术组显著增加(P均<0.01).相关分析表明:Bcl-2蛋白表达与细胞凋亡指数呈负相关(r=0.659,P<0.01),而Bax蛋白表达与细胞凋亡指数呈正相关(r=0.522,P<0.01).结论 脓毒症早期免疫功能处于紊乱状态,表现为脾脏CD4~+T淋巴细胞数、B淋巴细胞数减少,细胞凋亡显著增加;Bax、Bcl-2在脓毒症脾细胞凋亡中发挥了关键作用.     

细胞凋亡及Bcl-2和Bax基因表达在脓毒症大鼠肾脏损伤中的作用

目的:探讨细胞凋亡及Bcl-2、Bax在脓毒症大鼠肾损伤中的作用。方法:大鼠分为正常组(n=6)、假手术组和脓毒症组(均n=24)。采用盲肠穿孔结扎术建立脓毒症模型。建模后3、6、12、24h测定血Cr、BUN,电镜观察肾组织超微结构,免疫组化法检测Bcl-2、Bax表达。结果:脓毒症组Cr、BUN较假手术组明显增高,随时间呈上升趋势;电镜下见肾小管上皮细胞凋亡;6h组Bax表达明显增加(0.485±0.011vs0.351±0.020;P<0.01),随病程延长,Bcl-2表达有所增加(P>0.05),Bcl-2/Bax比值降低(0.725±0.035vs0.991±0.060;P<0.01),随病程延长而下降。结论:脓毒症后Bax表达增强、抑制Bcl-2的表达,引起细胞凋亡及肾脏损伤。     

谷氨酰胺对脓毒症大鼠心肌细胞Bcl-2/Bax表达的影响

目的 研究脓毒症大鼠心肌细胞凋亡与Bcl-2/Bax基因及蛋白表达的关系,探讨谷氨酰胺(Gin)对脓毒症心肌细胞凋亡的保护作用.方法采用内毒素(LPS 4 ms/ks)腹腔注射法制作脓毒症大鼠模型,实验地点在中山大学北校区动物实验中心.健康Sprague-Dawley(sD)大鼠72只随机分为对照组、LPS组及LPS+Gln(0.3g/kg)组,再分为0 h,6 h,12 h,24 h亚组(腹腔注射后每组成功存活至观察时间点的大鼠累积达到6只,n=6),检测各时点心肌细胞凋亡率和Bcl-2及Bax蛋白的含量,同时检测心肌Bcl-2及Bax mRNA表达.对结果进行方差分析和相关性统计分析.结果 LPS组大鼠心肌细胞凋亡率6 h、12 h及24 h均明显高于埘照组(F=186.786,P<0.01);心肌细胞Bax蛋白表达术后6 h降低(F=9.027,P<0.01),之后高于对照组;而Bcl-2蛋白表达6 h,12 h及24 h均低于对照组(F=301.142,P<0.01);Bax/Bcl-2蛋白表达比明显高于对照组(F=527.373,P<0.01);BaxmRNA和Bcl-2 6 h,12 h及24 h较对照组均明显上调(F=126.157,80.745,P<0.01).LPS+Gln组与LPS组比较,6 h,12 h及24 h心肌细胞凋亡率明显低于LPS组(F=75.187,P<0.01);Bax蛋白表达下降(F=20.981,P<0.01),而Bcl-2蛋白却升高(F 164.969,P<0.000);Bax/Bcl-2蛋白表达比降低(F=141.426,P<0.01);Bax mRNA和Bcl-2 6 h,12 h及24 h组较LPS组均明显下调(F=103.463,89.373,P<0.01).结论 Bcl-2抗凋亡基因及Bax促凋亡基因及其蛋白的表达参与脓毒症心肌细胞凋亡;应用Gln能影响凋亡相关基因及蛋白表达,减轻脓毒症心肌细胞的凋亡,改善脓毒症预后.     

谷氨酰胺对脓毒症大鼠心肌细胞Bcl-2/Bax表达的影响

目的 研究脓毒症大鼠心肌细胞凋亡与Bcl-2/Bax基因及蛋白表达的关系,探讨谷氨酰胺(Gin)对脓毒症心肌细胞凋亡的保护作用.方法采用内毒素(LPS 4 ms/ks)腹腔注射法制作脓毒症大鼠模型,实验地点在中山大学北校区动物实验中心.健康Sprague-Dawley(sD)大鼠72只随机分为对照组、LPS组及LPS+Gln(0.3g/kg)组,再分为0 h,6 h,12 h,24 h亚组(腹腔注射后每组成功存活至观察时间点的大鼠累积达到6只,n=6),检测各时点心肌细胞凋亡率和Bcl-2及Bax蛋白的含量,同时检测心肌Bcl-2及Bax mRNA表达.对结果进行方差分析和相关性统计分析.结果 LPS组大鼠心肌细胞凋亡率6 h、12 h及24 h均明显高于埘照组(F=186.786,P<0.01);心肌细胞Bax蛋白表达术后6 h降低(F=9.027,P<0.01),之后高于对照组;而Bcl-2蛋白表达6 h,12 h及24 h均低于对照组(F=301.142,P<0.01);Bax/Bcl-2蛋白表达比明显高于对照组(F=527.373,P<0.01);BaxmRNA和Bcl-2 6 h,12 h及24 h较对照组均明显上调(F=126.157,80.745,P<0.01).LPS+Gln组与LPS组比较,6 h,12 h及24 h心肌细胞凋亡率明显低于LPS组(F=75.187,P<0.01);Bax蛋白表达下降(F=20.981,P<0.01),而Bcl-2蛋白却升高(F 164.969,P<0.000);Bax/Bcl-2蛋白表达比降低(F=141.426,P<0.01);Bax mRNA和Bcl-2 6 h,12 h及24 h组较LPS组均明显下调(F=103.463,89.373,P<0.01).结论 Bcl-2抗凋亡基因及Bax促凋亡基因及其蛋白的表达参与脓毒症心肌细胞凋亡;应用Gln能影响凋亡相关基因及蛋白表达,减轻脓毒症心肌细胞的凋亡,改善脓毒症预后.     

人尿液干细胞对大鼠脊髓损伤神经凋亡的保护作用及相关机制研究

目的探讨人尿液干细胞(h USCs)对大鼠脊髓损伤(SCI)后神经凋亡的保护作用及其相关机制。方法体外获取h USCs进行增殖培养,利用流式细胞仪检测h USCs细胞表型。Allen法制作大鼠脊髓损伤模型,42只大鼠随机等分为3组:对照组,SCI组和h USCs+SCI组。分别于7 d、14 d和21 d对各组大鼠下肢运动功能评分,21 d后取出各组大鼠损伤脊髓进行组织切片染色,并利用Western blot法检测脊髓Bax/Bcl-2含量,ELISA法检测Caspase-3含量。结果h USCs细胞表型CD29表达(98.92±0.62)%,CD73表达(99.14±0.86)%,CD34表达(0.47±0.16)%。与对照组比较,SCI组大鼠下肢运动功能明显下降,Bax蛋白表达、Caspase-3含量明显增加,Bcl-2蛋白表达明显下调。h USCs在7 d、14 d和21 d可明显改善SCI大鼠下肢运动功能;与SCI组比较,h USCs+SCI组大鼠损伤脊髓节段Bax蛋白表达、Caspase-3含量得到抑制,Bcl-2蛋白表达显著提高;ELISA结果显示,h USCs+SCI组可显著降低损伤脊髓中Caspase-3含量。结论 h USCs对大鼠脊髓损伤神经凋亡具有明显抑制作用,可能是通过抑制Bax、Caspase-3,提高Bcl-2蛋白表达实现的。     

补阳还五汤对大鼠心肺复苏后脑水肿和细胞凋亡的影响

目的 探讨补阳还五汤(BHD)对心肺复苏(CPR)后脑水肿和细胞凋亡的影响.方法 雄性SD大鼠24只按随机数字表法均分为假手术组、复苏组、BHD组.采用窒息法建立大鼠CPR模型,分别于自主循环恢复(ROSC)时和ROSC 12 h灌胃生理盐水或BHD.各组于ROSC 24 h取左侧大脑,采用干湿比重法计算脑组织含水量,原位末端缺刻标记法检测凋亡细胞,免疫组化法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和Fas蛋白表达.结果 与假手术组比较,复苏组在ROSC后24 h脑含水量增加[(80.99±0.83)%比(78.60±0.46)%,P<0.05],脑凋亡相关蛋白Bax[(32.1±6.4)个/HP比(5.6±3.0)个/HP]、Bcl-2[(15.0±6.0)个/HP比(6.9±2.9)个/HP]、Fas[(17.3±7.7)个/HP比(3.9±2.0)个/HP]以及脑细胞凋亡[(47.5±8.5)个/HP比(10.6±4.7)个/HP]的表达增加(均P<0.01);与复苏组比较,BHD组脑含水量[(79.09±0.97)%]减少,Bax[(17.1±6.2)个/HP]、Fas蛋白[(10.9±4.3)个/HP]表达和细胞凋亡[(33.4±6.6)个/HP]明显降低, Bcl-2蛋白表达[(35.5±7.0)个/HP]明显增加(P<0.05或P<0.01).结论 BHD能够减轻脑水肿,减少细胞凋亡,具有脑保护作用.     

辛伐他汀对脓毒症大鼠血清诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

目的初步探讨辛伐他汀对脓毒症大鼠血清诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的影响及可能机制。方法采用改良盲肠结扎穿孔术复制脓毒症模型,收集血清备用。体外培养的人脐静脉内皮细胞株(ECV-304)分为三组(对照组、脓毒症组、辛伐他汀干预组),培养24 h,MTT法检测细胞活性,AO染色观察细胞凋亡情况,RT-PCR检测细胞Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达。结果 MTT:与脓毒症组相比,辛伐他汀干预组细胞活性明显提高;AO染色:对照组细胞形态基本正常,脓毒症组可见大量凋亡细胞,辛伐他汀干预组可见少量细胞凋亡;RT-PCR:与对照组相比,脓毒症组、辛伐他汀干预组,Bcl-2 mRNA、Bax mRNA高表达(P<0.01);与脓毒症组相比,辛伐他汀干预组Bcl-2 mRNA高表达(P<0.05),Bax mRNA低表达(P<0.01)。结论辛伐他汀可抑制脓毒症大鼠血清诱导的内皮细胞凋亡,上调Bcl-2和下调Bax表达可能是其机制之一。     

姜黄素上调线粒体融合蛋白2抑制脓毒症小鼠淋巴细胞凋亡的实验研究

目的 研究姜黄素抑制脓毒症小鼠淋巴细胞凋亡的作用与机制.方法 取45只清洁级BALB/c雄性小鼠,随机(随机数字法)分为3组,即假手术组(n=15),脓毒症组(n=15),姜黄素组(n=15),实验重复3次.脓毒症组行盲肠结扎穿孔术(cecal ligation and puncture,CLP),术前予等体积生理盐水灌胃1周;姜黄素组行CLP术,术前给予姜黄素200 mg/ (kg-d)灌胃1周;假手术组仅行开腹,不予以结扎、穿孔,术前等体积生理盐水灌胃1周.观察各组小鼠术后24h病死率,并处死存活小鼠,分离脾脏淋巴细胞.采用流式细胞术、TUNEL法检测淋巴细胞凋亡情况;流式细胞术检测线粒体膜电位水平;Western Blot检测线粒体融合蛋白2(Mitofusin2,Mfn2)、Bax、Bcl-2蛋白表达.数据采用SPSS 18.0软件进行分析,计数资料采用x2检验,计量资料组间比较采用单因素方差分析.结果 小鼠病死率采用x2检验,脓毒症组小鼠术后24h病死率为46.7％,较假手术组0.00％明显升高(x2 =27.391,P＜0.01),姜黄素组病死率较脓毒症组有所降低(40.0％ vs.46.7％,x2=6.429,P=0.01).脾淋巴细胞凋亡率比较采用单因素方差分析,3组比较,P＜0.01,差异具有统计学意义.进一步两两比较,脓毒症组脾淋巴细胞凋亡率为(17.1±1.67)％,较假手术组(9.43±1.06)％明显增高(P ＜0.001);姜黄素组淋巴细胞凋亡率(12.70±1.25)％较脓毒症组比较明显下降(P=0.012).脾淋巴细胞线粒体膜电位比较采用单因素方差分析,3组比较P＜0.01,差异具有统计学意义.进一步两两比较,脓毒症组线粒体膜电位降低率为(45.13±4.14)％,较假手术组(21.63±1.62)％明显升高(P＜0.01),姜黄素组线粒体膜电位降低率为(29.67±2.15)％,较脓毒症组明显降低(P=0.001).蛋白表达情况采用单因素方差分析,3组线粒体Bax蛋白(P＜0.01)、胞浆Bax蛋白(P＜0.01),差异具有统计学意义.进一步两两比较,与假手术组比较,脓毒症组线粒体Bax蛋白表达水平明显上调(P=0.001),而胞浆Bax蛋白表达水平明显降低(P＜0.01).经姜黄素预处理后线粒体Bax蛋白水平较脓毒症组明显降低(P=0.02),胞浆Bax蛋白表达水平明显升高(P＜0.01).3组细胞总Mfn2蛋白(P ＜0.001)、Bcl-2蛋白(P=0.001),差异具有统计学意义.进一步两两比较,与假手术组比较,脓毒症组Mfn2蛋白(P=0.015)、Bcl-2蛋白(P=0.01)表达水平明显降低,经姜黄素预处理后Mfn2蛋白(P=0.002)、Bcl-2蛋白(P =0.001)水平明显上调.结论 姜黄素能够上调Mfn2表达,促进线粒体融合进而抑制脓毒症小鼠脾淋巴细胞的凋亡.     

胰岛素强化治疗拮抗烫伤大鼠心肌细胞凋亡的机制研究

目的 探讨大鼠重度烫伤后胰岛素强化治疗拮抗心肌细胞凋亡的作用及机制.方法 将18只SD大鼠按随机数字表法分为假伤组、烫伤组和胰岛素强化治疗组(强化治疗组),每组6只.制作30％总体表面积(TBSA)Ⅱ度烫伤模型及胰岛素强化治疗模型.伤后6h取大鼠左室心肌组织,采用原位末端缺刻标记法(TUNEL)检测心肌细胞凋亡,用免疫组化和蛋白质免疫印迹法(Western blotting)分别观察3种凋亡相关基因天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)、Bax和Bcl-2的蛋白表达.结果 与假伤组比较,烫伤后心肌凋亡细胞明显增多[(13.1±3.4)％比(0.6±0.4)％,P＜0.01];caspase-3、Bax的蛋白表达明显增高(免疫组化caspase-3:13.72±4.13比1.36±0.95,Bax:29.64±5.42比2.24±1.04; Western blotting caspase-3:5.72±2.13比1,Bax:4.64±1.42比1),而Bcl-2表达水平显著降低(免疫组化:3.39±1.52比8.01±2.56;Western blotting:0.69±0.42比1,均P＜0.01).经胰岛素强化治疗后,心肌细胞的凋亡率较烫伤组明显降低[(6.7±1.8)％比(13.1±3.4)％,P＜0.01],3种凋亡相关基因的蛋白表达水平正好与烫伤组的变化相反(免疫组化caspase-3:8.88±3.36比13.72±4.13,Bax:14.43±3.69比29.64±5.42,Bcl-2:8.61±3.72比3.39±1.52;Western blotting caspase-3:2.18±0.86比5.72±2.13,Bax:2.87±1.35比4.64±1.42,Bcl-2:3.57±1.70比0.69±0.42,P＜0.05或P＜0.01).结论胰岛素强化治疗可能通过调节caspase-3、Bax和Bcl-2 3种细胞凋亡相关基因的表达,对烫伤后心肌细胞发挥抗凋亡作用.     

脓毒症大鼠调节性T细胞凋亡对辅助性T细胞漂移的影响及血必净注射液的干预作用

目的 探讨脓毒症大鼠CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)凋亡对辅助性T细胞(Th)漂移的影响及血必净注射液的干预作用.方法 将Wistar大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、血必净组,每组8只.行盲肠结扎穿孔术(CLP)制备脓毒症大鼠模型.于第3日采用免疫磁珠法分选各组CD4+CD25+Treg并培养12 h,用流式细胞仪检测Treg凋亡率及叉头翼状螺旋转录因子(Foxp3)和T淋巴细胞毒性相关抗原4(CTLA-4)的表达,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测白细胞介素-10(IL-10)的分泌量;再将CD4+CD25+ Treg与CD4+CD25-T细胞1∶1共培养,刀豆素A刺激68 h,ELISA检测Th1、Th2、Th17分泌的γ-干扰素(IFN-γ)、IL-4、IL-17水平.结果 正常组Treg凋亡率[(12.03±0.89)%]与假手术组[(9.48±2.17)%]比较差异无统计学意义;模型组Treg凋亡率[(5.87±0.44)%]明显低于正常组和假手术组;而血必净组的Treg凋亡率[(27.29±2.48)%]显著高于其他各组(P均<0.01).Foxp3、CTLA-4表达和IL-10分泌量随Treg凋亡率增加而减少,相关系数(r)分别为-0.878(P=0.042)、-0.877(P=0.042)、-0.743(P=0.010).与正常组比较,模型组IFN-γ、IL-4水平和IFN-γ/IL-4比值均明显升高[IFN-γ:(254.70±44.88)ng/L比(0.68±0.78)ng/L,IL-4:(8.82±0.61)ng/L比(3.48±0.98)ng/L,IFN-γ/IL-4比值:30.28±4.87比0.23±0.30,P均<0.01];而血必净组IFN-γ[(491.54±84.28)ng/L]和IFN-γ/IL-4比值(45.31±8.01)均显著高于模型组(P<0.01和P<0.05);各组间IL-17水平无明显差异(P均>0.05).结论 脓毒症时Treg凋亡率增加可减轻对效应T细胞的抑制功能,血必净注射液能有效促进脓毒症Treg凋亡,介导Th2向Th1漂移.     

NG-硝基-L-精氨酸对脂多糖诱导大鼠肺损伤时肺表面活性物质和细胞凋亡的影响

目的 探讨NG-硝基-L-精氨酸(L-NA)对内毒素性肺损伤大鼠肺表面活性物质(PS)和细胞凋亡的影响.方法 雄性SD大鼠24只,按随机数字表法均分为对照组、模型组、L-NA治疗组.模型组、L-NA治疗组舌下静脉注射脂多糖(LPS)复制内毒素性肺损伤模型;对照组给予等量生理盐水.L-NA治疗组于注射LPS 3 h后给予L-NA 20 mg/kg;对照组和模型组给予等量生理盐水.6 h后处死动物,取肺组织,用原位杂交法测定肺组织表面活性物质相关蛋白A(SP-A)mRNA表达;用流式细胞术检测肺组织细胞凋亡率;用蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)蛋白表达;用免疫组化法测定Bcl-2和Bax蛋白表达.结果 与对照组比较,模型组SP-A mRNA表达[吸光度(A)值]明显下降(0.071±0.017比0.113±0.021),细胞凋亡率[(25.04±4.57)%比(11.37±3.08)%]、caspase-3蛋白表达(A值:298.64±37.11比110.24±14.35)、Bax蛋白表达(A值:0.145±0.011比0.076±0.010)明显升高,Bcl-2蛋白表达(A值:0.064±0.011比0.073±0.009)和Bcl-2/Bax比值(0.447±0.086比0.976±0.157)明显下降(均P<0.01).与模型组比较,L-NA治疗组SP-A mRNA表达(A值:0.085±0.015)和Bcl-2蛋白表达(A值:0.070±0.087)明显增强(P<0.01和P<0.05),但细胞凋亡率[(20.67±1.35)%]、caspase-3蛋白表达(A值:268.75±42.56)、Bax蛋白表达(A值:0.142±0.012)和Bcl-2/Bax比值(0.498±0.069)均无明显变化(均P>0.05).结论 L-NA不通过抑制肺细胞凋亡来减轻内毒素性肺损伤的程度,对调节凋亡相关基因caspase-3和Bax也无明显影响;而是可通过增强PS表达减轻内毒素性肺损伤.     

人尿液干细胞定向移植治疗大鼠颅脑损伤

目的探讨人尿液干细胞(h USCs)对大鼠颅脑损伤(TBI)后神经运动功能及神经细胞凋亡的作用及其相关机制。方法体外获取h USCs进行增殖培养,利用流式细胞仪检测h USCs细胞表型。Feeney氏自由落体法制备大鼠TBI动物模型,45只大鼠随机分为3组:A组为正常对照组,B组为模型组,C组为实验组。实验组造模后利用h USCs定向移植治疗大鼠TBI。A组和B组注射等量高糖DMEM培养基。分别于10 d、20 d和30 d后进行神经功能评分,30 d后处死所有大鼠,取出损伤区域脑组织,利用Western blot检测凋亡蛋白Bax、Bcl-2以及Caspase-3表达,并利用免疫组织化学染色检测Caspase-3表达。结果 h USCs细胞表型CD29表达率为(99.12±0.57)%,CD73表达率为(98.73±0.79)%,CD34表达率为(0.41±0.15)%,神经功能评分显示,B组大鼠颅脑损伤后神经功能评分较A组明显升高,C组经h USCs治疗10 d、20 d和30 d可显著改善降低颅脑损伤大鼠神经功能评分。Western blot结果显示,B组Bax、Caspase-3蛋白表达较A组明显增加,B组Bcl-2蛋白表达较A组明显下调,C组经h USCs治疗可显著抑制Bax和Caspase-3蛋白,提高Bcl-2表达。免疫组织化学染色结果显示,B组Caspase-3表达均显著高于A组,C组经h USCs治疗可显著降低Caspase-3在脑组织中平均光密度。结论 h USCs可提高大鼠颅脑损伤后神经运动功能,抑制颅脑损伤后神经细胞的凋亡。     

补阳还五汤对大鼠断肢再植术后肢体缺血再灌注损伤的影响

目的:探讨补阳还五汤在大鼠下肢断肢再植术后缺血-再灌注损伤中的影响,评估其对缺血组织的保护作用及机制。方法:建立大鼠下肢断肢再植术后缺血-再灌注损伤动物模型,随机分为正常对照组、补阳还五汤组、依达拉奉组、空白对照组,测定血液NO水平、腓肠肌组织中超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)活性、丙二醛(Maleic Dialdehyde,MDA)浓度以及钙离子负载;腓肠肌组织提取总RNA,采用RT-PCR半定量分析Bcl-2-mRNA和Bax-mRNA转录水平,观察腓肠肌组织形态学变化。结果:与其他组相比,补阳还五汤能有效降低肢体缺血再灌注后氧自由基产生,增强SOD活性,减轻钙超载所导致肢体缺血再灌注损伤;能够减少血浆NO的大量生成;通过增强抗凋亡基因Bcl-2的表达和减弱促进凋亡基因Bax表达抑制肢体缺血再灌注后骨骼肌细胞的凋亡,减轻肢体缺血再灌注损伤。结论:补阳还五汤对大鼠断肢再植术后下肢缺血-再灌注损伤具有明显的保护作用,其机制可能与其抗氧化、清除自由基、抑制骨骼肌细胞凋亡有关。     

参芪扶正注射液对脓毒症患者免疫功能的影响

目的 观察参芪扶正注射液对脓毒症患者外周血T细胞亚群、T细胞凋亡和细胞因子的影响并探讨其意义.方法 选择天津医科大学总医院普通外科收治的40例脓毒症患者,按随机数字表法分为常规治疗组(20例,给予常规西医治疗)和参芪扶正治疗组(20例,在西医常规治疗基础上加用参芪扶正注射液 250 mL静脉滴注,每日1次),两组均以7 d为1个疗程.两组患者均于治疗1、3、7 d进行急性生理学与慢性健康状况评分系统Ⅱ(APACHE Ⅱ)评分;用流式细胞仪检测外周血T细胞亚群CD4+、CD8+、CD4+/CD8+和细胞凋亡情况,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测外周血细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素 (IL-6、IL-10)水平.结果 两组治疗后3 d APACHEⅡ评分均较治疗后1 d明显降低,并持续到治疗后7 d,且参芪扶正治疗组的降低程度较常规治疗组更显著(分:10.05±3.71比13.15±4.65,P<0.05).随着治疗时间的延长,两组外周血TNF-α、IL-6水平均逐渐下降;IL-10水平先升高,到7 d时又下降;7 d时参芪扶正治疗组TNF-α和IL-6明显低于常规治疗组〔TNF-α(ng/L):204.6±18.1比218.9±21.3,IL-6(ng/L):3.68±0.30比3.95±0.49,均P<0.05〕;而参芪扶正组与常规治疗组IL-10比较差异无统计学意义(ng/L:173.8±23.3比174.8±18.9,P>0.05).两组治疗后1、3、7 d CD4+T细胞和CD4+/CD8+先下降后上升,CD8+T细胞逐渐下降及CD4+、CD8+T细胞凋亡率先升后降,参芪扶正治疗组治疗后7 d CD4+T细胞、CD4+/CD8+及CD4+T细胞凋亡率与常规治疗组比较差异均有统计学意义〔CD4+T细胞:(38.3±4.7)%比(35.5±5.5)%,CD4+/CD8+:1.55±0.29比1.36±0.27,CD4+T细胞凋亡率:(11.2±3.8)%比(14.1±5.5)%,均P<0.05〕;两组各时间点CD8+T及其细胞凋亡率比较差异均无统计学意义(均P>0.05).结论 参芪扶正注射液可有效降低脓毒症患者CD4+T细胞凋亡率,增加CD4+T细胞和CD4+/CD8+,降低炎症指标,改善脓毒症患者的免疫功能及病情严重程度.     

罗格列酮对兔髂动脉球囊损伤后细胞凋亡及Bcl-2/Bax表达的影响

目的:观察罗格列酮时兔髂动脉球囊内膜剥脱术后细胞凋亡及凋亡调控蛋白Bcl-2、Bax表达的影响.方法:将30只雄性新西兰大耳白兔随机分为3组,正常对照组(普通饮食)、模型组(高脂饮食+球囊内膜剥脱术)和罗格列酮组(高脂饮食+球囊内膜剥脱术+罗格列酮).分别于术后第1、4周末处死动物,取髂动脉标本行病理形态学观察,TUNEL法检测细胞凋亡水平,免疫组化法测定Bax、Bcl-2蛋白表达的情况.结果:正常对照组仅见少量凋亡细胞和Bax、Bcl-2蛋白表达.与模型组相比,罗格列酮组在术后第1、4周末内膜增殖程度显著减轻(P＜0.05),细胞凋亡程度、Bax蛋白表达明显增强(P＜0.01),Bcl-2蛋白表达减少(P＜0.01),细胞凋亡改变在术后l周末更为明显.结论:罗格列酮具有促进球囊损伤术后内膜平滑肌细胞凋亡、下调Bcl-2蛋白表达及上调Bax蛋白表达的作用.     

调节性T细胞对脓毒症中T淋巴细胞凋亡的影响

目的:探讨CD4~+CD25~+调节性T细胞(CD4~+CD25~+Treg)对脓毒症过程中效应性T细胞(Teff)凋亡的影响。方法:应用SPF级健康雄性BALB/C小鼠制备盲肠结扎穿孔术(CLP)脓毒症模型。小鼠随机分为正常对照组、假伤组、CLP组、CLP+PC61(Treg特异性抑制剂)组、CLP+HRPN(PC61的同型对照蛋白IgG)组。免疫磁珠法分选小鼠脾脏CD4~+CD25~+Treg。采用流式细胞术观察T淋巴细胞毒性相关抗原(CTLA)-4及转录因子叉头翼状螺旋转录因子(Foxp3)表达以及CD25比例的变化,并检测各组小鼠CD4+CD25-T细胞的凋亡率。ELISA法检测外周血中白细胞介素(IL)-10、IL-2、IL-4和干扰素(IFN)-γ的含量变化。结果:CLP+PC61组术后48h小鼠生存率(90%)较CLP组(60%)明显升高;CLP+PC61组CD4~+CD25~+Treg中Foxp3及CTLA-4表达恢复至正常对照组水平,与CLP组差异有统计学意义(P0.05),并且CLP+PC61组CD25表达水平最低。CLP+PC61组IL-2、IFN-γ水平显著升高,与CLP组差异明显(P0.05),但IL-4、IL-10水平较CLP组出现不同程度地下降(P0.05)。此外,CLP+PC61组效应性T细胞凋亡率明显低于CLP组(P0.05)。结论:拮抗小鼠体内调节性T细胞活性可有效地减轻脓毒症状态下效应性T细胞凋亡,提高小鼠生存率。     

急性白血病患者外周血CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞检测及其对细胞凋亡的作用

目的研究CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞在急性白血病患者外周血中的检测,并探讨其对细胞凋亡的作用。方法将65例急性白血病患者(包括急性淋巴细胞性白血病33例和急性髓系白血病32例)分为未缓解组(28例)和缓解组(37例),25例健康志愿者作为对照组。根据是否合并感染又分为合并感染组(39例)和未合并感染组(26例)。采用细胞内染色的流式细胞术及荧光定量PCR的方法,分别在蛋白质和mRNA水平检测Foxp3表达,并与正常对照组进行比较。同时,利用荧光定量PCR的方法的检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax、P53的表达。结果与正常对照相比,急性白血病患者(未缓解组和缓解组)外周血中CD4~+CD25~+Foxp3~+比例明显提高,且治疗缓解后CD4~+CD25~+Foxp3~+表达下调(P0.05)。凋亡相关基因Bcl-2表达上调,Bax、P53表达下调。结论急性白血病患者外周血CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞明显升高,并且,影响凋亡相关基因Bcl-2、Bax、P53的表达,提示CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞可能通过细胞凋亡信号通路影响急性白血病的发展。     

铁过载对小鼠脾脏CD8~+ T淋巴细胞凋亡及分泌功能的影响

目的:探讨铁过载对小鼠脾脏CD8~+T细胞凋亡及分泌功能的影响。方法:将40只C57BL/6雄性小鼠随机分为对照组、铁剂组、去铁组、抗氧化组,每组10只。腹腔注射右旋糖酐铁建立小鼠铁过载模型,观察小鼠铁负荷情况及脾脏CD8~+T淋巴细胞内可变铁池(LIP)水平,活性氧(ROS)水平;用流式细胞术检测脾脏CD8~+T细胞比例以及IFN-γ、TNF-α、Granzyme-B和perforin细胞因子的分泌情况,Annexin/PI标记流式细胞术检测CD8~+T细胞凋亡。免疫磁珠分选小鼠脾细胞获得CD8~+T细胞,RT-PCR检测CD8~+T细胞的IFN-γ、TNF-α、G ranzyme-B、perforin、BCL-2和BAX表达。结果:脾组织铁染色及流式细胞术检测均显示脾发生铁过载。与对照组相比外周血中CD8~+T细胞中ROS明显上升(108.45±9.22 vs 187.48±5.36,P0.01)。与对照组相比,铁过载组小鼠脾脏CD8~+T细胞比例明显降低(7.41±1.23)%vs(14.05±0.79)%,(P0.01)。流式细胞术检测显示,与对照组相比,铁过载组小鼠脾CD8~+T细胞IFN-γ显著降低(11.62±1.99)%vs(3.77±0.84)%,(P0.05),GranzymeB表达显著降低(11.36±1.48)%vs(5.29±1.74)%,(P0.05);小鼠脾CD8~+T细胞中IFN-γ(×10-4)表达(10.94±0.13 vs 2.19±0.78,P0.05)明显下降,Granzyme-B(×10-3)表达(7.70±0.75 vs 4.88±0.08,P0.05)明显下降。与对照组相比,小鼠脾CD8~+T细胞凋亡率明显增高(11.33±0.48)%vs(2.27±0.33)%,(P0.05);小鼠脾CD8~+T细胞中BCL-2表达(×10-3)明显下降(48.29±5.81 vs 1.17±0.21,P0.05),BAX表达(×10-2)明显上升(13.90±2.67 vs 446.93±76.64,P0.05)。上述铁过载对小鼠脾CD8~+T细胞的作用经去铁以及抗氧化治疗后可部分逆转。结论:铁过载可通过上调脾CD8~+T细胞内ROS进而上调BAX并下调BCL-2,增加CD8~+T细胞凋亡率,抑制CD8~+T细胞IFN-γ、Granzyme-B和蛋白的表达。经去铁以及抗氧化治疗后可部分逆转此作用。     

人参皂甙Rg3对糖尿病肾病大鼠肾组织Bax和B淋巴细胞瘤-2蛋白表达及肾细胞凋亡的影响

目的探讨糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)大鼠应用人参皂甙Rg3处理后肾组织Bax、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)蛋白表达变化及肾细胞凋亡情况。方法120只雄性SD大鼠,随机分为模型组、治疗组和对照组各40只。模型组、治疗组腹腔注射质量分数2%链尿佐菌素溶液制备DN模型,对照组腹腔注射等量生理盐水。造模成功后,治疗组将0.5 mg/kg人参皂甙Rg3与生理盐水混合溶液灌胃,模型组、对照组大鼠给予等量生理盐水灌胃,均1次/d,连续28 d。疗程结束后大鼠麻醉处死,取肾组织行病理检查,采用TUNEL法检测肾组织细胞凋亡,Western blot法检测肾组织Bax、Bcl-2蛋白相对表达量,实时荧光定量PCR法检测肾组织Bax mRNA、Bcl-2 mRNA相对表达量。结果对照组大鼠肾组织系膜结构、肾小管均正常,小管膜完整光滑,间质未增生;模型组大鼠肾组织系膜结构异常,间质严重增生,肾小管萎缩严重,小管膜粗糙;与模型组比较,治疗组大鼠肾组织系膜细胞增生减轻,肾小管萎缩减少,纤维组织减少;模型组、治疗组、对照组大鼠肾细胞凋亡率[(0.91±0.23)%、(0.56±0.14)%、(0.21±0.03)%]依次降低(P<0.05);模型组、治疗组、对照组肾组织Bax蛋白相对表达量(1.79±0.31、2.73±0.24、3.26±0.12)、Bcl-2蛋白相对表达量(1.42±0.12、2.59±0.25、4.40±0.31)、Bax mRNA相对表达量(0.35±0.02、1.45±0.91、3.12±1.17)、Bcl-2 mRNA相对表达量(1.34±0.87、1.73±0.67、3.91±0.75)依次增高(P<0.05)。结论人参皂甙Rg3对DN大鼠有显著治疗作用,可明显改善大鼠肾组织形态,降低肾细胞凋亡率,上调Bax、Bcl-2表达。     

EPO对心肺复苏后大鼠海马神经元的细胞凋亡、Bcl-2及Bax表达的影响

目的观察促红细胞生成素(EPO)在心肺复苏后对大鼠脑海马神经元细胞凋亡、Bcl-2和Bax表达的影响。方法雄性Wistar大鼠32只,随机分4组:正常对照组(A组)、假手术组(B组)、心肺复苏模型组(C组)、EPO干预组(D组)。C组、D组采用窒息的方法制作大鼠呼吸心跳骤停模型,后行心肺复苏治疗(CPR),D组CRP同时静脉给予EPO 3000U/kg;B组仅静脉给予等剂量生理盐水,4小时的脑海马组织,采用免疫组化法观察各组神经元细胞凋亡、Bcl-2及Bax的表达情况。结果光镜下A、B组未见凋亡细胞,C组可见较多凋亡细胞,D组凋亡细胞数少于C组(P0.01)。A、B组少量Bcl-2、Bax阳性细胞,C、D组Bcl-2、Bax阳性细胞数均高于A、B组(P0.01),D组Bcl-2阳性细胞数高于C组(P0.01),D组Bax阳性细胞数低于C组。结论心肺复苏后大鼠海马神经元的细胞凋亡明显增加,Bcl-2、Bax表达上调。EPO可抑制心肺复苏后海马神经元的细胞凋亡、上调Bcl-2表达同时下调Bax表达。