接种卡介苗对热休克蛋白65-MUC1抗原肽融合蛋白抑瘤作用的影响

目的：探讨接种卡介苗对热休克蛋白65-MUC1抗原肽融合蛋白（HSP65-MUC1）所激发的抑瘤作用的影响。方法：给经卡介苗免疫后产生HSP65抗体的小鼠注射HSP65-MUC1融合蛋白3次，然后给小鼠接种MUC1阳性的B16肿瘤细胞，观察HSP65-MUC1融合蛋白对MUC1阳性的B16肿瘤细胞在已产生HSP65抗体的小鼠体内生长的抑制作用。结果：HSP65-MUC1能够显著抑制MUC1阳性的B16肿瘤细胞在已产生HSP65抗体小鼠体内的生长，HSP65-MUC1组小鼠的肿瘤重量和体积显著地低于PBS组。结论：接种卡介苗并不影响HSP65-MUC1所激发的对MUC1阳性B16肿瘤细胞生长的抑制作用。     

C型CpG单链寡核苷酸对肿瘤疫苗抑瘤效果的增强作用

目的：研究C型CpG单链寡脱氧核苷酸（CpG ODN）对肿瘤疫苗抑瘤效果的增强作用.方法：利用体外淋巴细胞增生实验和病毒保护实验确定新C型CpG ODN, 采用小鼠体内抑瘤实验观察CpG ODN对肿瘤疫苗HSP65-MUC1重组蛋白抑制MUC1阳性肿瘤生长的增强作用, 并对小鼠血清中抗HSP65-MUC1抗体的类型进行了初步鉴定.结果：自行设计的CpG ODN BW005能刺激人PBMC和小鼠脾细胞增生,其刺激后的培养上清具有保护Vero E6细胞免受VSV感染的作用, 属于新型C型CpG ODN.将BW005与HSP65-MUC1联合应用于C57BL/6小鼠后, MUC1阳性肿瘤的发生明显延缓（平均44.8 d）, 其终末肿瘤发生率最低（33.33%）;荷瘤小鼠的生存期明显延长（平均49.5 d）, 其终末生存率最高（66.67%）.小鼠血清中抗HSP65和抗MUC1的IgG2a抗体水平增加.结论：C型CpG ODN可以增强肿瘤疫苗HSP65-MUC1的抑瘤效果, 考虑与小鼠体内Th1环境的形成有关.     

HSP70多肽复合物修饰DCs疫苗抗胰腺癌荷瘤小鼠的实验研究

目的:探讨负载热休克蛋白70多肽复合物(HSP70-PC)抗原的树突状细胞(DCs)疫苗对胰腺癌荷瘤小鼠的免疫治疗作用.方法:采用低渗裂解、ConA-Sepharose亲和层析及ADP-Agarose亲和层析法,从小鼠胰腺癌(MPC83)肿瘤组织中纯化HSP70-PC,修饰小鼠骨髓来源的树突状细胞(DCs),制备树突状细胞HSP70多肽肿瘤疫苗,用MTT法检测混合淋巴细胞反应(MLR)中HSP70-PC致敏DC对CTL的增殖及活化效果;建立MPC83荷瘤小鼠模型,观察树突状细胞HSP70多肽肿瘤疫苗对荷瘤小鼠治疗的效果和小鼠存活期.结果:经上述方法分离、纯化获得了较高纯度的HSP70-PC蛋白质;HSP70-PC在1.5～2.0 μg/ml范围内可达到刺激树突状细胞最强效果,用HSP70-PC修饰的DCs能增强T细胞的增殖和活化能力;应用树突状细胞HSP70多肽肿瘤疫苗治疗荷瘤小鼠能显著抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长,延长荷瘤小鼠存活期.结论:采用低压亲和层析柱可从胰腺癌瘤块中获得较高纯度HSP70多肽复合物,其修饰的DCs疫苗用于荷瘤小鼠免疫治疗有显著疗效,为临床胰腺癌生物免疫治疗奠定基础.     

TRAIL基因修饰的树突状细胞诱导黑色素瘤细胞凋亡的实验研究

为研究TRAIL基因修饰的树突状细胞诱导黑色素瘤细胞凋亡的作用,研究用携带TRAIL基因的重组腺病毒转染小鼠来源的树突状细胞(dendritic cell,DC),采用流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测DC TRAIL蛋白的表达水平;将DC-TRAIL与B16黑色素瘤细胞混合培养,显微镜观察细胞生长情况,FCM检测B16细胞的凋亡情况;构建小鼠黑色素瘤模型,分别将DC-TRAIL、DC和PBS皮下注射于肿瘤接种部位,观察小鼠的瘤体生长情况,测量瘤体的体积。结果显示:用Ad-TRAIL转染DC后DC可高表达TRAIL。DC-TRAIL组与DC组相比可明显诱导肿瘤细胞凋亡。用DC-TRAIL、DC和PBS处理黑色素瘤移植小鼠2周后,发现DC-TRAIL组小鼠平均肿瘤体积为(0.33±0.10)cm~3,DC组小鼠平均肿瘤体积为(1.32±0.29)cm~3,PBS组小鼠平均肿瘤体积为(3.01±0.52)cm~3。与DC组和PBS组相比,DC-TRAIL组可明显抑制肿瘤生长。     

负性刺激分子PD-L对T细胞介导小鼠L929肿瘤细胞免疫效应的影响

目的：探讨负性刺激分子在肿瘤细胞逃避免疫效应中的作用.方法：以L929细胞为靶细胞,体内致敏C57BL/6小鼠,注入PD-L1、PD-L2抗体阻断,并设立未致敏对照组.分离小鼠脾细胞,体外采用3H-TdR掺入法、荧光标记双染色FCM以及PI染色FCM法分别检测淋巴细胞增殖反应、活化诱导的细胞凋亡以及脾细胞及其培养上清对肿瘤细胞的杀伤效应.结果：L929细胞表达PD-L1,而不表达PD-L2.体内与体外联合应用PD-L1抗体,能显著增强L929肿瘤细胞诱导的致敏组小鼠脾细胞的增殖活性和特异性杀伤效应,并可抑制活化诱导的T细胞凋亡;PD-L1抗体亦可增加L929细胞诱导的未致敏组小鼠脾细胞的增殖活性和促进其脾细胞培养上清对L929细胞的杀伤效应.结论：PD-L1抗体可通过阻断PD1/PDL途径促进初始T细胞和致敏T细胞介导的抗瘤效应.     

HSP65-MUC1 VNTR2融合蛋白的表达、纯化及其抗肿瘤作用

目的：通过基因工程手段在大肠杆菌中表达HSP65-MUC1 VNTR：融合蛋白、鉴定和纯化，并研究其在动物体内的肿瘤生长抑制活性。方法：通过PCR获得结核分支杆菌HSP65基因，以重叠PCR获得人MUC1基因VNTR的2个重复序列，构建原核重组表达载体HSP65-MUC1 VNTR2-pET28a（＋）。在大肠杆菌BL21（DE3）中利用IPTG诱导表达；利用单克隆抗体（mAb）进行Western blot鉴定，以Q柱和凝胶过滤纯化获得纯化蛋白。通过建立转染人MUC1基因的B16黑色素瘤小鼠肿瘤模型，在C57BL／6小鼠体内研究HSP65-MUC1 VNTR，融合蛋白的肿瘤生长抑制活性。结果：获得的结核分支杆菌HSP65基因和人MUC1基因VNTR区的2个重复片段，经测序证明分别与GenBank中结核杆菌HSP65基因和人MUC1基因的VNTR完全相符；构建的原核表达载体HSP65-MUC1 VNTR2-pET28a（＋）可稳定的可溶性表达HSP65-MUC1VNTR2蛋白；经Q柱和凝胶过滤纯化，纯化的目的蛋白纯度达95％以上；利用鼠抗人MUC1mAb对表达蛋白进行验证，结果阳性；小鼠肿瘤预防免疫实验表明，实验组小鼠抑瘤率大于对照组，且具有明显性差异。结论：成功地利用原核表达系统实现了对HSP65-MUC1 VNTR2蛋白的可溶性表达，并对其体内预防实验进行了初步研究，证明该融合蛋白能明显抑制表达MUC1的肿瘤生长。为进一步评价其作为肿瘤疫苗可能性的研究打下了基础。     

喉癌来源黑色素瘤抗原A3在小鼠黑色素瘤细胞模型的表达

目的:建立pIRES2-EGFP/MAGE-A3真核质粒在小鼠黑色素瘤B16细胞稳定表达的肿瘤细胞模型。方法:将喉癌来源的黑色素瘤抗原A3(Melanoma-associated antigen A3,MAGE-A3)构建成真核质粒pIRES2-EGFP/MAGE-A3,脂质体法将pIRES2-EGFP/MAGE-A3转染小鼠黑色素瘤B16细胞,G418筛选阳性克隆,荧光显微镜检测阳性克隆中增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)的表达,荧光定量PCR(qRT-PCR)检查MAGE-A3在B16细胞中的转录。结果:pIRES2-EGFP/MAGE-A3真核质粒转染B16细胞后筛选得到阳性克隆,可见融合蛋白表达产生明亮的绿色荧光,qRT-PCR可检测到MAGE-A3 mRNA的转录。结论:pIRES2-EGFP/MAGE-A3真核质粒通过脂质体法能有效转染,并在B16稳定表达,成功建立了MAGE-A3肿瘤细胞模型。     

人乳腺癌疫苗HSP65-HER2联用CpG684的抗肿瘤作用

目的:检测人乳腺癌融合蛋白疫苗HSP65-HER2联用CpG684的抗肿瘤效果。方法:C57BL/6小鼠分别皮下注射PBS,CpG684,HSP65-HER2和CpG684混合物,一周一次,共三次,随后给小鼠腹腔接种7.5×104个转染了pcDNA3-GFP-HER2质粒的B16肿瘤细胞(HER2+B16),监测各组小鼠的生存期至接种肿瘤后70天。结果:免疫了HSP65-HER2和CpG684的小鼠在接种肿瘤后70天时,仍有80%存活,而GpG684组的小鼠仅有10%存活,PBS组小鼠在接种肿瘤后36天后全部死亡。与PBS和CpG684对照组相比,免疫了HSP65-HER2和CpG684的小鼠的生存期显著延长(P<0.01)。结论:HSP65-HER2联用CpG684在体内发挥了强大的抗肿瘤活性,为进一步的临床研究和应用奠定了基础。     

HPV16E7E6抗原表位嵌合体DNA抗肿瘤疫苗的研究

目的:探讨HPV16 E7、E6抗原表位与HSP70 N端重组DNA疫苗抗肿瘤活性.方法:以重叠PCR将HPV16 E7基因N端60个氨基酸的编码序列与E6基因的10个(48～57)氨基酸的编码序列及HSP70 N端序列进行融合.以pcDNA3.0为载体,构建真核表达载体pcD-E76HSP.重组质粒免疫C57BL/6小鼠后,通过淋巴细胞增殖实验和细胞毒性杀伤实验研究该疫苗激发的细胞免疫反应及反应强度;观察该疫苗对C57BL/6小鼠TC-1肿瘤细胞移植瘤的治疗效果.结果:重组DNA疫苗免疫C57BL/6小鼠后,小鼠脾淋巴细胞体外增殖明显,并可诱导产生针对TC-1肿瘤细胞的特异性CTL反应;体内抑瘤试验显示该疫苗对HPV16病毒转化的TC-1细胞小鼠移植瘤的生长有抑制作用.结论:该疫苗能激发特异性细胞免疫反应,显著抑制HPV16转化的TC-1肿瘤细胞生长.     

抗原特异性调节性T细胞的诱导及其对粥样斑块形成的影响

目的：探讨抗原特异性CD4^＋CD25^＋T细胞的体外诱导及其对动脉粥样硬化斑块形成的影响。方法：从apoE^-/-小鼠骨髓提取并培养出未成熟树突状细胞，体外诱导热休克蛋白60特异性调节性T细胞；通过混合淋巴细胞反应研究CD4^＋CD25^＋T细胞的特异抑制性；过继转移CD4^＋CD25^＋T细胞后，观察小鼠动脉粥样斑块的形成状况。结果：阿司匹林处理的树突状细胞共刺激分子CD80和CD86表达减少；未成熟树突状细胞比成熟树突状细胞能诱导更多的特异性CD4^＋CD25^＋T细胞，后者在体外能明显抑制效应性T细胞的增殖和IFN-γ的产生；过继HSP60特异性CD4^＋CD25^＋T细胞组小鼠斑块面积较小。结论：未成熟树突状细胞可诱导出抑制功能强大的HSP60特异性CD4^＋CD25^＋T细胞，后者在体内能明显抑制斑块的形成。     

HPV 16 E6E7基因修饰树突状细胞疫苗诱导CTL致CaSki细胞凋亡体外实验研究

目的:采用人乳头状瘤-16(HPV-16)E6E7重组腺病毒(pAd-E6E7)转染树突状细胞(Dendritic cell,DC),观察基因修饰的DC疫苗诱导细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic Tlymphocyte,CTL)致使CaSki细胞凋亡的效果。方法:将pAd-E6E7转染体外培养的小鼠未成熟树突状细胞制备DC疫苗,激光共聚焦显微镜观察转染的小鼠未成熟树突状细胞绿色荧光蛋白表达,流式细胞术检测转染前后小鼠树突状细胞表面标志物(CD40、CD86、MHCⅡ和CD11C)。DC疫苗诱导产生特异性细胞毒性T淋巴细胞,与CaSki细胞共培养后,采用DAPI、TUNEL及流式细胞术检测CaSki细胞凋亡情况。结果:pAd-E6E7成功转染体外培养的小鼠未成熟树突状细胞,体外转染效率约为40%～50%,成功制备了HPV16 E6E7基因修饰树突状细胞疫苗,诱导产生细胞毒性T淋巴细胞,经DAPI、TUNEL及流式细胞术检测证明CaSki出现凋亡。结论:以带有HPV16 E6E7基因的重组腺病毒载体转染DC制备基因修饰的DC疫苗,诱导CTL致使CaSki细胞出现凋亡。     

ImmunoAIF△1-480融合蛋白对HER2阳性肿瘤细胞的杀伤作用

目的:观察免疫促凋亡分子ImmunoAIF△1-480对HER2阳性肿瘤细胞的杀伤作用.方法:利用PCR的方法将九聚精氨酸编码序列(R9)与AIF C-末端结构域编码区重组, 然后将R9-AIF△1-480基因与pCMV-e23sFv载体重组, 构建免疫促凋亡分子ImmunoAIF△1-480真核表达载体.用脂质体法转染CHO细胞, 经G418筛选, 建立稳定转染的细胞株, 通过RT-PCR、Western blot、流式细胞术(FCM)等方法检测重组基因在转染细胞中的表达及其对HER2阳性肿瘤细胞的特异性杀伤活性.结果:经过酶切鉴定与测序证实, 带有ImmunoAIF△1-480基因的真核表达载体构建成功, 经RT-PCR、Western blot可检测到培养上清中免疫促凋亡基因的表达, 用FCM检测发现融合蛋白ImmunoAIF△1-480对HER2阳性肿瘤细胞SGC-7901和SKBR-3有明显的促凋亡活性, 而对不表达HER2分子的ECV-304细胞几乎没有影响.结论:ImmunoAIF△1-480可以特异性杀伤HER2阳性肿瘤细胞.     

HLA-A*0201/Kb及MAGE-3基因共转染B16细胞的制备及其在MAGE-3肿瘤疫苗评价中的作用

目的:为了用HLA-A2.1转基因鼠制备荷瘤模型以评价肿瘤疫苗的免疫效果,制备共表达HLA-A*0201/Kb嵌合基因和MAGE-3的B16黑色素瘤细胞.方法:采用基因共转染的方法,将HLA-A*0201/Kb和MAGE-3转染到B16黑色素瘤细胞(B16-HLA-MAGE-3),利用RT-PCR、流式细胞术(FCM)和Western blot检测了HLA-A*0201/Kb和MAGE-3在B16黑色素瘤中的表达;通过测定CTL活性和体内抑瘤实验证实肿瘤抗原MAGE-3可以在B16-HLA-MAGE-3中得到有效加工处理和提呈.结果:RT-PCR、FCM和Western blot检测到HLA-A*0201/Kb和MAGE-3在B16-HLA-MAGE-3黑色素瘤中的表达;LDH的方法观察到MAGE-3疫苗免疫小鼠脾细胞对B16-HLA-MAGE-3细胞的特异性CTL反应,抑瘤实验也证实,B16-HLA-MACE-3细胞在免疫小鼠体内生长明显受到抑制.结论:MAGE-3基因在B16-HLA-MAGE-3黑色素瘤细胞中得到表达,并被有效的加工处理、提呈给特异性CD8 T细胞;B16-HLA-MAGE-3细胞可以用来制备荷瘤模型,且该方法适合利用转基因小鼠用于人表位疫苗的体内评价.     

表达CRT-E2融合蛋白肿瘤疫苗诱导特异性抗肿瘤免疫应答

目的:探讨表达钙网蛋白(Calreticulin,CRT)和HPV E2融合蛋白的肿瘤疫苗在小鼠体内诱导的抗肿瘤免疫应答.方法:转染重组质粒得到高表达CRT、E2和CRT-E2融合蛋白的肿瘤细胞,作为肿瘤疫苗隔周两次腹腔注射免疫小鼠,17天后观察成瘤率,检测NK细胞杀伤活性、特异性T细胞增殖能力、CIL活性以及睥淋巴细胞分泌IFN-γ水平,并观察荷瘤小鼠生存期.结果:高表达CRT-E2融合蛋白肿瘤疫苗免疫小鼠后,其成瘤率明显低于其他实验组,NK细胞杀伤活性、特异性T细胞增殖能力、CTL活性和脾淋巴细胞分泌IFN-γ水平均显著高于其它实验组(P＜0.01),生存期也明显延长(P＜0.01).结论:小鼠体内实验显示,表达CRT-E2融合蛋白肿瘤疫苗能够诱导特异性CD8+T细胞免疫应答和NK细胞活性,显著抑制了肿瘤生长.     

Hsp70L1增强肿瘤细胞疫苗免疫原性的研究

目的:考察Hsp70L1对肿瘤细胞免疫原性的增强作用。方法:用RT-PCR的方法,从小鼠黑色素瘤B16细胞和C57BL/6小鼠脾脏中获得TRP2153-243及Hsp70L1基因。分别插入pcDNA3.1/V5-His真核表达载体,构建pHSP70L1、pTRP和pTRP2-Hsp3种表达载体。分别转染B16肿瘤细胞并制备坏死或凋亡瘤苗,免疫C57BL/6小鼠后移植B16肿瘤细胞,观察肿瘤生长曲线,采用流式细胞术(FCM)或微量细胞毒的方法检测荷瘤小鼠细胞因子INF-γ和CTL活性。结果:将经过HSP70L1、TRP2及TRP2-HSP基因修饰的坏死或凋亡的B16肿瘤细胞免疫正常小鼠后,观察到Hsp70L1及TRP2-Hsp基因修饰的坏死瘤苗可显著抑制荷瘤鼠肿瘤的生长,并显著促进荷瘤鼠脾脏淋巴细胞CTL活性和IFN-γ产生(P0.05,P0.01);HSP70L1免疫刺激作用在坏死瘤苗中更明显。结论:Hsp70L1可明显提高B16瘤苗的免疫原性,且对坏死细胞瘤苗的作用更显著。     

人颗粒酶B融合蛋白对转染的HeLa细胞的作用

目的 观察颗粒酶B（granzyme B)融合蛋白对转染的HeLa细胞的作用。方法 用RT－PCR法获取人granzyme B全长cDNA，经重组PCR将活性型序列的5′端与一段PE转膜肽序列融合。将所获重组基因克隆入绿色荧光蛋白（GFP）共表达载体pIRES2-EGFP,转染HeLa细胞。用免疫组化染色法检测目的蛋白的表达，荧光显微镜和电镜观察转染细胞的形态和结构。结果 成功地获得了野生型granzyme B cDNA及其融合蛋白基因，并构建了融合蛋白基因与GFP基因共表达的真核载体。转染HeLa细胞后，检测到目的蛋白的表达。荧光显微镜观察转染细胞有两种变化：一种表现为体积增大并常伴随多核现象；另一种出现细胞质和细胞核的固缩。电镜观察显示，多核巨细胞生长状态良好，固缩的小细胞则呈现凋亡的典型特征。结论 granzyme B融合蛋白在HeLa细胞中异位表达，可使转染细胞的形态发生变化，出现多核的大细胞和核固缩的小细胞。     

新型细胞因子IL-24真核表达载体的构建、表达及其对肿瘤的抑制作用

目的：构建IL-24真核表达质粒，并研究其体内外表达对肿瘤细胞的生长抑制作用。方法：采用重组DNA技术构建IL-24真核表达质粒pEGFP-C1-IL-24。用脂质体法将重组质粒及空载体外转染HIC细胞，再经激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）观察其表达，用MTT法检测HIC细胞的体外增殖能力，用流式细胞仪检测细胞周期与凋亡。小鼠皮下接种转染IL-24真核表达质粒或空载的B16细胞观察其体内致瘤性的变化。小鼠实体瘤模型研究基因转染对肿瘤的生长抑制作用。结果：pEGF-C1-IL-24转染HIC细胞后，LSCM可观察到其表达。IL-24基因转染的HIC细胞体外增殖能力明显受到抑制．G2-M期细胞比例增高，细胞被阻滞在G2-M期。转染IL-24的B16细胞体外致瘤率降低。与对照组相比．IL-24基因治疗组肿瘤生长明显受到抑制（P〈0.05）。结论：IL-24基因转染的肿瘤细胞体外生长受抑。瘤内注射pEGFP-C1-IL-24可抑制肿瘤生长，具有明显的抗肿瘤作用。     

树突状细胞靶向性DNA疫苗的抗肿瘤免疫效应

目的:构建含OVA-Fc融合基因并对树突状细胞具有靶向性的DNA疫苗,评价其在肿瘤治疗中的作用。方法:构建真核表达载体OVA-Fc-pcDNA3.1,以脂质体转染法将其导入CHO细胞,用流式细胞术和ELISA法检测融合蛋白OVA-Fc的表达。建立E.G7-OVA荷瘤小鼠模型,用51Cr释放实验测定免疫小鼠脾脏细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的抗肿瘤活性。通过观察荷瘤小鼠肿瘤的体积和生存期评价该肿瘤疫苗的疗效。结果:酶切鉴定和序列测定证明,真核表达载体OVA-Fc-pcDNA3.1构建正确。用流式细胞术和ELISA法均表明,转染的CHO细胞能表达OVA-Fc融合蛋白。OVA-Fc能激发CTL的杀伤活性,发挥抗肿瘤作用,从而减缓肿瘤的生长,延长荷瘤小鼠的生存期。结论:含OVA-Fc-pcDNA3.1的树突状细胞靶向性DNA疫苗能在体内有效地激发抗瘤免疫应答,为进一步开展临床实验奠定了基础。     

致敏树突状细胞活化细胞毒性T细胞抗肿瘤作用的研究

目的：研究树突状细胞（DCs）激活的细胞毒性T细胞的抗肿瘤及预防肿瘤发生的作用。 方法： 细胞因子诱生人PBMC未成熟DCs，加入肿瘤细胞抗原提取物致敏DCs产生成熟DCs；通过细胞形态、表面标记鉴定成熟DCs，MTT法测成熟DCs活化的细胞毒性T细胞(CTL)的体外杀伤活性；裸鼠体内注射活化CTL观察其抑制移植瘤生长及发生的作用。 结果： 经过7 d培养，获得大量形态典型、具有强烈刺激增殖能力、高表达CD80(63.5%)、CD83（67.6%）和CD3/ HLA-DR(83.2%)的DCs。其活化的CTL在20∶1效靶比时对抗原来源细胞株自身的杀伤率达75%以上，对同系细胞株的杀伤活性为35%-45%，对其它种系肿瘤细胞仅有微弱杀伤力（P<0.01）。CTL对裸鼠结肠癌HT-29移植瘤有特异性的生长抑制和预防生成作用（P<0.05）。CTL治疗组肿瘤组织中PCNA表达水平显著低于对照组（P<0.05）。 结论： 肿瘤细胞抗原活化的DC诱导CTL对肿瘤有特异性的杀伤作用，体内应用可特异性抑制移植结肠癌的生长或预防小鼠结肠癌移植瘤的发生。     

CRT-E2-EGFP表达、胞内定位及其对B16细胞凋亡的影响

目的:观察CRT-E2融合蛋白在小鼠黑色素瘤B16细胞中的表达及其定位,并探讨CRT引起的E2蛋白表达定位改变对B16细胞增殖及调亡的影响.方法:构建荧光真核表达载体pEGFP-CRT、pEGFP-E2、pEGFP-CRT-E2,将上述载体以及空载体pEGFP-C1经脂质体瞬时转染B16细胞,West-em blot分析确认目的蛋白表达.荧光显微镜下观察CRT-E2融合蛋白在细胞中表达定位;流式细胞术检测不同重组表达载体转染B16细胞24 h、48 h后,对细胞周期的影响和诱导凋亡的情况.结果:CRT-E2融合蛋白在B16细胞中正确表达,主要分布于细胞质,能将细胞阻滞于G1期,有效诱导肿瘤细胞发生凋亡(P<0.01).结论:成功构建CRT-E2真核表达载体,外源性CRT能够引起E2蛋白表达定位于细胞质,并明显促进了肿瘤细胞的调亡.