反义6A8cDNA转染肿瘤细胞生物学行为的研究

目的 探讨反义６Ａ８对肿瘤细胞恶性行为的影响。方法 选用来自人鼻咽癌细胞系ＣＮＥ－２Ｚ的高转移克隆ＣＮＥ－２１２细胞,分别用ｐＲＣ／ＣＭＶ－反义６４８ｃＤＮＡ表达载体及空质粒转染并检测了反义６Ａ８ｃＤＮＡ转染,空载体转染及未转染细菌自身及基质的粘附性,运动性和水解酶活性,体外侵袭性及体内生长转移能力。     

抗小鼠IL-2R单克隆抗体的制备及初步应用

目的：制备抗小鼠白细胞介素２受体（ＩＬ－２Ｒ）单克隆抗体（ＭｃＡｂ）。方法：利用杂交瘤技术获得杂交瘤细胞株，并用细胞ＥＬＩＳＡ方法筛选阳性克隆。结果：得到３株分泌抗小鼠ＩＬ－２ＲＭｃＡｂ的杂交瘤细胞株，其中８Ｃ８对ＣｏｎＡ刺激淋转有抑制作用，且ｓＩＬ－２Ｒ可抑制８Ｃ８与ＩＬ－２Ｒα阳性细胞的结合。结论：８Ｃ８是抗小鼠ＩＬ－２Ｒα抗体。     

人分泌型白细胞介素2受体α链基因的克隆及其在真核细胞中的表达

删除人白细胞介素－２受体α链ｃＤＮＡ中编码胞质内１３个氨基酸及跨膜区１９个氨基酸残基的ＤＮＡ片段后，接上人工合成的终止寡核苷酸片段，改建后的ｃＤＮＡ与真核表达载体ｐＲｃ／ＣＭＶ重组成质粒ｐＣＭＶ／ｒｓＩＬ２Ｒ。用电打孔及磷酸钙法将此质粒转染ＣＨＯ细胞，经Ｇ４１８筛出表达Ｎｅｏ基因的克隆２０株，通过ｍＲＮＡ狭缝杂交及ＥＬＩＳＡ检测，有５株能稳定表达分泌型α链ｍＲＮＡ及蛋白，其中４株细胞培养上清中的ＩＬ２Ｒα链的含量达１４００Ｕ／ｍｌ以上。     

抗小鼠Ⅱ—2R单克隆抗体的制备及初步应用

目的：制备抗小鼠白细胞介素２受体（ＩＬ－２Ｒ）单克隆抗体。方法：利用杂交瘤技术获得杂交瘤细胞株，并用细胞ＥＬＩＳＡ方法筛选阳性克隆。结果：得到３株分泌抗小鼠Ⅱ－２ＲＭｃＡｂ的杂交瘤细胞株，其中８Ｃ８对ＣｏｎＡ刺激淋转有抑制作用，且ｓＩＬ－２Ｒ可抑制８Ｃ８与ＩＬ－２Ｒα一细胞的结合。结论：８Ｃ８是抗小鼠ＩＬ－２Ｒ抗体。     

人分泌型白细胞介素2受体α链基因的克隆及其在真核细胞…

删除人白细胞介素－２受体α链ｃＤＮＡ中编码胞质内１３个氨基酸及跨膜区１９个氨基酸残基的ＤＮＡ片段后，接上人工合成的终止寡核苷酸片段，改建后的ｃＤＮＡ与真核表达载体ｐＲｃ／ＣＭＶ重组成质粒ｐＣＭＶ／ｒｓＩＬ２Ｒ。用电打孔及磷酸钙法将此质粒转染ＣＨＯ细胞，经Ｇ４１８筛出表达Ｎｅｏ基因的克隆２０株，通过ｍＲＮＡ狭缝杂交及ＥＬＩＳＡ检测，有５株能稳定表达分泌型α链ｍＲＮＡ及蛋白，其中４株细胞培养上清中的Ｉ     

重组人β—防御素基因在COS—7细胞的转染表达

为探索建立持续稳定表达ｈＢＤ－２的哺乳类动物工程细胞的可能性,作者研究构建真核重组表达载体ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ／ｈＢＣ－２以进行ＣＯＳ－７细胞转染表达实验。将本室克隆获得的ｈＢＤ－２全长ｃＤＮＡ片段插入带有报告基因的真核表达质粒ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ构建出ｈＢＤ－２的重组表达载体ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ／ｈＢＤ－２,并经ＤＮＡ测序证明ｈＢＤ－２ｃＤＮＡ片段的插入方向和其全长ｃＤＮＡ的碱基组成顺序均准确无误。通过脂质体转染法将ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ／ｈＢＤ－２导入ＣＯＳ－７细胞。ＲＴ－ＰＣＲ法和免疫印迹法分别从ｍＲＮＡ水平和蛋白质水平检测到被转染的ＣＯＳ－７细胞系能有效表达ｈＢＤ－２。     

维甲酸改变人肝癌细胞表面N－糖链的结构及其酶学机制

用３Ｈ－甘露糖标记７７２１人肝癌细胞表面糖蛋白的Ｎ－糖链，经提取和去唾液酸后，用ＣｏｎＡ和ＤＳＡ亲和柱顺序层析将３Ｈ－标记的Ｎ－糖链分成４个类型和天线数不同的组分来研究维甲酸（ＲＡ）对细胞表面Ｎ－糖链的影响。结果：１０μｍｏｌ／ＬＲＡ处理细胞３～５ｄ后，可使Ｃ２Ｃ２二天线复杂型Ｎ－糖链增加，而高甘露糖型及三、四天线，特别是带有Ｃ２，６分支结构的复杂型Ｈ－糖链减少。用ＬＣＡ亲和柱还证明二天线糖链中的核心岩藻糖也减少。进一步发现上述改变的酶学机制是ＲＡ降低Ｎ－乙酰氨基萄葡糖转移酶Ｖ和α－１，６－核心岩藻糖转移酶的活力。结论：ＢＡ通过改变某些糖基转移酶活力而改变细胞表面糖链结构，这可能是ＲＡ使７７２１细胞诱导分化的机理之－。     

心血管疾病基因治疗的基础研究Ⅱ．Pro－UK和t－pA基因的体外表达

构建了带有人的全长Ｐｒｏ－ＵＫ或ｔ－ｐＡ基因ｃＤＮＡ的逆转录病毒质粒ｐＮ２－ＣＭＶ－ＵＫ或ｐＮ２－ＣＭＶ－ｔＰＡ。重组质粒转染包装细胞ＰＡ３ｌ７后获得含假病毒的培养上清。用假病毒上清感染培养的血管平滑肌细胞（ＶｓＭＣ），经Ｇ４ｌ８筛选得到抗性集落。Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析表明，Ｐｒｏ－ＵＫ或ｔ－ｐＡ基因已整合到宿主细胞染色体。在转染的ＶＳＭＣ中，Ｐｒｏ－ＵＫ和ｔ－ｐＡ的含量分别为２６５ｎｇ／１０７细胞／２４小时和５．６ｎｇ／１０７细胞／２４小时。溶圈法测定结果证明，Ｐｒｏ－ＵＫ基因导入细胞后可以表达出有生物活性的尿激酶原。     

黑素瘤抑制蛋白启动子在小鼠体内的表达活性

目的;观察黑素瘤抑制蛋白（ＭＩＡ／ＣＤ－ＲＡＰ）启动子在小鼠体内的表达活性。方法：利用ＰＣＲ技术扩增２．２ｋｂ的ＭＩＡ／ＣＤ－ＲＡＰ启动子,分子克隆技术构建ＭＩＡ启动子－半乳糖苷酶（２．２１ａｃＺ）载体,显微注射法将纯化的２．２ｌａｃＺ ＤＮＡ注入来自Ｂ６ＳＪＬ杂交小鼠受精卵的原以制备转基因小鼠。提取幼鼠尾ＤＮＡ,用ｌａｃＺ特异性引物筛选阳性转基因小鼠。结果：８只首建小鼠以体基因组整合有２．２ｌａ     

构建人白细胞介素2逆转录病毒载体和包装细胞

目的：构建人白细胞介素２（ｈＩＬ－２）逆转录病毒载体及包装细胞。方法：用基因重组法将ｈＩＬ－２ｃＤＮＡ与ｐＬＮＣＸ重组成正义和反义ＬＮＣＩＬ－２基因。用磷酸钙－甘油法及感染法将ＬＮＣＩＬ－２基因转入ＰＡ３１７包装细胞内。所得克隆Ａ８的ｈＩＬ－２分泌量，ＤＮＡ、ＲＮＡ分别用ＥＬＩＳＡ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交法分析。结果：Ａ８分泌的ｈＩＬ－２量为８．４ｎｇ·（２４ｈ·１０６细胞）１，ｈＩＬ－２基因完整地整合到转导细胞基因组内并有ｈＩＬ－２ｍＲＮＡ表达，细胞上清内病毒滴度为１０６·ＣＦＵ·ｍｌ１。结论：本研究成功地构建编码ｈＩＬ－２的逆转录病毒载体，并筛选出能产生病毒粒子、分泌ｈＩＬ－２的包装细胞。     

6A8 α—甘露糖苷酶酶解p—nitrophenyl—α—D—mannopyranoside

目的：明确6A8 cDNA编码蛋白质的α－甘露糖苷酶性质。方法：利用基因重组技术将克隆到的3个DNA片段拼接成完整6A8 cDNA,将其插入到真核表达载体pCDI,转染COS－7细胞,用酶活性检测与Western blot对瞬时表达的蛋白质的性质进行鉴定。结果：拼接后的cDNA片段经测序完全符合6A8 cDNA碱顺序。转染重组表达载体pCDI-6A8的COS－7细胞的匀浆对p-nitrophenyl-α－D-mannopyranoside的酶解作用为转染空载体pCDI的细胞及野生型细胞的3－4倍,且这种酶解作用不能被swainsonine所抑制。Western blot检测显示在相对分子质量（Mr)120000处有一明显蛋白带,此带的显影于转染pCDI-6A8 cDNA的细胞明显深盂民染空载pCDI及野生型细胞。结论：6A8 cDNA编码的蛋白质确为一种α－甘露糖苷酶,属于Ⅱ类α－甘露糖苷酶。     

6A8 α—甘露糖苷酶表达低下致人鼻咽癌细胞CNE—2L2生长抑制

目的：研究6A8 α-甘露糖苷酶与CNE－2L2肿瘤细胞生长的关系。方法：用腺相关病毒载体将反义6A8 cDNA导入鼻咽癌细胞CNE－2L2。细胞中6A8 α-甘露糖苷酶表达情况用单抗6A8a免疫荧光染色、α－甘露糖苷酶添生及ConA结合试验检测。以野生型细胞、转导了空载体或正义6A8的细胞作对照,以MTT、集落形成及裸鼠实验检测肿瘤细胞生长。结果：转导反义6A8能抑制CNE－2L2细胞6A8 α-甘露糖苷酶表达,6A8 α－甘露糖苷酶表达抑制的CNE－2L2细胞的MTT值、形成集落数及接种裸鼠皮下后所长肿瘤的重量均较对照显著降低可减小（P＜0．001）。结论：6A8 α－甘露糖苷酶表达低下致人鼻咽癌细胞CNE－2L2生长抑制。     

6A8α—甘露糖苷酶表达对人B淋巴细胞3D5增殖反应的影响

目的观察 6A8α-甘露糖苷酶表达对人 B细胞株 3D5增殖反应的影响。方法以重组腺相关病毒颗粒为载体,将正义 6A8 DNA或反义 6A8 DNA转导入 EB病毒转化的人 B细胞株 3D5,用单抗 6A8a染色反应和 Con A结合试验确认 6A8α-甘露糖苷酶高表达和低表达。以野生型细胞及转导空载载体的细胞作对照, MTT法检测细胞对 B细胞生长因子（ BCGF）、葡萄球菌 Cowen I（ SAC）或 IL- 6刺激的增殖反应。结果转导正义 6A8 DNA的细胞高表达 6A8α-甘露糖苷酶,转导反义 6A8 DNA的细胞低表达 6A8α-甘露糖苷酶。转导正义 6A8 DNA的 3D5细胞在 SAC诱导下的增殖反应明显增强（ P< 0.05）,但转导反义 6A8 DNA细胞的增殖反应无变化。对低分子量 BCGF或 IL- 6诱导的刺激,转导正义 6A8或反义 6A8对细胞的增殖反应均无影响。结论 6A8α-甘露糖苷酶活性增高使 3D5细胞对 SAC刺激的增殖反应增强。 6A8α-甘露糖苷酶活性变化对低相对分子质量 BCGF或 IL- 6诱导的增殖反应无影响。     

ER α-甘露糖苷酶表达降低引起大鼠肝脏上皮细胞微绒毛减少变短

目的：观察蛋白质糖基化改变对大鼠肝脏上皮细胞WB-F344表面微绒毛及在培养中生长的影响。方法：构建含正义或反义6A8 DNA的重建pAGX( )质粒,用脂质体法将重组质粒或空载质粒转染WB-F344细胞,作G418筛选,以有限稀释法作细胞克隆,进行PCR检测新霉素抗性（neo^H）基因以确定转染DNA在细胞基因组中的整合;用P-nitrophenyl-α-D-mannopyranoside作底物检测细胞匀浆上清中ER α-甘露糖苷酶的活性;采用扫描电镜观察细胞表面的微绒毛,并做生长曲线检测。结果：转染反义6A8的各WB-F344克隆细胞株的匀浆上清中,ER α-甘露糖苷酶活性有不同程度降低,其中以克隆AS1与AS2的降低最明显。克隆AS1与Con A结合增强,表面微绒毛减少、变短,细胞增殖减慢。结论：大鼠肝脏ER α-甘露糖苷酶表达抑制所致的蛋白质糖基化改变,可导致大鼠肝脏上皮细胞WB-F344微绒毛减少、变短,细胞生长速度减慢。     

6A8 α-甘露糖苷酶表达减弱抑制鼻咽癌细胞CNE-2L2 转移的分子机制

目的 探讨6A8 α-甘露糖苷酶表达抑制对鼻咽癌细胞CNE-2L2间粘附性、细胞表达E-cadherin及对细胞接种裸鼠皮下所生长肿瘤肺转移的影响。方法 软琼脂培养观察非锚定状态下细胞间的粘附;间接免疫荧光染色、免疫组化染色及RT-PCR检测E-cadherin的表达;CNE-2L2细胞接种裸鼠皮下,8周后病理切片检测所长肿瘤肺转移程度。结果 6A8 α-甘露糖苷酶表达抑制的CNE-2L2细胞(AS)在非锚定状态下发生粘附,此粘附对Ca^2 有依赖性。野生型CNE-2L2细胞弱表达E-cadherin,但AS细胞的E-cadherin表达明显增强。E-cadherin表达增强既见于蛋白质水平,也见于mRNA水平。AS细胞接种裸鼠皮下所长肿瘤的肺转移明显受抑。结论 6A8 α-甘露糖苷酶表达抑制使CNE-2L2细胞间的粘附性增强,细胞表面E-cadherin表达增强,细胞接种裸鼠皮下所长肿瘤的肺转移明显受抑。     

FHIT基因转染对人结肠癌细胞系SW480增殖和侵袭力的影响

目的 探讨真核表达质粒pRc/CMV2-FHIT对结肠癌细胞株SW480增殖和侵袭活性的影响。方法 将携有FHIT基因的重组真核表达质粒pRc/CMV2-FHIT转化大肠杆菌DH5α并扩增,抽提纯化质粒并进行酶切鉴定,pRc/CMV2-FHIT体外转染SW480细胞（SW480-FHIT）,筛选稳定转染的细胞并扩增培养,以转染了空质粒pRc/CMV2的SW480细胞（SW480-pRc/CMV2）和正常SW480细胞为对照,用RT-PCR检测FHIT的表达情况,并用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT法）和细胞侵袭实验分别检测FHIT基因转染前、后SW480细胞增殖和侵袭活性的变化。结果 pRc/CMV2-FHIT的酶切鉴定证实含有目的基因FHIT;SW480-FHIT细胞的RT-PCR产物经凝胶电泳有明显的阳性条带,而对照组则无;MTT实验结果显示重组质粒转染组SW480细胞的增殖明显受到抑制;Transwell体外侵袭实验显示转染pRc/CMV2-FHIT能明显抑制SW480细胞的体外侵袭力(P<0.01)。结论 应用基因转染技术重表达FHIT基因能有效抑制细胞的生长、增殖及侵袭活性,为以FHIT为靶向的结肠癌基因治疗提供了新的思路和手段。     

中国人Brugada综合征SCN5A基因突变K317N的定点诱变及其载体构建

目的 对我们发现的中国人Brugada综合征新的SCN5A基因突变K317N进行体外定点诱变研究，并构建携带有基因突变K317N的pRc／CMV-hH1的表达载体。方法 采用PCR定点突变技术，根据突变位置附近的两个单一限制性内切酶位点AgeI／Sse83871设计一对定点诱变引物，将突变位点设计在引物上，通过PCR扩增，使扩增片段上含有所需要的突变位点，最后将扩增片段克隆人pRc／CMV-hH1载体中。结果 DNA测序表明，在预期位点巳经发生突变，SCN5A基因在第317密码子由赖氨酸(K)突变为天冬氨酸(N)，成功实现定点诱变。结论 PCR技术诱导定点突变，准确、高效。pRc／CMV-hH1(K31714)的成功构建，为进一步进行该突变的结构与功能研究奠定了基础。     

人转铁蛋白受体特异性单克隆抗体的研制及其初步鉴定

目的 建立能分泌人转铁蛋白受体(TfR)特异性抗体的杂交瘤细胞株,并对其分泌的抗体进行初步鉴定. 方法 将人肝癌细胞株HepG2分离纯化的TfR蛋白,采用常规法免疫BALB/C小鼠;采用间接ELISA法测定免疫血清抗体效价;采用常规聚乙二醇(PEG)介导法,将免疫小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0融合,用含HAT培养基筛选杂交瘤细胞;采用间接ELISA和Cell-ELISA法筛选TfR抗体阳性的杂交瘤细胞;采用有限稀释法进行克隆和多次亚克隆以建立稳定分泌TfR抗体的杂交瘤细胞株;将杂交瘤细胞注射经石蜡油致敏的小鼠腹腔以产腹水抗体,采用硫酸-辛酸法纯化腹水抗体;采用秋水仙素处理,计数细胞染色体数以进行杂交瘤细胞鉴定;采用免疫荧光染色法和Western blot法初步鉴定抗体与细胞表面或细胞总蛋白中TfR的结合. 结果 提取纯化的人TfR蛋白免疫小鼠获得成功,其1∶5 000稀释的血清抗体光吸收值(A490)是对照小鼠血清(1∶200稀释)的16倍以上;细胞融合率为42.22%,其中TfR抗体阳性孔20个,抗体阳性率为13.16%;抗体阳性孔B6和孔E8中杂交瘤细胞经克隆和亚克隆后建立起稳定分泌抗体的细胞株;B6杂交瘤细胞染色体数量位于56~60条之间,应为B细胞和SP2/0细胞融合而来;腹水抗体染色使HepG2细胞表面出现明亮荧光,并且能使HepG2细胞提取的总蛋白电泳图谱在95 000处出现清晰条带,表明该杂交瘤细胞分泌的抗体能特异性结合TfR蛋白.结论 分泌抗人TfR抗体的小鼠杂交瘤细胞株已被筛选和建立;其分泌的抗体能与HepG2细胞的TfR特异性结合.     

Apoptosis of keloid-derived fibroblasts induced by Fas gene transfection]

OBJECTIVE: To observe the effect of Fas gene transfection on the apoptosis of keloid-derived fibroblasts. METHODS: The full-length cDNA of Fas was inserted into the multicloning site of the expression vector pcDNA-3.1 by molecular cloning technique, and the recombinant plasmid was transfected into the keloid-derived fibroblasts via lipofectin. Fas monoclonal antibody (mAb) was used to induce the apoptosis of the cells, which was evaluated with HE staining, DNA agarose gel electrophoresis and flow cytometry. RESULTS: The expression plasmid pcDNA-3.1-Fas was constructed successfully. Fas mAb induced apoptosis of these fibroblasts transfected with Fas gene, with the typical features of fibroblast apoptosis observed in the treated cells (e.g. typical apoptotic cell nuclei, DNA ladder and high apoptosis rate as determined by flow cytometer), but not in the control cells. CONCLUSION: Blockage of upstream apoptosis pathway in keloid-derived fibroblasts is due to nonfunction of Fas protein, and mutation of Fas gene may be the pathogenesis of keloids.     

微小RNA136过表达对结直肠癌细胞中钙结合蛋白S100A6含量及细胞增殖和凋亡的影响

目的 构建携带微小RNA136(mir136)的真核表达载体并将其转染人结直肠癌细胞,观察外源性mir136表达对人结直肠癌细胞中钙结合蛋白S100A6表达及细胞增殖活性的影响.方法 提取人肾上皮HEK293细胞基因组DNA,PCR扩增包含mir136前体序列的DNA片段并构建重组载体,采用阳离子脂质体法将重组载体转染人结直肠癌HCT116细胞.转染后48h,采用实时定量PCR法检测细胞内mir136含量变化,以蛋白质印迹法检测细胞中S100A6蛋白的表达;转染后24和48h,采用CCK 8试剂盒检测肿瘤细胞增殖活性;转染后48 h,以双染法检测细胞凋亡情况.结果 成功构建重组mir136真核表达载体并转染HCT116细胞.转染后48 h,重组载体转染组HCT116细胞内mir136相对表达量高于未转染组(P＜0.01),而S100A6蛋白的相对表达量则低于未转染组(P＜0.01).同时,重组载体转染组HCT116细胞增殖活性较未转染对照组降低(P＜0.05),而细胞凋亡则较未转染对照组增加(P＜0.01).结论 Mir136可能通过抑制S100A6基因表达而抑制结直肠癌细胞增殖活性,同时引起细胞的凋亡.