脐血CD34+细胞与单个核细胞的体外扩增特性研究

目的　探讨CD34+ 富集细胞和单个核细胞 (MNC)的体外扩增特性。方法　利用Min iMACS系统富集CD34+ 细胞 ,在相同条件下与同批MNC进行对照培养 ;观察了再次富选和MNC培养上清 (MNC SN)对CD34+ 富集细胞扩增的影响 ;并尝试了MNCCD34- 细胞的培养。结果　虽然CD34+ 富集细胞具有很高的扩增潜力 ,但在培养过程中 ,其集落密度和CD34 + 细胞含量却始终呈下降趋势 ,而MNC在培养中却出现了一个上升的趋势 ,集落密度和CD34+ 细胞含量分别由第 0天的 (4 12± 16 7) 10 5细胞和 (1.12± 0 .4 2 ) %增至第 7天的 (116 2± 5 6 6 ) 10 5细胞和 (4 .17± 1.4 4 ) % ;再次富选可以使培养过的CD34+ 富集细胞的总细胞和CD34+ 细胞扩增能力大大提高 ;MNCCD34- 细胞具有集落形成和转化为CD34+ 细胞的能力 ;MNC SN对CD34+ 富集细胞的集落形成有促进作用 ,而同时又对CD34+ 细胞有促分化作用。结论　CD34+ 富集细胞在体外大量扩增的同时存在大量分化 ,其在培养过程中产生的CD34-细胞对CD34+ 细胞的扩增有抑制作用 ;脐血MNC中大量的CD34- 细胞含有造血干 祖细胞 ,其分泌的细胞因子有促进CD34+ 细胞向较为成熟的集落形成祖细胞分化的作用。     

脐血及白血病缓解期骨髓中CD34+细胞筛选及体外扩增

脐血及白血病缓解期骨髓中ＣＤ３４＋细胞筛选及体外扩增姜容韩明哲赵英新韩俊领冯四洲李成文严文伟造血干细胞体外扩增对于造血干细胞移植、基因治疗等研究有着重要的意义。脐血干细胞的有效扩增可望将脐血用于成人移植［１］，可使骨髓移植患者在移植后快速渡过造血危相...     

脐血CD34+CD38-早期造血祖细胞的体外增殖和凋亡

为了从适龄产妇脐血中分离出CD34^ CD38^-细胞，在体外较长时间培养后观察分析CD34^ CD38^-细胞分裂增殖、凋亡以及干细胞因子对CD34^ CD38^-细胞增殖的影响，用流式细胞仪从10例健康产妇脐血中分选出CD34^ 和CD38^-标记的脐血原始细胞．在添加IL-3、IL-6、GM—CSF、EPO、IGF—1和SCF6种混合因子的干细胞培养基中培养6个月，观察细胞并绘制生长曲线，用单细胞凝胶电泳检测干细胞因子对CD34^ CD38^-细胞生长的影响和用流式细胞仪检测CD34’CD38细胞凋亡情况。结果表明：脐血CD34^ CD38^-细胞可在体外较长时间培养增殖，无异常或过度的细胞凋亡发生。结论：通过控制培养条件，脐血CD34^ CD38^-早期造血祖细胞可在体外较长时间培养增殖，以作为大量脐血原始细胞移植的细胞来源.     

脐血和骨髓来源的CD34^＋细胞体外扩增巨核祖细胞差异的研究

本研究探讨脐血（CB）和骨髓（BM）来源的CD34^＋细胞体外扩增巨核祖细胞的差异。采用Ficoll—Hypaque分离法分离人CB及BM单个核细胞，免疫磁珠法制备CD34^＋细胞，在含血小板生成素（TPO）、TPO＋白介素11（IL—11）或TPO＋IL11＋肝素的无血清液体培养体系中培养14天。流式细胞术检测扩增产物（CD34^＋、CD41a^＋及CD34^＋CD41a^＋细胞）免疫表型、巨核细胞凋亡率及DNA含量，并以集落形成单位测定法进行粒巨-噬细胞集落形成单位（CFU—GM）、红系爆式集落形成单位（BFU—E）及巨核细胞集落形成单位（CFU—Mk）计数。结果表明：14天培养中，CB来源细胞在总细胞数、CD41a^＋及CD34^＋CD41a^＋细胞扩增倍数上均高于BM（P均〈0．05）。0天CB及BM来源CD34^＋细胞在CFU—GM、BFU—E及总的CFU—Mk的形成能力上无显著性差异（P均〉0．05），但CB来源CD34^＋细胞形成的CFU—Mk以大集落为主，其数量高于BM（P〈0．05）；在培养7、10和14天，CB及BM来源细胞CFU—GM扩增倍数无显著性差异（P均〉0．05），但CB来源细胞的BFU—E及总的CFU—Mk扩增倍数均高于BM（P均〈0．05）。14天培养中CB和BM来源巨核细胞的凋亡率无显著性差异（P均〉0．05）。DNA含量检测发现，14天培养中CB来源巨核细胞始终以2N细胞为主（比例〉90％），而BM来源巨核细胞随着培养时间延长，4N、8N及以上倍体巨核细胞比例逐渐增加。结论：CB来源CD34^＋细胞体外扩增巨核祖细胞能力高于BM，它可能是巨核祖细胞体外扩增较好的来源。     

脐血CD34^＋细胞体外扩增脐血巨核祖细胞的研究

本研究探讨人脐血CD34^＋细胞体外扩增的巨核祖细胞的生物学特性及其免疫原性变化，为体外扩增脐血巨核祖细胞的临床应用提供实验依据。采用Ficoll-Hapaque分离法分离人脐血单个核细胞，应用免疫磁珠法（MACS）再分离富集CD34^＋细胞，在含血小板生成素（TPO，50ng／ml）、白介素-1]（IL—11，50ng／ml）和肝素（25U／ml）的无血清液体培养体系中培养14天。用流式细胞术检测扩增产物免疫表型（CD34^＋、CD41a^＋、CD61^＋、CD34^＋CD41a^＋及CD34^＋CD61^＋）、巨核细胞凋亡率及其表面HLA Ⅰ、Ⅱ类分子的表达，并进行巨核细胞集落形成单位（CFU—Mk）的检测。结果显示：脐血CD34^＋细胞能够有效地向巨核细胞分化，CD41a^＋和CD61^＋细胞比例在培养第14天达到峰值，CD34^＋CD41^＋和CD34^＋CD61^＋细胞比例在扩增第7天达到最高峰[分别为（3．41±2．80）％和（1．89±1．43）％]；CFU—Mk大集落在扩增第7天达到高峰（（20．66±32．79）倍]，小集落在扩增第10天达到高峰[（435．62±482．65）倍]；在培养7、10和14天时巨核细胞的凋亡率分别为（19．48±9．64）％、（26．87±9．03）％和（52．46±11．74）％，其中培养7天和10天的凋亡率无显著性差异（P〉0．05），培养14天的凋亡率显著高于7天和10天（P均〈0．05）；巨核细胞表面HLA Ⅰ、Ⅱ类分子的表达随着扩增天数的延长逐渐降低，其中培养0到10天阶段下降明显．结论：采用TPO＋IL 11＋肝素组合．可以有效地扩增脐血巨核祖细胞；培养7天，CFU—Mk大集落扩增倍数、CD34^＋CD41^＋和CD34^＋CD61^＋细胞比例均达高峰，这是巨核祖细胞体外扩增的较佳培养时间。     

转基因骨髓基质细胞对人脐血CD34+细胞体外扩增作用的研究

为探讨转染FL基因的人原代骨髓基质细胞对脐血CD34+ 细胞的体外扩增效应 ,建立了转基因骨髓基质细胞与人脐血CD34+ 细胞共培养体系。采用免疫磁珠法分离人脐血CD34+ 细胞 ,在不同的体外培养体系中进行培养并取样检测细胞总数 ,CFC和CD34+ 细胞百分率。结果表明 ,在不同组合的培养体系中 ,转基因骨髓基质细胞培养体系较骨髓基质细胞培养体系和无滋养层培养体系对有核细胞总数 ,CFC含量和CD34+ 细胞含量均具有明显的扩增作用 ,分别扩增了 12 2 .5± 4 .3,39.6± 2 .7和 11.8± 0 5 2倍 (P <0 .0 5 )。结论 :转染FL基因的人骨髓基质细胞协同其它细胞因子可增强对人脐血CD34+ 细胞的体外扩增作用。     

siRNA干扰p27基因表达对脐血CD34+细胞体外扩增影响的初步研究

造血干/祖细胞是一类被定义为具有自我更新和潜在重建造血能力的细胞.脐血是造血干/祖细胞的重要来源.通常人们应用高浓度的细胞因子刺激扩增脐血造血干/祖细胞,但导致其多向分化潜能及移植后造血重建能力下降.近来,Cheng等研究造血干/祖细胞的增殖周期特性发现,两种不同的Cip/Kip家族成员p21和p27可分别特异性地负向调控造血干/祖细胞增殖池的大小,p21可阻滞干细胞进入增殖周期,而p27可限制祖细胞的增殖周期.这为体外操纵造血干/祖细胞的增殖提供了良好途径.我们以pSilencer1.0-U6构建p27 siRNA表达载体转染脐血CD34＋细胞,以去除p27对造血祖细胞的增殖抑制作用,以一种不同于既往细胞因子刺激的方式,试图为体外扩增脐血CD34^＋细胞提供一种新的策略.     

人类脐血CD34^＋细胞的研究进展

本文综述了近年来对脐血ＣＤ３４＾＋细胞（即造血干／祖细胞）的研究进展，表明虽脐血ＣＤ３４＾＋细胞水平低于正常成人骨髓，但其干细胞比例较高且造血功能较强，有利于移植后长期造血的重建。     

GM-CSF对脐血CD34+巨核祖细胞体外扩增及分化的影响

本实验旨在研究GM-CSF对脐血CD34^＋细胞诱导分化为巨核细胞的影响.采用免疫磁珠法分选CD34^＋细胞,在含有TPO＋IL-3＋SCF并添加了不同浓度（5、20、100ng/ml）的GM-CSF的无血清培养基中进行培养.培养6、10、14天后计数单个核细胞（MNC）,检测CD41^＋细胞比例和CFU-MK.结果表明,培养14天后3种不同浓度GM-CSF对MNC均有明显的扩增作用,其中以20和100ng/ml GM-CSF的扩增效果较好.3种不同浓度的GM-CSF均使CD41^＋细胞比例增加,20和100ng/ml与5 ng/ml GM-CSF相比更能提高CD41^＋细胞的比例.5和20 ng/ml的GM-CSF能促进CFU-MK的形成,但100ng/ml的GM-CSF却抑制CFU-MK的形成.结论：在TPO＋IL-3＋SCF细胞因子组合中添加GM-CSF有利于促进脐血CD34^＋细胞诱导分化为巨核细胞.     

无血清脐血巨核系祖细胞体外扩增的研究

脐血造血干细胞移植后血小板恢复延迟是一大难题,目前认为这主要与脐血中巨核系祖细胞数量不足及脐血巨核细胞分化成熟延迟有关,而将部分脐血进行巨核系祖细胞体外扩增后输注受者体内是有望解决这一难题的重要途径。但适用于临床应用的扩增条件至今仍未确立。本课题采用人脐血单个核细胞(MNC)在无血清培养体系中使用TPO,IL-3,SCF,IL-6等细胞因子进行不同的组合,在培养的0,6,10,14天进行MNC、CD41^ 细胞及CFU-MK数的检测。以寻找最佳的细胞因子组合及最佳的收获时机。结果表明：无血清条件下TPO与IL-3,SCF,IL-6等细胞因子联用可实现脐血巨核系祖细胞有效的体外扩增,各因子组中以TPO IL-3 SCF IL-6组扩增效果为最佳。其CFU-MK数于第10天最多,扩增达6．8倍,CD41^ 细胞扩增达8．8倍。结论：在人脐血MNC无血清培养条件下。TPO IL-3 SCF IL-6组为巨核系祖细胞体外扩增较佳的因子组合。由于TPO IL-3 SCF IL-6组的CFU-MK数于第10天最多,CD41^ 细胞数亦为同期最高,故培养后收获时间宜控制在其体外培养的第10天。     

脐血CD34＋细胞体外诱导扩增红系细胞的探索

本研究利用脐血CD34＋细胞在体外大量扩增红系细胞为解决血源短缺、杜绝输血传染、克服稀有血型患者疑难配血等问题提供一种有益的途径。利用添加SCF、IL-3、EPO等细胞因子的无血清培养液扩增脐血来源的CD34＋细胞,并通过问充质干细胞的支持培养来诱导其向红系细胞扩增和分化。结果表明,经过23天培养以后,本方法可以使细胞的扩增倍数达到2．52×10^5,其中95％以上都是红系细胞,粒单系细胞和巨核细胞所占比例都在1％以内。无间充质干细胞的培养体系在细胞扩增数量及红系细胞所占比例方面都明显逊于有间充质干细胞支持的培养体系。结论：利用细胞因子和间充质干细胞可以在体外大量扩增红系细胞,其中间充质干细胞对红系细胞增殖和分化起重要的促进作用。     

人脐血树突状细胞体外无血清培养

树突状细胞(dendritic cell,DC)作为体内功能最强的抗原递呈细胞,已试用于肿瘤的免疫治疗,但多数实验室培养DC的体系中包含血清,使其临床应用受到限制。本研究以人脐血为来源,建立了无血清培养DC体系,以期将来用于临床。首先,用rhGM-CSF加rhTNF-α,进行有血清液体悬浮培养,14天后,从(1±0.5)×10~4/ml CD34~ 细胞或(5±2)×10~5/ml单个核细胞中,总细胞数扩增5倍,DC分别占(25±5)％和(17±5)％。第二,以无血清培养基代替有血清培养基,培养21天,(2±1)×10~6/ml单个核细胞没有数量的扩增,DC占(7±2)％。最后,对上述培养体系,在第5天(有血清培养基)或第12天(无血清培养基)后加入rhIL-4,DC产率及细胞总数均未增加。本研究结论:①根据液体悬浮培养中观察到粒、巨噬细胞和DC的混合集落及DC小丛,证实DC与粒、巨噬细胞有共同祖先,均来源于CD34~ 造血干/祖细胞;②脐血单个核细胞虽较CD34~ 细胞产生DC的比率稍低,但分离方便,花费少;③无血清体系的培养效果不如有血清体系,培养所需时间也长,细胞产率也低,有待进一步完善;④未证实rhIL-4能增加DC产率。     

人胎盘源贴壁细胞支持脐血CD34+细胞体外扩增

从胎盘中分离培养人胎盘源贴壁细胞 (humanplacentaderivedadherentcells,hPDAC) ,研究其对脐血CD34+细胞体外扩增作用。以酶消化法自人胎盘组织中分离培养hPDAC ,并以流式细胞术对其进行鉴定。进一步 ,采用免疫磁珠法分离人脐血CD34+细胞 ,建立以hPDAC为滋养层的CD34+细胞体外扩增培养体系 ,并与无滋养层的液体培养体系相比 ,观察不同培养体系对有核细胞总数、CFC及CD34+细胞百分率的影响。结果表明 ,人胎盘组织中可分离培养出hPDAC ,并证实其为混合性细胞群体 ,主要含有间充质细胞。以hPDAC为滋养层的共培养体系较无滋养层液体培养体系对有核细胞总数、CFC及CD34+细胞均具有明显的扩增效应 ,其中以SCF +IL 3+IL 6 +FL +hPDAC组扩增效果最强 ,分别扩增了 ( 12 6 .0± 6 .7)倍 ,( 4 9.8± 1.7)倍和 ( 8.3± 1.6 5 )倍。上述结果提示 ,hPDAC具有体外支持造血作用 ,并提供了一与脐血CD34+细胞体外扩增相适应的新滋养层。     

人骨髓间充质干细胞与脐血CD34+细胞体外扩增

为了研究骨髓间充质干细胞(MSC)及细胞因子对脐血CD34 造血祖细胞体外扩增的作用,及其扩增作用 对细胞黏附分子的影响,用免疫磁珠富集脐血CD34 细胞,然后接种到含有或不含有MSC和细胞因子的24孔培 养板,体外培养1周,观察不同指标并进行组间比较。结果表明:①SDF-1α SCF TPO FL因子组合与SCF TPO FL因子组合对脐血CD34 细胞的扩增作用无显著性差异(无论有无MSC细胞层存在)(P>0.05);②MSC 与上述细胞因子共存的培养体系优于相应的单纯细胞因子培养体系(P<0.05);③扩增前与扩增后脐血造血祖 细胞黏附分子CD44的表达没有明显变化。结论:趋化因子SDF-1α对SCF TPO FL因子组合的扩增作用无显 著影响;MSC增加细胞因子的脐血细胞体外扩增的作用;体外扩增不影响跻血细胞黏附分子CD44的表达。     

人骨髓间充质干细胞体外支持脐血CD34+细胞增殖的研究

为了研究人骨髓间充质干细胞(MSC)作为滋养层细胞体外支持脐血CD34+细胞扩增的作用,将MSC和胎儿骨髓来源的成纤维细胞样骨髓基质细胞系(HFCL)经60Coγ线照射后分别制备细胞滋养层,比较不同滋养层细胞和添加或不加细胞因子对脐血CD34+细胞增殖数及LTC-IC数的影响.结果表明,无论有无添加细胞因子(rhFL、rhSCF、rhTPO),HFCL滋养层组培养12天扩增细胞数明显高于MSC滋养层组,以第0天细胞数为100%(下同),有细胞因子组为(9797±361)%vs(7061±418)%,无细胞因子组为(5305±354)%vs(1992±247)%,均P＜0.01.MSC滋养层组CD34+细胞扩增数与HFCL滋养层组相比无显著差异[(825±305)%vs(820±191)%,P＞0.05],但在细胞因子存在时低于HFCL滋养层组[(939±212)%vs(1617±222)%,P＜0.01].MSC滋养层组维持脐血中LTC-IC的能力明显优于HFCL滋养层组[第5周CFU-GM数(129.95±8.73)个/105接种细胞数vs(89.81±10.29)个/105接种细胞数,P＜0.05];细胞因子存在时,其作用更为明显[第5周CFU-GM数(192.93±4.95)个/105接种细胞数vs(90.47±14.28)个/105接种细胞数,P＜0.01].MSC与HFCL按一定比例混合,可提高扩增效率.当MSC与HFCL之比为41时,集落形成数量最高,达(186.89±11.11)个/105接种细胞数,明显高于比例为32(131.45±13.02)个/105接种细胞数和二者单用组[前者(138.92±14.84)个/105接种细胞数,后者(64.63±6.11)个/105接种细胞数;均P＜0.01].结论MSC维持脐血中LTC-IC集落形成的能力优于基质细胞系HFCL,HFCL支持脐血CD34+细胞的增殖能力优于MSC,MSC加上适量HFCL可显著提高CD34+细胞扩增效率.     

脐血CD34+细胞的分离与纯化

脐血造血干细胞的分离是进行干细胞移植、体外扩增培养的关键。研究采用明胶自然沉降法、Ficoll分层法分离脐血MNC后,用MACS分离纯化CD34+细胞,计数并用流式细胞仪进行纯度分析。结果显示:每份脐血的采集量平均为95+52ml,3g/dl明胶自然沉降法所获MNC密度平均为(5.76±0.67)×107/ml;CD34+细胞密度平均为(5.53±1.16)×105/ml,较Fi-coll分层法高(P<0.01)。因此,3g/dl明胶自然沉降法是一种较理想的分离MNC的方法,用明胶沉降法和MACS相结合是分离脐血CD34+细胞的理想方法。