APE/Ref1在H2O2诱导耳蜗螺旋神经节细胞氧化损伤过程中的表达

目的 研究氧化还原因子-1(apurinic/apyrimidimic endonuclase/redox factor 1, APE/Ref-1)在过氧化氢(H2O2 )诱导耳蜗螺旋神经节细胞(spiral ganglion cells, SGCs)氧化损伤过程中的表达.方法 原代培养离体大鼠SGCs,采用免疫荧光和Western blot方法检测APE/Ref-1在H2O2诱导SGCs 氧化损伤过程中的表达.台盼蓝染色法计算SGCs氧化损伤过程中的死亡率. 结果 APE/Ref-1在体外正常培养SGCs细胞质和细胞核均有表达,细胞核较强.H2O2浓度≥60 μmol/L 时, SGCs死亡率显著升高,APE/Ref-1在细胞核表达明显减弱,与对照组相比差异具有统计学意义(P＜ 0.05). 结论 APE/Ref-1在氧化环境下SGCs细胞核表达减少,细胞死亡率升高,提示氧化环境下细胞活性降低可能与APE/Ref-1表达减少有关.     

猪视网膜神经节细胞的培养及超微结构

目的：建立视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells,RGCs)的体外培养方法,并研究视网膜不同类型神经细胞之间的相互作用,为RGCs的体外实验研究奠定基础。方法：进行猪视网膜细胞混合体外培养和神经节细胞的纯化培养,观察神经节细胞生长状态及轴突生长情况,研究视网膜不同类型神经细胞之间的相互作用。结果：视网膜细胞混合培养时,神经节细胞生长良好,纯化后的神经节细胞间连接减弱,细胞存活时间缩短。结论：视网膜细胞混合培养有利于神经节细胞的贴壁和生长。     

外源性神经节苷脂对神经干细胞增殖、分化作用的初步研究

目的 探讨外源性神经节苷脂(GM1)对从胎鼠大脑分离培养的神经干细胞(NSCs)增殖及分化的作用.方法 ①利用无血清培养技术从胎鼠大脑皮层和海马分离培养原代细胞,加血清诱导其分化.②在NSCs培养基和DMEM/F12培养基中加入不同浓度的GM1,观察GM1对NSCs增殖和分化的影响.结果 ①与不含GM1的NSCs培养基相比,在NSCs培养基中加入低浓度的GM1,NSCs的生长无明显改变,随着GM1浓度的增加,NSCs克隆球体积逐渐减小,细胞逐渐死亡;②在DMEM/F12培养基中单独加GM1而不加血清,NSCs克隆球均未见继续生长,也未见分化,而是迅速的死亡.结论 在NSCs培养基中,低浓度(12.5 μg/mL)GM1对NSCs的增殖无明显影响,但较高浓度的GM1对NSCs的增殖有抑制作用;在无血清的DMEM/F12培养基中,GM1不能诱导NSCs分化.     

不同培养条件下大鼠背根神经节细胞Nav1.8基因的表达

目的:观察体外培养大鼠背根神经节在不同培养条件下的生长情况及Nav1.8 mRNA表达水平,为进一步研究Nav1.8基因的功能提供基础。方法:取新生SD大鼠背根神经节细胞体外培养,观察胎牛血清(FBS)和马血清(HS),以及外源性神经生长因子(NGF)添加于培养基12 h,24 h,48和72 h突触神经元生长情况,并利用RT-PCR方法观察不同培养条件下Nav1.8mRNA表达水平的变化。结果:FBS NGF组及HS NGF组Nav1.8的表达水平明显都高于未添加NGF的FBS组和HS组,FBS组和HS组间比较无明显差异。结论:培养基中血清成分为FBS或FBS HS不影响细胞生长及Nav1.8的表达,而NGF可显著促进细胞突触的生长,并上调Nav1.8的表达。     

不同培养基对小鼠小脑浦肯野细胞发育的影响

目的　研究小鼠小脑浦肯野细胞的体外培养条件。方法　分别用有血清和无血清培养基培养小鼠小脑浦肯野细胞 ,应用免疫荧光染色和ABC法染色观察细胞形态 ,测定树突面积和胞体直径。结果　用无血清添加N3 的DMEM /F1 2培养基比有血清培养基培养的浦肯野细胞发育出的树突更多 ;在DMEM/F1 2培养基中加入T3 后浦肯野细胞的树突面积和胞体直径较大。结论　无血清培养基更有利于浦肯野细胞的维持培养 ;添加T3 的DMEM /F1 2 /N3 培养基有利于浦肯野细胞的发育。     

EGCG对H2O2诱导的螺旋神经节细胞MnSOD基因表达的影响

目的：探讨表没食子儿茶素没食子酸盐（EGCG）在双氧水（H2O2）诱导耳蜗螺旋神经节细胞（SGCs）氧化损伤中对线粒体抗氧化酶基因-MnSOD基因表达的影响。方法：培养离体SGCs,采用半定量RT-PCR方法检测加入不同浓度H2O2和/或EGCG后螺旋神经元MnSOD基因的表达情况。以经典抗氧化剂维生素C作对照。结果：随着H2O2浓度提高,MnSOD基因的表达亦随之升高;在H2O2浓度大于100 μmol/L时MnSOD基因表达明显上调(P<0.05),100 μg/ml EGCG能明显抑制H2O2诱导的MnSOD基因表达(P<0.05)。 结论：EGCG可能通过清除氧自由基,提高MnSOD酶活性,抑制H2O2诱导的螺旋神经节细胞MnSOD基因表达。     

分离培养大鼠背根神经节神经元的一种优化培养基

目的 在含胶质细胞源性神经营养因子(glial-derived neurotrophic factor,GDNF)的NB1中建立胚胎大鼠背根神经节神经元分离培养体系。方法 取E15大鼠背根神经节,采用原代分离培养方法制成单细胞悬液,接种在含GDNF的NB1中培养,观察神经元的体外生长情况。结果 培养的背根神经节神经元可存活3～4周,并长出突起,形成密集的网络,神经元纯度较高。结论 神经元在优化的NB1培养基中生活状态良好。     

两种不同培养基对体外培养脊髓神经元的影响

目的建立体外稳定获取大数量及高纯度脊髓神经元的培养方案,比较当前国内外最常用的无血清培养基（Neurobasal+B27,NCM）与传统含血清培养基（DMEM/F12+10%胎牛血清+5%马血清,SCM）对体外培养脊髓神经元生长状态的影响。方法取E14 15?d Wistar大鼠的胚胎脊髓组织行胰酶消化获取脊髓神经元的单细胞悬液,分别用NCM与SCM进行培养,差速贴壁法及Ara C干预纯化培养的神经元。于接种后第1、2、3、4、5、6、7?d倒置相差显微镜下观察细胞生长状态的变化,并用免疫荧光细胞化学法比较两种培养基培养下获取的神经元纯度。结果采用NCM培养的脊髓神经元生长良好,对环境变化如换液及加入Ara C更为耐受;NCM培养的神经元的纯度为(87.70±8.70)%,SCM培养的神经元纯度为（78.61±7.00）%,前者纯度更高（P=0.019）。结论NCM较之SCM更加适合脊髓神经元的体外培养。     

无血清K-SFM培养条件下大鼠毛囊Bulge细胞生物学特性的研究

目的研究无血清K-SFM培养条件下,大鼠毛囊Bulge细胞的生物学特性.方法分离大鼠毛囊Bulge细胞,分别置于无血清的K-SFM培养基(实验组)及有血清DMEM/F12培养基(对照组)的培养条件下培养.比较Bulge细胞在两种培养体系中的生长增殖和K19的表达状况.结果无血清培养的Bulge细胞在克隆形成率及K19的表达率均明显高于对照组(P＜0.05).结论体外培养和扩增大鼠毛囊Bulge细胞,无血清的K-SFM培养基较有血清DMEM/F12培养基更有利于Bulge细胞的扩增和表型的维持.     

HIVgp120对胎鼠背根神经节神经元突起生长的影响

探讨人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus, HIV）gp120对体外培养的背根神经节神经元胞体和突起生长的影响。方法：分散培养的胎鼠背根神经节神经元用不同浓度的HIV gp120 (125、250、500?pmol/L和1?nmol/L) 处理,对分散培养的背根神经节神经元用MAP2免疫荧光标记后,用共聚焦激光扫描显微镜观察神经元胞体和突起的改变。结果：应用gp120后7?d,神经元突起的数目减少,长度变短,而神经元的胞体则没有明显变化。结论：HIV gp120可直接影响分散培养的背根神经节神经元突起的生长。     

基因芯片联合激光捕获显微切割技术在脊髓背根神经节基因表达研究中的应用

目的探索联合激光捕获显微切割(laser capture microdissection,LCM)与基因芯片技术在大鼠脊髓背根神经节的感觉神经元基因表达研究中的可行性。方法取大鼠L4、L5、L6节段脊髓背根神经节,用LCM技术获取神经细胞,提取总RNA,甲醛变性凝胶电泳鉴定RNA质量,检测纯度和产量,并以实时RT-PCR方法进行验证。结果总RNA的完整性较好,经单轮T7线性扩增后得到足量的aRNA,可用于实时RT-PCR研究和进一步基因芯片杂交实验。结论结合有效的RNA保护方法和线性扩增,LCM可以分离出纯净的背根神经节的感觉神经元,满足下游基因芯片研究的要求。     

新生小鼠耳蜗基底膜体外培养观察

目的建立新生昆明小鼠耳蜗基底膜体外培养的模型并观察耳蜗基底膜培养的组织学形态。方法取出生2³ d的昆明小鼠耳蜗基底膜,置入24孔细胞培养板,在含有体积分数10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔/F12培养基中进行培养。采用四甲基异硫氰酸罗丹明标记的鬼笔环肽荧光染色毛细胞,抗神经丝蛋白荧光染色听神经纤维及螺旋神经节。观察耳蜗毛细胞、听神经纤维及螺旋神经节的生长情况。结果耳蜗基底膜经培养6 d,基底膜保持结构完整,毛细胞和螺旋神经节生长良好。结论本培养方法简便易行,可用于耳蜗基底膜体外培养实验研究。     

机械分离并培养螺旋神经节神经元方法的建立

目的　建立机械分离并培养小鼠耳蜗螺旋神经节神经元 (SGN )细胞模型的方法。方法　对出生后1～ 6 d的小鼠耳蜗螺旋神经节组织进行机械分离和培养 ,用倒置相差显微镜对原代培养的 SGN细胞的形态学和轴突生长情况进行观察 ,并应用荧光显微镜对 SGN进行免疫细胞化学染色鉴定。结果　新生小鼠 SGN在机械分离、体外培养条件下 ,可以获得良好的细胞形态和轴突再生能力 ,其存活细胞的数量为 (78.10± 4 .33) / cm2 (5～ 7d) ,生长周期为 7～ 14 d。结论　成功建立了机械分离并培养 SGN细胞模型的方法 ,SGN存活细胞的数量和周期可以满足体外多种实验的需要。     

乙肝病毒感染肝星状细胞的体外研究

目的初步研究乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)能否体外感染人肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC),以期为阐明慢性乙肝的致病机制提供新的实验依据。方法体外培养人肝星状细胞株(LX-2),用不同浓度HBV感染者的血清进行感染,HBV DNA终浓度分别为104、105、106、107拷贝/mL,在感染24、48和72h收取细胞。荧光定量多聚酶链反应(polymerase chain reaction,FQ-PCR)方法测定细胞内的总HBV DNA和共价闭合环状DNA(cccDNA);Southern blotting及Northern blotting方法测定细胞内是否存在HBV复制中间体及mRNA。结果在HepG2.2.15细胞中,分别检测到2.58拷贝/细胞和0.86拷贝/细胞的HBV DNA和cccDNA。在少量LX-2细胞中,可以检测到HBVNA,均在0.05拷贝/细胞以下,在所有LX-2细胞中未检测到cccDNA;用Southern blotting和Northern blotting方法未检测到LX-2细胞中存在HBV复制中间体及mRNA;而在HepG2.2.15细胞中检测到阳性条带。结论在体外实验中,未发现HBV感染肝星状细胞的证据。     

视交叉上核脑片与NIH/3T3成纤维细胞共培养模型的建立

目的建立视交叉上核(suprachiasmatic nucleus,SCN)脑片与NIH/3T3成纤维细胞共培养的分子时钟诱导模型。方法选用7日龄SD大鼠,分离SCN脑片或皮层脑片,分别与NIH/3T3细胞共培养,分为SCN共培养组和对照组皮质共培养组,6d后连续24h每间隔6h收集NIH/3T3细胞,抽提细胞总RNA,实时定量RT-PCR检测时钟基因Per1mRNA水平。结果SCN共培养组Per1的表达均表现明显的节律性(P=0.001),对照组大脑皮质共培养组Per1基因表达均无明显节律性变化。结论成功建立SCN脑片与NIH3T3细胞共培养模型并诱导细胞内分子时钟的节律性表达,为研究SCN调控外周组织细胞生物节律提供有力工具。     

相差显微镜检查尿沉渣上皮细胞黏附细菌对老年女性尿路感染的诊断意义

目的探讨用相差显微镜检查尿沉渣中黏附细菌的上皮细胞对尿路感染的诊断意义。方法对55例年龄60～85岁、平均年龄(68.98±6.08)岁、反复发生尿路感染的老年女性患者进行尿沉渣相差显微镜检查共150例次,对部分患者尿标本进行沉渣涂片染色与相差镜检比较,同时进行尿常规以及尿细菌培养计数检查。比较治疗前后上述检查结果的变化,分析应用相差显微镜检出的附菌上皮细胞在诊断老年女性尿路感染中的意义。结果尿相差显微镜检查附菌上皮细胞是诊治女性、特别是老年女性尿路感染的特异性指标,与尿培养细菌计数结果成正相关(r=0.8888,P<0.05)。单独尿沉渣相差显微镜检查附菌上皮细胞诊断老年女性尿路感染的特异性为84.8%,单独尿常规白细胞计数的特异性为51.9%。结论尿相显微镜检查附菌上皮细胞是诊断尿路感染比较特异、敏感和简便易行的方法。     

体外诱导成体大鼠骨骼肌组织来源的干细胞向神经干细胞的转化

目的研究成体Sprague-Dawley(SD)大鼠骨骼肌来源的干细胞(MDSCs)体外诱导向神经干细胞(NSCs)分化的可行性。方法通过酶消化和连续贴壁的方法体外分离成年SD大鼠腓肠肌中的MDSCs。当传代至4-6代时,加入神经干细胞的特殊培养基Neurobasal-A和细胞因子进行诱导分化。用免疫细胞化学、Western blot以及realtime-PCR方法进行鉴定。结果MDSCs在神经干细胞特殊培养基中培养7~10 d后可形成类似神经球的细胞聚集物。运用免疫细胞化学、Western blot以及realtime-PCR检测发现MDSCs的标记蛋白结蛋白(desmin)表达下调,NSCs的特异性抗原神经巢蛋白(Nestin)开始表达。结论在神经干细胞的特殊培养基培养7~10 d后,MDSCs能够向神经干细胞转化。这种现象提示MDSCs有可能作为治疗神经系统疾病尤其是神经退行性疾病的一种新的干细胞来源。     

内质网应激反应参与强噪声诱导豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞凋亡的研究

目的:探讨强噪声能否诱导豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞(SGC)的凋亡,及观察凋亡蛋白酶Caspase-12、内质网应激相关因子Bip/Grp78和CHOP/Gadd153在强噪声暴露后豚鼠耳蜗SGC中的表达,探讨内质网应激在强噪声暴露后豚鼠耳蜗SGC损伤中的作用.方法:选用健康雄性白色豚鼠20只,将实验组豚鼠暴露在4 kHz窄带噪声120 dB SPL噪声环境中4h,噪声刺激停止后1,4,14d组及对照组在处死前测ABR(每组各5只).通过透射电镜和脱氧核糖核甘酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL),检测SGC凋亡细胞,免疫组化检测Caspase12、Bip/Grp78,CHOP/Gadd153蛋白的表达.结果:透射电镜观察发现实验组SGC出现了凋亡细胞的特征性改变.实验组SGC的TUNEL染色明显增强,免疫组化检测实验组Bip/Grp78蛋白明显高于正常组,且在1,4,14d都维持在比较高的水平.Caspase-12、CHOP/Gadd153蛋白含量在噪声刺激后迅速增高,1d和4d达到高峰,14d减少.结论:强噪声可以诱导SGC凋亡,Caspase-12活化引起内质网应激反应性凋亡通道是此过程的信号途径之一.     

大鼠ACE2腺病毒载体的构建及其在INS-1细胞中的表达

目的构建携带大鼠血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)基因的重组腺病毒表达载体并确定其对INS-1细胞的感染效率。方法采用RT-PCR方法,从大鼠肾脏组织中扩增出ACE2基因的全长cDNA序列,将ACE2基因定向克隆到穿梭质粒载体pShuttle-GFP-CMV,经与腺病毒骨架质粒pAdxsi载体同源重组后得到携带大鼠ACE2基因的重组腺病毒(pAdxsi-GFP-CMV-ACE2),采用PCR的方法对重组腺病毒进行鉴定,转染HEK293细胞进行包装和扩增,氯化铯密度梯度离心法纯化,半数组织培养感染剂量(50%tissue culture infective dose,TCID50)方法测定重组腺病毒的滴度。体外转染INS-1细胞,绿色荧光观察绿色荧光蛋白(GFP)和Western blotting检测ACE2蛋白的表达。结果克隆得到大鼠ACE2基因,经PCR鉴定和测序证实结果正确,成功构建得到高滴度的重组腺病毒,并能高效感染INS-1细胞。结论成功构建了表达ACE2的复制缺陷型重组腺病毒,为深入研究ACE2基因在胰岛细胞中的生物学功能提供了一定的工作基础。