恶性疟原虫重组质粒DNA接种诱导BALB/c小鼠的免疫应答

目的：观察重组质粒DNA直接免疫接种诱导BALB／c小鼠的免疫应答水平，为恶性疟原虫DNA疫苗在动物和人体的应用提供依据。方法：构建编码多价保护性抗原的重组质粒pcDNA3－Pf8，PCR法检测免疫鼠的肌肉、肝脏、肾脏、心脏、脾脏和肺组织中pcDNA3－Pf 8，ELISA、T淋巴细胞转化试验、体外抑制试验观察其诱导的体液免疫及细胞免疫水平。结果：用PCR法从上述组织中均检测到pcDNA3－Pf8，ELISA法测得免疫鼠血清的特异性抗体滴度达12560，淋巴细胞转化试验显示恶性疟原虫可溶性抗原能特异性地剌激免疫鼠脾细胞增殖，免疫血清在体外还能抑制恶性疟红内期疟原虫的生长、发育。结论：编码恶性疟原虫多价保护性抗原的重组质粒pcDNA 3-Pf 8 直接免疫接种, 能特异性地剌激BALB/c 小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答, 其免疫血清在体外对疟原虫生长发育具有明显抑制作用。     

恶性疟原虫MSP1_(19)与PfCMR基因的体外重组与克隆鉴定

目的：构建编码恶性疟原虫复合多价保护性抗原的基因的重组质粒,为进行基因免疫提供条件。方法：设计一对特异引物Ｐ１与Ｐ２,采用ＰＣＲ法扩增获取ＭＳＰ１中Ｃ端１９肽基因,纯化后用ＳａｌⅠ＋ＸｂａⅠ双酶切,把含复合基因ＰｆＣＭＲ的重组质粒ｐＷＲ４５０－１／ＰｆＣＭＲ用ＥｃｏＲⅠ＋ＳａｌⅠ双酶切,回收复合基因ＰｆＣＭＲ,将ＭＳＰ１１９基因与ＰｆＣＭＲ基因串联后与经ＥｃｏＲⅠ＋ＸｂａⅠ双酶切的真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３进行重组,转化大肠杆菌ＪＭ１０９,经电泳初筛、双酶切鉴定及ＰＣＲ鉴定。结果：ＰＣＲ扩增获得３６３ｂｐ的ＭＳＰ１１９基因,重组克隆经双酶切鉴定及ＰＣＲ鉴定后获得正确重组克隆子ｐｃＤＮＡ３－ＰｆＣＭＲ－ＭＳＰ１１９（命名为ｐｃＤＮＡ３－Ｐｆ８）,Ｐｆ８基因长度为６１８ｂｐ。结论：成功构建编码恶性疟原虫多价保护性抗原的基因的重组质粒ｐｃＤＮＡ３－Ｐｆ８。     

恶性疟原虫FCC-1/HN株pcDNA_3-Pfs25重组质粒在小鼠体内的免疫应答

目的　探讨恶性疟原虫ＤＮＡ 疫苗在小鼠体内的免疫反应。方法　将恶性疟原虫ＦＣＣ－ １／ＨＮ株有性期阶段的重组质粒ｐｃＤＮＡ３－ Ｐｆｓ２５ 经骨骼肌途径注射ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,对注射部位的骨骼肌进行了预处理,即于注射前７ｄ 先在左后肢股四头肌注射０．５％ 盐酸布比卡因５０μｌ,注射深度为２ｍ ｍ 。观察免疫后不同时间点小鼠血清ＩｇＧ抗体滴度、脾淋巴细胞增殖反应、ＣＤ４＋ ／ＣＤ８＋ Ｔ细胞亚群比值和ＮＫ 细胞杀伤活性的变化。结果　１）重组质粒ｐｃＤＮＡ３－ Ｐｆｓ２５ 经肌肉注射途径免疫小鼠后,机体ＩｇＧ抗体滴度增高、特异性Ｔ淋巴细胞增殖反应增强、ＣＤ８＋ Ｔ细胞亚群比值增高以及ＮＫ细胞杀伤活性增强。２）肌肉注射为一有效的ＤＮＡ疫苗免疫途径。结论　采用编码有性期基因的重组质粒ｐｃＤＮＡ３－ Ｐｆｓ２５ 经骨骼肌注射途径免疫小鼠,能诱导机体有效的体液免疫、细胞免疫和ＮＫ细胞杀伤活性。本研究为恶性疟ＤＮＡ疫苗的研究提供了免疫学实验依据     

含弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究：Ⅲ免 …

用所构建的弓形虫ｐｃＤＮＡ３－ＰＯＰ１真核表达重组质粒，经肌肉注射免疫小鼠，观察它在肌组织中的表达及不同免疫途径所诱导的体液免疫应答。方法碱裂解法大量制备ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１质粒，免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，每只鼠，注射１００ｕｇ，两周后同时加强免疫一次，以ｐｃＤＮＡ３空间粒及生理盐水组为对照。于免疫后第５０天用间接免疫酶法检注射局部肌组织重组蛋白的表达ＥＬＩＳＡ法测定ＩｇＧ抗体滴度。结果免疫鼠肌组织     

含弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究Ⅲ.免疫鼠肌组织表达产物免疫酶法定位及血清IgG抗体测定

目的　用所构建的弓形虫ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１ 真核表达重组质粒,经肌肉注射免疫小鼠,观察它在肌组织中的表达及不同免疫途径所诱导的体液免疫应答。方法　碱裂解法大量制备ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１ 质粒,免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,每只鼠注射１００ｕｇ,两周后同量加强免疫一次,以ｐｃＤＮＡ３ 空质粒及生理盐水组为对照。于免疫后第５０ 天用间接免疫酶法检测注射局部肌组织重组蛋白的表达;ＥＬＩＳＡ法测定ＩｇＧ抗体滴度。结果　免疫鼠肌组织石蜡切片呈特异性阳性反应;血清ＩｇＧ抗体９０天后测定为阳性;皮下及肌肉不同免疫途径血清均显示阳性结果,无显著性差异。结论　ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１质粒ＤＮＡ 免疫小鼠后,肌组织内有重组蛋白表达,并能诱导机体产生ＩｇＧ抗体     

恶性疟原虫FCC1/HN株CSP抗原基因表达产物在小鼠体内的免疫应答研究

目的： 利用ｐｃＤＮＡ３ 质粒作为载体, 在人宫颈癌细胞（ＨｅＬａ 细胞） 中高效表达恶性疟原虫环子孢子蛋白 （ＣＳＰ）, 观察表达产物诱导ＢＡＬＢ／ｃ小鼠免疫的应答水平。方法： 目的基因ＰｆＣＳＰ在ＨｅＬａ 细胞中表达, 将纯化的表达产物免疫接种小鼠, 通过ＥＬＩＳＡ、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 分析、Ｔ 淋巴细胞增殖实验、ＮＫ 细胞活性检测和Ｔ淋巴细胞亚群测定, 观察其诱导ＢＡＬＢ／ｃ小鼠产生体液免疫和细胞免疫的应答水平。结果： ＥＬＩＳＡ 检测抗体滴度达１∶６ ４００;Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 结果在３８．３ ｋＤａ 相应位置出现较清晰的显色条带;表达产物能特异刺激小鼠脾淋巴细胞增殖、ＣＤ４＋ 与ＣＤ８＋ 细胞有所增加, 并能提高小鼠ＮＫ细胞活性。结论： 真核表达系统ｐｃＤＮＡ３－Ｐｆ／ＨｅＬａ表达产物能特异刺激小鼠产生体液免疫和细胞免疫的应答, 并提高小鼠ＮＫ细胞活性的作用     

恶性疟原虫FCC—1／HN株pcDNA3—Pfs25重组质粒在小鼠体内的 …

探讨恶性疟原虫ＤＮＡ疫苗在小鼠体内的免疫反频，方法将恶性疟原虫ＦＣＣ－１／ＨＮ株有性期阶段的重组质粒ｐｃＤＮＡ３－Ｐｆｓ２５经骨骼肌途径注射ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，对注射部位的骨骼肌进行了预处理，即注射前７ｄ先在左后肢股四头肌注射，０．５％盐酸布比卡因５０μｌ，注射深度为２ｍｍ。     

恶性疟原虫FCC—1／HN株不同期基因重组质粒混合接种小鼠 …

寻找有效的抗恶性疟原虫混合基因疫苗，探讨其在宿主体内的免疫反应。将恶性疟原虫重组质粒ｐｃＤＮＡ３－ＥＢＡ１７５／ＨＲＰⅡ经骨肌途径单独注射或与有性期阶段的重组质粒ｐｃＤＮＡ３－Ｐｆｓ２５混合注射免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠。对小鼠的骨骼骨肌进行预处理，即于注射前７ｄ在左右肢肌四头肌注射０．５％盐酸布比卡因５０μｌ，注射深度为２ｍｍ。观察免疫后不同时间点小鼠血清ＩｇＧ抗体滴度、脾淋巴细胞增殖反应、ＣＤ＾＋／     

弓形虫P30基因DNA免疫小鼠诱导小鼠体液应答及保护性研究

目的 用重组质粒ｐｃＤＮＡ３－Ｐ３０免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,观察其ＤＮＡ免疫所诱导的小鼠体液免疫反应和保护性作用。方法：大量制备闰ＤＮＡ,肌肉注射免疫小鼠。ＥＬＩＳＡ测定ＩｇＧ抗体滴定,免疫鼠血液组织Ｐ３０基因ＰＣＲ扩增,弓形虫攻击感染。结果 用ＥＬＩＡＳ法检测的抗体ＩｇＧ滴度１：２５６０,免疫后３周及６个月从免疫鼠血液组织中检测到Ｐ３０基因;攻击感染实验组的存活时间较对照时间延长（Ｐ〈０．０５）,     

弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒免疫小鼠后的免疫应答

目的： 用构建的弓形虫ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１ 真核表达重组质粒, 直接免疫小鼠, 观察其所诱导的细胞及体液免疫反应。方法： 碱裂解法大量制备ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１ 质粒, 经肌肉注射免疫ＢＡＬＢ／ｃ 小鼠, 每鼠注射１００ μｇ,２ ｗ ｋ 后同量加强免疫１ 次, 以ｐｃＤＮＡ３ 空质粒及生理盐水组为对照。分别于免疫后３０ ｄ、５０ ｄ、７０ ｄ 共３ 次用ＭＴＴ 法测定小鼠脾脏Ｔ 淋巴细胞增殖活性及ＮＫ 细胞活性; 用间接免疫荧光抗体法测定Ｔ淋巴细胞亚群数目;ＥＬＩＳＡ 法测定ＩｇＧ 抗体滴度。结果： 用ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１ 质粒免疫小鼠３０ ｄ 后, 脾脏明显增大; 免疫组脾淋巴细胞增殖活性明显高于生理盐水及空质粒对照组。ＮＫ 细胞杀伤活性３ 次的测定结果免疫组均高于对照组。Ｔ 细胞亚群, ＣＤ４＋ 细胞数与对照组相比较无明显变化, 而ＣＤ８＋ 细胞数显著增高。血清抗体ＩｇＧ７０ ｄ 内检测结果, 与对照组相比较, 无明显增高; 而免疫后９０ ｄ 检测明显增高, 抗体滴度１∶１００。结论： 用ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１ 重组质粒ＤＮＡ免疫小鼠, 可诱导产生细胞及体液免疫应答。     

我国不同地区周期型马来丝虫基因组DNA多态性研究

目的分析我国不同地区马来丝虫基因组的多态性.方法用随机扩增多态DNA(RAPD)技术对我国6省区周期型马来丝虫基因组DNA多态性进行了检测.结果经20个引物扩增得到51个多态片段,6株丝虫共有片段2个,特有片段9个.结论片段共享度及聚类分析所得的6株丝虫的亲缘关系与同工酶、电镜及氨基酸研究的结果基本一致,即地理位置相距近则亲缘关系密切.     

DNA探针用于中华按蚊和嗜人按蚊的分类研究

本项研究首次报道了我国中华按蚊和嗜人按蚊DNA基因库的建立,并从中华按蚊DNA基因库中筛选出一特异的DNA片段,以此为DNA探针,分别与中华按蚊DNA和嗜人按蚊DNA进行斑点杂交试验,其结果证明该DNA探针可与任何发育期的中华按蚊DNA杂交而不与嗜人按蚊DNA杂交,该探针敏感性高,可检测出7.5ng的中华按蚊DNA,大约相当于1个蚊虫总DNA的1/150,可用于区别中华按蚊和嗜人按蚊。     

用随机扩增多态DNA技术区分7种硬蜱

目的　分析 7种硬蜱基因组DNA的随机扩增多态性 ,探讨随机扩增多态性DNA(RAPD)技术在硬蜱分类中的应用。　方法　提取草原革蜱、森林革蜱、青海血蜱、台湾血蜱、刻点血蜱、龟形花蜱、卵形硬蜱DNA。选取 3条不同的随机排列碱基顺序的多聚核苷酸单链为引物 (P5、P6、P7)进行RAPD PCR扩增反应。将扩增产物制备成DNA图谱 ,对这 7种硬蜱的DNA多态性进行分析。　结果　 7种硬蜱分别扩增出不同数量与不同分子质量的DNA片段。有些硬蜱基因组DNA扩增产物中具有相同的DNA条带 ,这反映出它们的基因组DNA具有同源性 ;同时又具有各自独特的DNA条带 ,且DNA条带的亮度也有差异。　结论　RAPD技术可以准确地区分这 7种蜱。     

武汉地区职业献血员血清TTV等病毒核酸的检测

目的 调查武汉地区既往职业献血员血清TTVV DNA及其他几种肝炎病毒基因的状况与特点。方法采用PCR或巢式PCR对74例既往乡村献血员进行血清TTV DNA及HCV RNA、HGV RNA的检测。结果 TTVDNA、HCV RNA及HGV RNA阳性检出率分别为43.2％、23.0％与2.7％,TTV DNA检出显著高于其他肝炎相关病毒,HCV RNA阳性率显著高于HGV RNA阳性率。结论 既往长期的献血已造成地区乡村职业献血员TTV与HCV感染率的显著升高。     

微小隐孢子虫DNA探针的制备

目的：制备一种高度特异敏感的隐孢子虫检测探针。方法：应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增微小隐孢子虫的一段核苷酸片段,扩增产物４５２ｂｐＤＮＡ用半抗原地高辛标记制备成探针。结果：经敏感性试验,该探针可检测２ｐｇ水平的隐孢子虫ＤＮＡ。用该探针与隐孢子虫ＤＮＡ和溶组织内阿米巴、贾第虫、大肠杆菌及痢疾杆菌等相关生物的ＤＮＡ和隐孢子虫宿主的ＤＮＡ进行斑点杂交试验,该探针只与隐孢子虫ＤＮＡ杂交。结论：该探针具有高度特异性和较高敏感性。     

弓形虫基因组文库的建立、特异克隆的筛选和弓形虫病的DNA诊断

首次建立弓形虫人株(ZS_2株)基因组文库,筛选出一个弓形虫特异DNA片段的克隆。对该克隆的DNA片段(1.1kb)进行了限制性内切酶图谱分析。应用Southern印迹法及斑点印迹法检测,结果示同位素~(32)P标记的该克隆DNA片段能与弓形虫DNA、人工感染弓形虫幼猪白细胞和胸腺DNA、弓形虫感染病人DNA杂交,但不与正常人、正常幼猪外周血白细胞、正常小鼠脾脏、恶性疟原虫、肺孢子虫、pBR322的DNA杂交。斑点杂交检测低限为100个弓形虫或500pg弓形虫DNA。该探针已成功地应用于多种弓形虫感染病例的检测,为弓形虫病提供了一个特异、灵敏的DNA诊断方法。     

杜氏利什曼原虫cDNA文库的构建

目的 :建立杜氏利什曼原虫 cDNA文库 ,以获取个体基因表达产物和研究基因结构。方法 :以杜氏利什曼原虫四川人分离株 m RNA为模板 ,体外合成 cDNA,以噬菌体λgt11DNA为载体构建文库。结果 :共获 2× 10 6重组子 ,插入比例为 4 8%。文库经抗杜氏利什曼原虫前鞭毛体全虫兔抗血清筛选 ,共筛 2× 10 4重组子 ,获 3个阳性表达克隆 ,表达产物的分子量分别为 :136k Da、160 k Da和 148k Da。结论 :已构建成的表达型杜氏利什曼原虫 cDNA文库 ,其插入比例和表达效率均较高。     

日本血吸虫混合DNA疫苗免疫效果观察

目的 为提高日本血吸虫DNA疫苗免疫效力,观察日本血吸虫抗原分子的混合DNA疫苗诱导小鼠的抗攻击感染的保护性免疫。方法 大量制备真核质粒pBK-CMV-Sj26和pBK-CMV-Sj23,然后将单价DNA疫苗pBK-CMV-Sj26和pBK-CMV-Sj23混合后免疫小鼠。实验分为4组：混合疫苗组、单价疫苗pBK-CMV-Sj23组、空质粒对照组及生理盐水对照组。各组于0周、3周、5周在小鼠股四头肌注射相应质粒DNA或生理盐水,第9周小鼠用血吸虫尾蚴攻击感染,第15周剖杀小鼠计算减虫率及减卵率。结果 与对照组比较,实验组小鼠减虫率及减卵率有极显著性意义（P＜0．01）;与单价pBK-CMV-Sj23组比较,混合DNA疫苗组的减虫率及减卵率有显著性意义（P＜0．05）。结论 血吸虫混合DNA疫苗诱导小鼠对血吸虫的保护力优于单价DNA疫苗。     

卫氏并殖吸虫基因文库的构建——Ⅰ重组克隆的方法

以SDS-酚-乙醇沉淀法提取卫氏并殖吸虫成虫基因组DNA,分别用Sau 3A和Eco RI核酸限制性内切酶酶切,电泳回收0.4—4Kb大小的DNA片段,与相应的大肠杆菌质粒载体pBR~(322)或pUR~(222)重组连接,转染大肠杆菌7118。结果显示,pUR~(222)质粒经碱性磷酸脂酶处理后与DNA片段以1/4(W/W)比例重组连接,获得的重组克隆最多,并且可以利用菌落的色泽不同,从麦康凯培养基平板上直接挑选出重组克隆。是利用质粒载体构建基因文库重组克隆的较好方法。