通脉宁对AngⅡ及LPC诱导的血管平滑肌细胞内钙超载的影响

目的观察通脉宁全方及拆方药物血清对AngⅡ及LPC诱导的血管平滑肌细胞内钙超载的影响.方法组织贴块法进行血管平滑肌细胞(VSMC)培养,应用血清药理学研究的方法,AngⅡ 10-6mol/L、LPC 10-8mol/L作为刺激因子,制备通脉宁全方、益气拆方、活血拆方药物血清.采用Fluo-3染色荧光探针标记测定钙离子荧光强度.结果通脉宁全方及拆方药物血清对AngⅡ及LPC诱导的VSMC内钙超载具有明显的干预作用,且通脉宁全方组的干预作用明显优于益气拆方组及活血拆方组.结论通脉宁药物血清抑制AngⅡ及LPC诱导的VSMC增殖与部分阻断AngⅡ及LPC细胞内的信号转导途径有关,这可能是通脉宁抑制VSMC增殖的作用途径之一.     

通脉宁调控AngⅡ、LPC诱导血管平滑肌细胞c-fos、c-myc基因表达的研究

目的观察通脉宁胶囊对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、溶血磷脂酰胆碱(LPC)诱导的兔血管平滑肌细胞(VSMC)c-fos、c-myc癌基因表达的影响。方法组织贴块法培养兔主动脉平滑肌细胞,用AngⅡ、LPC诱导VSMC增殖,采用RT-PCR方法,观察通脉宁全方及益气拆方和活血拆方药物血清对AngⅡ、LPC诱导的VSMC c-fos、c-myc蛋白表达。结果AngⅡ、LPC组c-fos和c-myc蛋白表达增加,与空白组比较有显著性差异(P<0.01);通脉宁全方组、益气拆方组、活血拆方组均可使c-fos和c-myc的蛋白表达下调,与AngⅡ、LPC组比较有显著性差异(P<0.01);通脉宁全方组与益气拆方组、活血拆方组比较也有显著性差异(P<0.01)。结论通脉宁胶囊可下调AngⅡ、LPC诱导的VSMC c-fos、c-myc基因表达,而对VSMC增殖起到抑制作用。     

黄芩甙对角质形成细胞产生IL-8和增殖活性的影响

目的 研究黄芩甙对角质形成细胞产生IL-8和增殖活性的影响，探讨黄芩甙治疗银屑病机制。方法 采用四甲基偶氮盐比色法（MTT）观察黄芩甙对角质形成细胞株HaCaT细胞增殖的影响，实时定量RT—PCR方法检测黄芩甙对HaCaT角质形成细胞表达IL-8 mRNA的影响；用酶联免疫吸附方法（ELISA）检测HaCaT细胞分泌至培养液中IL-8的量。结果 100μg／mL黄芩甙可抑制HacaT细胞增殖；10—100μg／mL黄芩甙均可抑制HaCaT角质形成细胞表达IL-8mRNA和分泌IL-8。结论 黄芩甙可抑制体外培养的HaCaT细胞增殖和表达IL-8mRNA和蛋白，发挥抗炎和治疗银屑病的作用。     

补肾活血汤提取物促进大鼠骨髓间充质干细胞增殖的研究

【目的】筛选出补肾活血汤促进骨髓间充质干细胞增殖的有效部位。【方法】补肾活血汤（全方组）及其拆方（补肾组、活血组）分别用溶剂极性递增法提取得石油醚、乙酸乙酯、无水乙醇以及水4个部位。骨髓间充质干细胞采用全骨髓贴壁法培养,传至第3代采用表面抗原鉴定,成骨、成脂分化鉴定。将上述补肾活血汤提取物按浓度梯度处理细胞24 h,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞活性,筛选出最有效部位及其最佳浓度。用补肾活血汤最有效部位处理细胞, MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期。【结果】与空白对照组比较,补肾活血汤及其拆方均具有不同程度维持细胞活性的作用。其中以补肾组乙酸乙酯部位、全方组乙酸乙酯部位及活血组乙酸乙酯部位最为有效,且呈一定的药物浓度依赖性,100μg/mL为最佳药物浓度,并未出现细胞毒性反应。细胞生长曲线显示：补肾活血汤有效部位处理细胞后,细胞增殖速度与数量较对照组更为明显,以补肾组最有效,全方组次之。流式细胞仪检测细胞周期结果显示：补肾活血汤有效部位处理细胞后,处于增殖期细胞数量明显多于空白对照组,以补肾组最有效,全方组次之。【结论】补肾活血汤促进骨髓间充质干细胞增殖的有效部位在补肾组乙酸乙酯部位,可使骨髓间充质干细胞处于增殖期细胞数目增多。     

舒脉胶囊对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞迁移的影响

目的观察舒脉胶囊及其拆方药物血清对血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)诱导的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)迁移的影响。方法采用组织贴块法进行VSMC培养,AngⅡ10-7 mol/L作为刺激因子,将药物血清分为舒脉胶囊全方组、活血化瘀拆方组和补脾益肾拆方组,测微尺测量细胞迁移的距离,免疫组织化学法测量基质金属蛋白酶-2(metalloproteinase-2,MMP-2)的表达情况。结果与AngⅡ组比较,舒脉胶囊全方组、活血化瘀拆方组细胞迁移距离显著减小(P<0.01),MMP-2表达减少(P<0.01),其中舒脉胶囊全方组细胞迁移距离显著小于活血化瘀拆方组(P<0.01)。结论舒脉胶囊通过抑制MMP-2的表达而抑制VSMC迁移,全方作用优于拆方。     

舒脉胶囊对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞迁移的影响

目的 观察舒脉胶囊及其拆方药物血清对血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)诱导的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)迁移的影响.方法 采用组织贴块法进行VSMC培养,AngⅡ 10-7 mol/L作为刺激因子,将药物血清分为舒脉胶囊全方组、活血化瘀拆方组和补脾益肾拆方组,测微尺测量细胞迁移的距离,免疫组织化学法测量基质金属蛋白酶-2(metalloproteinase-2,MMP-2)的表达情况.结果 与AngⅡ组比较,舒脉胶囊全方组、活血化瘀拆方组细胞迁移距离显著减小(P<0.01),MMP-2表达减少(P<0.01),其中舒脉胶囊全方组细胞迁移距离显著小于活血化瘀拆方组(P<0.01).结论 舒脉胶囊通过抑制MMP-2的表达而抑制VSMC迁移,全方作用优于拆方.     

加味四逆散及拆方对肝星状细胞JAK2-STAT3信号通路的影响

目的:观察复方加味四逆散及拆方的药物血清对肝星状细胞(HSC-T6)JAK2-STAT3信号通路的影响。方法:用加味四逆散及拆方煎剂给正常Wistar大鼠灌胃7天,制备含药血清;培养肝星状细胞;用100ng/mL的瘦素刺激HSC-T6使其增殖;应用蛋白印迹试验检测各组药物血清对增殖后的肝星状细胞JAK2、STAT3蛋白的表达水平。结果:加味四逆散作用6h后,JAK2、STAT3蛋白的表达水平开始降低,且JAK2降低较为明显,24h STAT3降低最为明显。加味四逆散各拆方组作用12h后,STAT3蛋白水平降低,且存在差异。结论:(1)加味四逆散全方及拆方均有降低增殖后的肝星状细胞JAK2、STAT3蛋白的表达。(2)加味四逆散全方阻断JAK2-STAT3通路信号转导的作用显著优于拆方的效果,综合运用比拆方有更好疗效。     

银屑灵优化方抗炎及免疫调节作用

【目的】考察银屑灵优化方抗炎作用及免疫调节功能,探讨其抗银屑病作用环节。【方法】采用弗氏佐剂法致大鼠关节炎模型,观察银屑灵优化方对大鼠关节病理变化的影响;采用醋酸腹腔注射复制小鼠腹腔毛细血管通透性增高模型,观察银屑灵优化方对小鼠腹腔渗出液含量的影响;采用脂多糖(LPS)致小鼠肝损伤的模型,观察银屑灵优化方对血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素γ(IFN-γ)含量的影响。【结果】银屑灵优化方低、中、高剂量组可显著改善佐剂性关节炎模型大鼠炎症症状;银屑灵优化方低、高剂量组可显著降低小鼠腹腔毛细血管通透性(P0.01);银屑灵优化方低、中、高剂量组可显著降低模型小鼠血清的TNF-α含量(P0.01),增加模型小鼠血清的IFN-γ含量(P0.05),部分剂量组疗效与阳性对照药醋酸波尼松组和郁金银屑片组相仿。【结论】银屑灵优化方具有一定的抗炎活性与免疫调节作用。     

养阴清热祛湿方及其拆方抑制人肺腺癌细胞A 549 PDGFRα-PLC-γ1-PKCα信号转导的研究

目的:通过观察养阴清热祛湿方(H)及其拆方(Y,R,Q,YR,YQ,RQ)对肺腺癌细胞A 549增殖抑制和PDGFRα-PLC-γ1-PKCα信号转导通路的影响,研究肺腺癌发病和PDGFRα-PLC-γ1-PKCα转导通路的关系.方法:采用人肺腺癌A 549细胞为实验对象,筛选出有效的药物,用正交试验优选出疗效最好的方剂,设对照组和养阴清热祛湿全方及其六个拆方处理细胞,用Western blot检测A 549细胞PDGFRα-PLC-γ1-PKCα信号转导通路各蛋白表达的影响.结果:①养阴清热祛湿全方及其拆方均能抑制A 549细胞的生长,全方作用最强,随药物浓度的增加,对细胞生长抑制呈现剂量-效应依赖关系.②人肺腺癌A 549细胞可检测到PDGFRα、PLC-γ1、PKCα蛋白分子的过度表达.③当用IC50药物剂量处理细胞时,养阴清热祛湿全方及其拆方均能抑制PDGFRα-PLC-γ1-PKCα信号通路各蛋白表达水平,其作用强弱依次为:H＞RQ＞YR＞YQ＞R＞Q＞Y.结论:①养阴清热祛湿全方及其拆方均能明显抑制人肺腺癌细胞A 549的生长,全方组效果最好,表明养阴、清热、祛湿三法联用具有协同作用.②肺腺癌发病和PDGFRα-PLC-γ1-PKCα转导通路信号增强密切相关.③养阴清热祛湿全方及其拆方均能下调A 549细胞PDGFRα-PLC-γ1-PKCα信号通路各蛋白表达水平,表明养阴、清热、祛湿及三法联用正是通过抑制PDGFRα-PLC-γ1-PKCα信号转导途径而抑制肺腺癌细胞增殖.④肺腺癌治疗中应以养阴清热祛湿为治疗大法,扶正祛邪,虚实同治.     

人皮肤角质形成细胞无血清原代培养方法的建立

目的 建立人皮肤角质形成细胞体外无血清、无牛垂体提取物及无饲养细胞的原代培养方法.方法 应用胰蛋白酶.EDTA冷温两步消化法消化健康青年包皮皮肤,获取角质形成细胞并置于无血清、无牛垂体提取物、成分确定的角质形成细胞培养基中进行原代培养并传代.通过观察细胞形态和采用免疫组织化学方法鉴定及绘制生长曲线,分析、评价细胞质量.结果 该方法可稳定获得高纯度、活性好的角质形成细胞.原代角质形成细胞可稳定增殖2周左右,至少可稳定传代增殖5代.经免疫组织化学方法鉴定,99%以上为角质形成细胞.结论 冷温两步消化法及体外无血清原代培养技术可为科研工作提供足量高质量的角质形成细胞,是高效经济的获得人角质形成细胞的方法.     

VEGF在HaCaT细胞中的自分泌作用

目的:检测VEGF在皮肤角质形成细胞系HaCaT细胞中可能的自分泌作用.方法:用MTT法,检测不同浓度外源性VEGF165(0,1,5,10,25,50,100 ng/ml)和不同浓度VEGF特异性抑制剂阿瓦斯丁(0,0.063,0.125,0.25,0.50,1.0,2.0 mg/ml)作用下HaCaT细胞增殖的变化;用细胞迁移实验,检测不同浓度VEGF165和0.5 mg/ml阿瓦斯丁作用下HaCaT细胞迁移的变化;蛋白免疫印迹检测10 ng/ml VEGF165和0.5mg/ml阿瓦斯丁作用下HaCaT细胞ERK1/2的磷酸化情况.结果:VEGF165剂量依赖性地促进HaCaT细胞的增殖和迁移能力;而阿瓦斯丁剂量依赖性地抑制其增殖能力,0.50 mg/ml阿瓦斯丁可以显著性降低其迁移能力;10 ng/ml VEGF165显著性促进HaCaT细胞ERK1/2的磷酸化,而对0.5 mg/ml阿瓦斯丁预处理过的HaCaT细胞的ERK1/2磷酸化没有促进作用.结论:VEGF在皮肤角质形成细胞系HaCaT中存在着自分泌作用.     

青蒿琥酯对人表皮鳞癌A431细胞增殖和凋亡的影响

目的 初步探讨青蒿琥酯(artesunate,ART)对人表皮鳞癌细胞增殖和凋亡的影响及其相关机制.方法 以人表皮鳞癌细胞系A431为研究对象,人永生化角质形成细胞系HaCaT为正常对照,顺铂(diamminedichloroplatinum,DDP)为药物阳性对照,通过MTT法和流式细胞术观察ART对A431细胞增殖和凋亡的影响,以及铁离子抑制剂去铁敏(desferrioxamine.DFOM)部分阻断ART对A431细胞的生长抑制作用.结果 ART对A431细胞有较明显的增殖抑制作用,对HaCaT细胞的损害显著低于DDP;药物组ART60 μmol/L(IC50)作用A431细胞48 h,A431细胞阻滞于S期[(67.60±4.12)%,P<0.05],同时凋亡率上调[(19.87±0.03)%,P<0.01];药物阻断组DFOM 60μmol/L预处理A431细胞4 h、加入ART60 μmol/L作用钙h,凋亡率显著下调[(7.37±0.02)%,P<0.01],而周期检测未发生变化.结论 ART通过阻滞A431细胞停滞于S期和诱导A431细胞凋亡发挥增殖抑制作用,此作用在一定范围内与药物剂量呈正相关;ART对A431细胞的诱导凋亡作用与Fe2+介导有关;ART毒副作用明显低于DDP.     

Curcumin down-regulates PCNA, cyclin D1 and Bcl-XL expression in human keratinocyte cell lines

Objective：To evaluate the effects of curcumin on regulating the proliferation,cell cycle distribution,apoptosis and relevant mechanisms in keratinocyte cell lines.Methods：The human immortalized human keratinocyte lines（HaCaT cells） were treated with different doses of curcumin.The effects of curcumin on cell viability were measured by MTT assay,and the cell cycle distribution and apoptosis determined by flow cytometry.The mRNA expression changes of proliferating cell nuclear antigen（PCNA）,cyclin D1 and Bcl-xL were from real-time PCR analysis and the protein levels were detected by Western blotting.Results：Data obtained in the study showed that curcumin could cause significantly inhibitory effect on proliferation in HaCaT cells in a time- and dose-dependent manner.Cell arrest at G1/S phase and significant apoptosis were observed after being treated with curcumin for 24 h.In association with these,the expression of PCNA,cyclin D1 and Bcl-xL were decreased both at mRNA and protein levels for the same treatment.Conclusion：Curcumin can inhibit proliferation,induce cell arrest at G1/S phase and cause apoptosis in HaCaT cells.The decreased expression of PCNA,cyclin D1 and Bcl-xL induced by curcumin contributes to the above effects in vitro.     

杜仲对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响

【目的】探讨杜仲对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖的影响。【方法】分别取10日龄SD大鼠胫骨、股骨的骨髓,过滤离心后将所得BMSCs进行体外单层培养、扩增,采用DMEM培养基,37℃、体积分数5%CO2条件培养。在细胞达到80%～90%融合时,使用2.5 g/L胰酶消化传代。将传代细胞分别置于空白血清培养液(对照组)、杜仲水提取物含药血清及杜仲醇提取物含药血清培养液进行培养,观察细胞在3种条件下的形态、贴壁生长、增殖、集落等情况,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法绘制生长曲线,比较3种培养条件下达到100%融合的时间。【结果】杜仲水提取物组、杜仲醇提取物组对大鼠BMSCs增殖的影响显著高于空白血清对照组(P<0.05),且杜仲醇提取物组作用优于杜仲水提取物组(P<0.05)。【结论】杜仲对大鼠BMSCs增殖具有一定促进作用。     

四氧化三铁磁性纳米颗粒对人角质形成细胞超微结构的影响

目的 研究四氧化三铁(磁性Fe3O4)纳米颗粒对人角质形成细胞(HaCaT)超微结构的影响。方法 将不同浓度的Fe3O4磁性纳米颗粒悬液加入培养的HaCaT细胞中,在37℃、5%CO2的细胞培养箱中共同孵育4 h,收集细胞进行常规透射电镜制样,在透射电镜下观察纳米Fe3O4颗粒进入细胞的方式及细胞超微结构的改变。结果 Fe3O4磁性纳米颗粒平均粒径为12 nm。在不同浓度下Fe3O4磁性纳米颗粒均能以吞噬的方式进入细胞,进入细胞后再从吞噬泡中释出,主要对其附近的线粒体造成影响,线粒体出现肿胀,线粒体嵴溶解。 结论 Fe3O4磁性纳米颗粒主要对HaCaT细胞中颗粒附近的线粒体结构有损伤,且存在浓度依赖性。     

葛根总黄酮对神经肽Y诱导血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

[目的]观察葛根总黄酮对神经肽Y(NPY)诱导血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响。[方法]建立体外培养VSMC 体系,实验分为4组,分别为正常对照组(加无血清的DMEM培养液)、模型组(加NPY条件培养液)、正常+葛根总黄酮组(即正常+中药组,加葛根总黄酮条件培养液)和模型+葛根总黄酮组(即模型+中药组,加NPY条件培养液和葛根总黄酮条件培养液),采用荧光免疫组化定量技术检测各组VSMC中的细胞核增殖抗原(PCNA)、血小板衍生生长因子(PDGF)和原癌基因C-myc表达平均荧光强度。[结果]模型组PCNA、PDGF和C-myc表达明显高于正常对照组(P<0.01); 正常+中药组3项指标均降低,与正常对照组比较具有显著性差异(P<0.01);模型+中药组3项指标比模型组降低(P <0.01)。[结论]葛根总黄酮对正常VSMC增殖有一定抑制作用,对NPY诱导VSMC增殖具有拮抗作用,其治疗心血管疾病的作用可能与后者有关。     

紫外线的不同组成部分照射对HaCaT细胞的影响

目的观察紫外线照射的不同组成部分对HaCaT细胞的影响，为下一步进行光敏性皮炎患者的体外实验提供依据，以进一步阐述光敏性皮炎的发病机制．方法以不同剂量的长波紫外线和中波紫外线照射人永生化表皮细胞HaCaT细胞，观察照射后12h细胞形态学变化，并计数细胞数．结果UV照射后细胞联接松散，折光性差，部分细胞死亡，其中以大剂量UVB为明显．结论紫外线照射对HaCaT细胞的影响因照射剂量不同而不同，为下一步进行光敏性皮炎发病机制的探讨提供实验依据．     

抑制miR-31表达对人角质形成细胞增殖、凋亡的影响研究

目的探讨miR-31对人角质形成细胞系HaCaT细胞增殖和凋亡的影响以及可能机制。方法培养HaCaT细胞,利用瞬时转染的方法,对不同组细胞进行转染。反义寡核苷酸技术（ASO）组:转染微小RNA（miR）-31 ASO;对照ASO组:转染对照ASO;空白对照组:转染空白质粒。MTT法检测不同转染组细胞增殖情况,Annexin V-FITC/PI双染色检测不同转染组细胞凋亡情况,PI单染色法检测不同转染组细胞周期,Western blotting检测不同转染组细胞中Rho相关结构域BTB蛋白质1（RhoBTB1）蛋白表达。结果ASO组细胞中miR-31表达量明显低于对照ASO组和空白对照组（P < 0.01）;ASO组细胞在24、48、72、96 h时吸光度值均低于对照ASO组和空白对照组（P < 0.05~P < 0.01）,且3组细胞随着时间推移,吸光度值均较之前逐渐增加（P < 0.01）;ASO组细胞凋亡率、G₀/G₁期细胞比例、RhoBTB1蛋白表达量明显高于对照ASO组和空白对照组（P < 0.01）;而S期和G₂期细胞比例明显低于对照ASO组和空白对照组（P < 0.01）。结论miR-31可能参与了人角质形成细胞系HaCaT细胞增殖、凋亡过程,可能通过调控RhoBTB1蛋白表达而实现这一生物学过程。     

紫外线B抑制人角质细胞生长及维生素E的保护作用

目的 观察HaCat人角质细胞在不同剂量紫外线B(UVB)照射下培养不同时间后的存活率及细胞周期分布情况，并探讨维生素E(VE)对其影响。方法 采用四甲基偶氮唑盐(MTT)染色法和流式细胞术分析受UVB照射细胞的存活率和细胞周期各时相的变化。结果 UVB剂量不同，培养时间相同时，随剂量增加，存活率逐渐减少；照射剂量相同，培养时间不同时，随时间延长，细胞存活率下降到最低值后有恢复(照射15min除外)。细胞周期结果分析表明：小于5min的UVB照射剂量，随着细胞培养时间的延长，细胞增殖指数：(S G2)／(G1 S G2)不断提高；大于或等于5min的照射剂量，随培养时间延长细胞增殖指数逐渐减少。VE对UVB照射所致的HaCat细胞生长抑制有保护作用，40μg／ml为VE最佳剂量。结论 UVB在一定的照射剂量和培养时间内抑制人角质细胞的生长，VE对此有拮抗作用。     

牛蒡子苷对小鼠3T3-L1前脂肪细胞增殖与分化的影响及其作用机制

【目的】探讨牛蒡子苷(arctiin)对小鼠3T3-L1前脂肪细胞增殖、分化的影响及其作用机制。【方法】采用不同浓度牛蒡子苷作用于3T3-L1前脂肪细胞,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测其对细胞增殖的影响;油红O染色及分光光度法分析脂肪细胞的分化程度;实时荧光定量PCR检测细胞过氧化物酶增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators activatedreceptorγ,PPARγ)和CCAAT/增强子结合蛋白α(CCTTA enhancer binging proteinα,C/EBPα)的表达情况。【结果】牛蒡子苷对3T3-L1细胞增殖无显著性影响(P>0.05),但可显著抑制3T3-L1前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化(P<0.05或P<0.01),且呈一定剂量依赖关系;与空白对照组比较,牛蒡子苷可显著降低PPARγmRNA、C/EBPαmRNA表达水平(P<0.05或P<0.01)。【结论】牛蒡子苷能抑制3T3-L1前脂肪细胞的成脂分化,其机制可能与其能抑制脂肪细胞分化相关调控因子PPARγ和C/EBPα的表达有关。