低剂量的甲醛诱导MRC5损伤耐受差异表达基因的研究

目的　用荧光差异显示PCR(fluoroDD PCR)方法寻找低剂量的甲醛(FA)诱导人胚肺成纤维细胞(MRC 5 )损伤耐受差异表达的基因。方法　用MTT方法得到FA对MRC 5毒性的剂量-反应关系。根据剂量-反应关系选择对MRC 5几乎没有损伤或有增殖的剂量作为低剂量,对细胞有明显损伤的剂量为高剂量,然后用低剂量、高剂量、损伤耐受模式(低剂量预刺激后继而用高剂量刺激)三种方式处理细胞,通过荧光差异显示PCR技术寻找不同处理组与对照组比较差异表达的基因。对其中的11个差异条带进行二次PCR、克隆、测序,在GeneBank上通过Blast鉴定基因。结果　根据FA对MRC 5毒性的剂量-反应关系,选择10 0 μmol L为低剂量、10mmol L为高剂量。然后按方法中所述的方式处理细胞后,用荧光差异显示PCR的方法发现有6 1个差异表达的基因。对其中的11个差异条带进行鉴定,发现有2个已知基因,分别与nuclearfactorofactivatedT cells 5 (NFAT5 )和tetratricopeptiderepeatdomain 3(TPRD 3)高度同源,其余9个为新基因。结论　FA在低剂量可以促进MRC 5的增殖,通过荧光差异显示PCR获得6 1个FA诱导MRC 5损伤耐受差异表达的基因,通过对其中11个差异条带的鉴定,为进一步研究FA诱导MRC 5损伤耐受的机制提供线索。     

低剂量过氧化氢诱导机体适应性反应差异表达基因的研究

目的寻找低剂量过氧化氢(H2O2)诱导人胚肺成纤维细胞(MRC-5)适应性反应差异表达的基因。方法用溴化四氮唑蓝(MTT)法检测细胞存活率得到H2O2对MRC-5毒性的剂量反应关系,分别用低剂量、高剂量和低剂量预刺激后用高剂量攻击细胞,观察细胞生长的变化,得到低剂量H2O2诱导MRC-5的适应性反应模型。然后用荧光差异显示聚合酶链反应(FluoroDD-PCR)寻找不同方式刺激的差异表达基因。结果根据H2O2诱导MRC-5毒性的剂量反应关系,选择0.088、0.88、8.8、88μmol/L为低剂量,1100μmol/L为高剂量,用低剂量处理细胞24h,然后用高剂量刺激1h,可以观察到在0.88μmol/L预刺激细胞24h后,对继而1100μmol/L的刺激有明显的抵抗效应。对不同方式处理的细胞RNA进行FluoroDD-PCR,找到60个差异条带。对其中的15个差异条带进行克隆鉴定同源性比较,发现其中7个已知基因,8个新基因。结论H2O2可以诱导MRC-5的适应性反应过程,用FluoroDD-PCR方法找到差异表达的基因。     

镍转化人胚肺细胞中差异表达基因的克隆

目的 分析并克降镍转化细胞与对照组细胞中差异表达的基因,以期了解镍化合物诱发癌６变的分子机制。方法 应用差异显示ＰＣＲ方法分离对照和转化细胞间具有关 表达的基因,用ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ方法将差异基因片段克隆到质粒中,循环测序,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交分析。结果 从转化与对照细胞中分离并克隆到多个差异基因片段,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ分析表明其中２个为确定的差异表达基因（暂称之为ＭＳ５１５一ＩＣ８２）。测序后与     

利用蛋白质组学技术研究三氯乙烯刺激肝细胞后蛋白质差异表达

目的应用双向电泳及串联质谱技术，研究不同剂量三氯乙烯（TCE）诱导L-02肝细胞蛋白质表达谱的差异。方法L-02肝细胞分别用不同剂量TCE和溶剂对照（二甲亚砜）处理后，提取细胞总蛋白，双向凝胶电泳分离蛋白质组成分，银染显色，经ImageMaster 2D Platinum 5．0软件分组分析比较四组图谱，并对差异蛋白斑点进行基质辅助激光解吸／电离飞行时间串联质谱（MALDI-TOF-TOF-MS）分析鉴定。结果得出差异较明显的蛋白质斑点15个，不同剂量TCE刺激后表达分别上调、下调或消失，提示TCE可引起肝细胞蛋白表达发生改变。通过质谱鉴定和IPI human数据库检索，鉴定了其中9个TCE诱导L02肝细胞相关的蛋白质。结论这些结果为深入研究TCE毒作用相关的蛋白质及TCE毒作用的分子标志物提供依据，并为阐明TCE毒作用的分子机制提供线索。     

低剂量三氯乙烯诱导下谷胱甘肽转移酶Ω-1的表达变化

目的分析低剂量三氯乙烯(TCE)诱导的细胞兴奋效应时,谷胱甘肽转移酶Ω-1(GSTO-1)的表达变化。方法利用前期的双向电泳和质谱结果,参照前期兴奋效应的剂量设计,提取染毒细胞的mRNA和总蛋白,进一步使用实时定量RT-PCR和Western blotting分别从mRNA和蛋白水平上验证GSTO-1的表达变化。结果 Western blotting分析发现,0.1mmol/LTCE剂量组能诱导GSTO-1蛋白表达是对照组的2倍,但随着剂量的增加,蛋白表达改变不明显(与对照组相比,P<0.05)。RT-PCR结果提示:低剂量TCE能诱导GSTO-1基因表达增加,随着剂量的增加,表达反而有所减少。结论低剂量TCE能诱导GSTO-1基因及蛋白表达增加。     

三氯乙烯变态反应病人外周血凋亡基因表达水平的研究

目的:探讨三氯乙烯(TCE)变态反应病人外周血凋亡基因BAX、BAD、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9的mRNA表达水平变化情况。方法:抽取健康人(对照组)和三氯乙烯变态反应病人(病例组)抗凝外周全血,采用实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR)技术检测外周血中BAX、BAD、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9的mRNA的表达水平。结果:TCE变态反应病人(病例组)BAX、BAD、Bcl-2基因mRNA表达水平与对照组相比较,分别升高85%1、39%、227%(P<0.01);病例组Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9基因mRNA表达水平也比对照组分别升高130%、231%2、49%(P<0.01)。结论:三氯乙烯病人外周血凋亡基因表达水平明显高于对照组,提示这些凋亡基因可能与TCE引起的变态反应存在一定的关联。     

三氯乙烯对作业工人淋巴细胞DNA损伤的研究

目的 观察三氯乙烯作业工人的DNA损伤情况,探讨三氯乙烯对作业工人的遗传毒性.方法 检测作业工人工作场所空气中三氯乙烯时间加权平均浓度,测定作业工人班后尿中三氯乙酸浓度,运用单细胞凝胶电泳(SCGE)检测50名三氯乙烯作业工人外周血淋巴细胞DNA损伤情况.结果 三氯乙烯作业工人班后尿中三氯乙酸浓度大于对照组(P＜0.01),DNA损伤情况与对照组比,差异有统计学意义(P＜0.05),三氯乙烯作业工人尿中三氯乙酸浓度与淋巴细胞DNA损伤水平存在剂量-效应关系.结论 长期接触三氯乙烯可导致作业工人淋巴细胞DNA损伤.     

代谢酶基因多态性与三氯乙烯作业工人染色体损伤关系的研究

目的研究代谢酶基因多态性与三氯乙烯(TCE)作业工人外周血淋巴细胞染色体损伤易感性的关系。方法选取某金属保温壶生产企业接触TCE的91名工人和无接触TCE的59名工人作为调查对象,收集其职业史、年龄、性别、吸烟和饮酒等信息;测定其尿中三氯乙酸浓度来反映TCE暴露内剂量;用胞质分裂阻滞微核法制备外周血淋巴细胞涂片,计数微核、核质桥和核芽的发生率,评价染色体损伤水平;用聚合酶链式反应(PCR)方法分析CYP2E1、GSTP1、GSTT1、GSTM1基因的多态性;使用协方差分析不同基因型与染色体损伤的关系。结果 TCE接触工人中,CYP2E1RsaI位点变异基因型个体核芽率为(1.6±1.2)‰,高于野生基因型个体[(1.5±0.9)‰,P<0.05]。将微核率、核质桥率、核芽率相加以表示总的染色体损伤程度,再进行分析,显示CYP2E1RsaI位点变异基因型个体总的染色体损伤水平为(3.9±1.8)‰,高于野生基因型个体[(3.5±1.8)‰,P<0.05]。同时显示,GSTP1Ile105Val位点变异基因型个体总的染色体损伤水平(3.8±1.8‰)高于野生基因型个体[(3.7±1.8)‰,P<0.05]。结论 CYP2E1和GSTP1基因多态性能够影响职业TCE接触个体外周血淋巴细胞染色体损伤水平,尤其是核芽率的水平。     

用32P后标法检测三氯乙烯所致DNA损伤的研究

目的探讨三氯乙烯（TCE）4周静式吸入下对雄性大鼠所致DNA损伤.方法将TCE分为4个浓度组,对雄性大鼠静式吸入染毒,用32后标法检测肝脏组织和外周血白细胞（WBC）DNA损伤.结果与对照组比较,剂量组放射自显影指纹图多2～3个斑点;1～4周各剂量组肝脏组织和外周血WBC TCE-DNA加合物含量增加,与对照组比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）;各浓度组TCE-DNA加合物含量均随TCE染毒剂量量的增加而增加,呈一定的线性趋势和剂量-效应关系;经4周染毒后再饲养1周的大鼠肝脏组织和外周血WBC TCE-DNA加合物各浓度组间差异无统计学意义（P＞0.05）;同一剂量组1～4周肝脏组织TCE-DNA加合物含量均先升高后降低再升高,而外周血WBCTCE-DNA加合物含量同一剂量组各时间点差异无统计学意义（P＞0.05）;各剂量组肝脏组织和外周血WBC TCE-DNA加合物相关性良好.结论4周静式吸入TCE对受试动物有一定的DNA损伤.     

三氯乙烯作业人群外周血淋巴细胞染色体损伤研究

目的探讨三氯乙烯(TCE)致作业人群外周血淋巴细胞染色体损伤的作用。方法以91名TCE暴露工人和59名对照作为研究对象,调查职业史、年龄、性别、吸烟和饮酒等信息。收集班后尿,测定尿中三氯乙酸(TCA)水平反映TCE暴露内剂量。抽取肘静脉血,胞质分裂阻滞微核法制备外周血淋巴细胞涂片,计数微核、核质桥和核芽发生率,评价染色体损伤水平。结果两组研究对象在年龄、性别、吸烟、饮酒状况等方面均无显著性差异。暴露组平均TCE作业工龄为1.8年。暴露组尿中TCA水平为57.5mg/L,远远高于对照组0.9mg/L。两组研究对象的微核率及核质桥率无显著差异,但暴露组核芽率[(1.6±1.0)‰]显著高于对照组[(1.2±0.8)‰,P=0.05]。核芽率的升高在尿TCA≥50.0 mg/L组和TCE作业工龄≥1.8年组中表现更为明显。同时,尿TCA≥50.0 mg/L的工人,其微核率[(1.8±0.9)‰]也显著高于对照组[(1.4±0.7)‰,P=0.05]。未发现年龄、性别、吸烟、饮酒对微核率、核质桥率、核芽率的显著影响。结论 TCE暴露可致作业工人染色体损伤增加,核芽可以较为敏感的检出由TCE职业暴露所引发的基因组不稳定性。     

职业性接触三氯乙烯引起多器官损害的分析

目的　对职业接触三氯乙烯 (TCE)引起多器官损害的临床表现进行分析。方法　对 2 0 0 2～ 2 0 0 3年深圳发生的 12例典型TCE中毒病人进行调查 ,记录每个病人的职业接触情况、主要临床症状和体征 ,对血常规、肝功能、尿常规、尿三氯乙酸(TCA)、心电图进行检查分析。结果　 12例中毒病人中 11人发生在电子厂与五金制品厂 ;TCE接触工龄 16～ 3 9d ,平均 2 8.4d ;具有头晕、头痛、皮肤瘙痒、发热的病人分别为 91.6%、83 .3 %、10 0 %和 66.7% ;具有皮肤红斑、皮疹、水疱任意 1项者分别为 83 .3 %、91.6%和 41.6% ;肝肿大 3人 (2 5 % ) ,尿蛋白阳性 2人 (16.7% ) ;丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、总胆红素异常率分别为 91.6%、66.7%、41.6% :8人检查心电图 3人异常 ,10人测定尿TCA升高 7人。结论　TCE可引起神经系统、皮肤、肝脏损害 ,同时对心脏、肾脏也有一定影响。     

三氯乙烯暴露致小鼠肝功能损害与Treg细胞的关系

目的检测分析TCE暴露小鼠肝功能、肝脏Treg细胞分泌的细胞因子IL-10含量以及脾脏Treg细胞数量的变化,探讨Treg细胞与TCE暴露所致肝功能损害的关系。方法雌性BALB/c小鼠饮水摄入2.5 mg/ml和5 mg/ml的TCE,在2、4、8、12周时采集外周血用全自动生化仪测定肝功能,ELISA检测肝组织匀浆IL-10含量,流式细胞仪检测脾脏Treg细胞数量。结果与对照组相比,TCE染毒组小鼠AST和ALT水平明显升高,2周和4周时差异有统计学意义(P<0.05),肝组织匀浆中IL-10含量则明显降低(4周时最低);脾脏Treg细胞数量也明显降低,2、4、8周时差异均有统计学意义(P<0.05);相关分析显示肝功能与肝组织中IL-10含量和Treg细胞数量均呈负相关,且有统计学意义(P<0.05)。结论 TCE暴露引起的肝脏损伤与体内Treg细胞数量减少或功能受损相关。     

三氯乙烯对肝细胞凋亡基因和肝代谢酶基因表达水平的影响

目的研究三氯乙烯（TCE）对人肝细胞凋亡基因（Caspase-3、Caspase-8、BAX、Bcl-2）和肝代谢酶基因(CYP1A2、CYP2E1、CYP3A4) mRNA表达水平的影响。方法用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养肝细胞,DMSO作为溶剂对照,采用不同浓度TCE（0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mmol/L）染毒L02肝细胞24 h,另外用TCE 1.0 mmol/L染毒细胞不同时间（2 h, 4h, 8h, 16h, 32h）,采用Real-time 荧光定量PCR技术检测肝细胞中凋亡基因和CYP基因mRNA表达水平。结果不同剂量TCE染毒后,凋亡基因Caspase-3、Caspase-8、BAX表达水平比对照组升高21%~145%,差异有统计学意义（P<0.05 或P<0.01）, Bcl-2表达水平下降20%~35%。TCE染毒引起CYP1A2、CYP3A4、CYP2E1的 mRNA表达明显上升,比对照组升高30%~550%,差异有统计学意义（P<0.05 或P<0.01）。用TCE 1.0 mmol/L染毒2 h~32 h,同样发现凋亡基因和肝代谢酶基因表达增加,与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05,或P<0.01）。结论TCE可引起肝细胞凋亡基因和肝代谢酶基因表达变化,凋亡基因和肝代谢酶基因可能在TCE对肝细胞毒性效应中发挥重要作用。     

三氯乙烯诱发豚鼠过敏性皮炎的免疫学效应

目的研究三氯乙烯(TCE)诱发豚鼠过敏性皮炎的免疫学效应。方法采用豚鼠最大值法建立TCE致敏动物模型,应用ELISA双抗体夹心法定量检测血清中IgG含量;用MTT法测定刀豆蛋白A刺激下T淋巴细胞的增殖转化功能,用乳酸脱氢酶释放法测定NK细胞功能。结果TCE的致敏率为667%,属强致敏物。TCE致敏豚鼠血清总IgG含量明显高于阴性对照组(P<005)。TCE致敏豚鼠脾T淋巴细胞增殖转化功能及NK细胞对瘤细胞的杀伤活性与对照组相比无显著性差异(P>005)。结论体液免疫在TCE诱发过敏性皮炎过程中发挥一定的作用。在本染毒方式和染毒剂量下,未见TCE对豚鼠T淋巴细胞和NK细胞活性的影响。     

Long-term follow-up after single toxic exposure to trichloroethylene

In an earlier report [Feldman and Lessell, 1967], neurologic findings following acute intoxication to trichloroethylene were presented. Facial anesthesia, asymmetric pupillary responses, and electrical evidence of sensorimotor neuropathy accompanied neuropsychological deficits, manifested by difficulty in solving sequential problems and poor memory affecting the acquisition of new information. Twelve years after the initial exposure, patches of hypalgesia over the malar eminences persisted and corneal reflexes remained absent, although sensation in the snout region was totally normal. Neuropsychological test results continued to demonstrate impaired attention and short-term memory as well as diminished visuospatial organization and sequencing, 16 years after exposure. In addition, MMPI profile and interview suggested continued depressive symptomatology. Eighteen years after exposure, findings included paresthesia and hypalgesia in the malar area of the face as well as myokymia of the facial muscles. Facial nerve latency studies were normal as were pattern shift visual evoked responses. The patient continued to have large pupils that reacted asymmetrically to light. In the right eye, contraction was synchronous in all segments of the sphincter. In the left eye, there was segmental contraction, suggestive of a tonic pupil. This report offers evidence of long-term residual oculomotor and ciliary reflex dysfunction as well as impaired neuropsychological performance as a result of acute TCE intoxication.     

三氯乙烯所致接触性皮炎小鼠免疫功能的变化

目的研究三氯乙烯(TCE)刺激BALB/c小鼠产生接触性皮炎,观察TCE对小鼠免疫功能的影响。方法采用背部皮内注射TCE染毒BALB/c小鼠,观察脾脏、胸腺脏器系数的变化情况,对脾和胸腺细胞进行体外淋巴细胞活力和增殖功能测定,腹腔巨噬细胞吞噬功能测定,NK细胞杀伤活性测定及小鼠血清中肿瘤坏死因子(TNF-α)、干扰素(IFN-γ)含量的测定。结果TCE实验组胸腺脏器系数显著低于阴性对照组(P<0.01);TCE实验组T淋巴细胞活力及增殖能力显著高于阴性对照组(P<0.01);TCE实验组的巨噬细胞吞噬率和NK细胞杀伤活性显著高于阴性对照组(P<0.01);TCE实验组小鼠血清中TNF-α的含量显著高于阴性对照组(P<0.01)。结论三氯乙烯能够诱发接触性皮炎,其中毒机制属于迟发型超敏反应。     

职业性三氯乙烯药疹样皮炎患者血清肝纤维化指标的研究

目的研究三氯乙烯药疹样皮炎患者肝损害指标透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(C-Ⅳ)、甘胆酸(CG)的水平,探讨三氯乙烯皮炎肝损害后肝纤维化指标的改变,为判断三氯乙烯药疹样皮炎肝损害的预后提供依据.方法对28名三氟乙烯药疹样皮炎及16名对照组进行放射免疫法检测HA、LN、PCⅢ、C-Ⅳ、CG水平,并对中毒组与对照组、皮炎轻重不同组进行对比分析,对血清肝纤维化损害指标与常规肝损害指标进行相关分析.结果肝损害指标HA、PCⅢ、C-Ⅳ、CG等在三氯乙烯药疹样皮炎患者明显增高(P＜0.05),与丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆红素、胆汁酸等肝损害指标有良好的相关性.严重皮炎组血清肝纤维化指标值低于一般皮炎组,LN在三氟乙烯皮炎病例反而低于对照组.结论 HA、PCⅢ、C-Ⅳ、CG检测可以作为三氯乙烯药疹样皮炎患者肝损害程度的评价指标.三氯乙烯药疹样皮炎患者皮肤病变的严重程度与患者肝损害后肝纤维化指标不平衡.三氯乙烯皮炎患者肝损害可引起多个肝纤维化指标明显升高.