基因重组hVEGF165腺相关病毒载体的包装和鉴定

目的:采用rAAV Helper free System构建hVEGF165腺相关病毒和增强型绿色荧光蛋白腺相关病毒,并初步鉴定其感染情况。方法:采用AAV-Helper free system包装系,构建hVEGF165腺相关病毒和增强型绿色荧光蛋白腺相关病毒载体质粒,应用电穿孔方法质粒共转染HEK293细胞,分离纯化后获得rAAV-hVEGF165和rAAV-EGFP,AVSachTMELISA法测定rAAV颗粒滴度,并鉴定其对HEK293细胞的感染情况。结果:包装纯化后获得病毒滴度可达到2×1011,电镜观察病毒颗粒均匀,病毒大小20～25nm,呈多面体形态。结论:成功包装hVEGF165腺相关病毒和增强型绿色荧光蛋白腺相关病毒。     

人VEGF165基因的克隆、表达和活性鉴定

目的 克隆人VEGF165基因,构建其真核表达质粒,转染293细胞,并鉴定表达VEGF的生物学活性。方法采用PCR法从人心脏cDNA文库钓取人VEGF165基因,插入pUC19载体测序后与真核表达质粒pAdTrackCMV连接,阳离子脂质体Lipofectamin介导VEGF基因转染293细胞,Northern blot和Western blot法分别检测VEGFmRNA和蛋白的表达,Miles试验进行活性鉴定。结果(1)琼脂糖凝胶电泳分析得到两个片段,分别为582bp的VEGF165DNA和2．68kb的pUC19线性质粒,结果与理论值相符,VEGF165测序结果与GENE BANK中VEGF165序列完全一致。(2)转染293细胞后表达绿色荧光蛋白,转染后第3天(1024pg／ml)和5天(986pg／ml)VEGF表达最高,明显高于转染前(102pg／ml)。(3)Miles试验结果显示,用转染AdTrackCMV-VEGF165细胞培养上清皮下注射后10分钟左右皮丘变为蓝色,成倍连续稀释后,出现蓝斑的时间延长,蓝斑范围也相应缩小。而注射未转染293细胞培养上清和生理盐水组则未见蓝斑出现。结论成功克隆人VEGF165基因,并表达出具有生物学活性的VEGF蛋白。     

重组腺相关病毒载体在肺癌治疗中的应用

重组腺相关病毒（recombination Adeno-associated virus,rAAV）突出的特点使其成为基因治疗载体中的佼佼者,本文综述了rAAV基因药物在肺癌治疗中取得的进展并对其未来发展趋势进行了探讨。     

重组腺相关病毒(rAAV)基因治疗制品质控检验技术重点考量

近些年,国内基因治疗行业迅速发展,创新制品不断涌现,如何对该类制品进行有效的质量控制成为业界十分关心的问题。本文借鉴基因治疗制品质量控制领域中相对成熟的、有效的、实用性被证明的方法,以重组腺相关病毒基因治疗制品为例,从检测项目与检测方法的选择、注意事项、质量标准的拟定等方面出发,阐述了其质量控制检验项目及相关技术要求。希望本文能为从业者开展该类制品的质量控制研究提供参考,并通过后续的交流讨论可达成一定共识,进而加速推动我国基因治疗行业的发展。     

腺相关病毒载体介导的肿瘤基因治疗研究进展

基因治疗有望成为肿瘤治疗的有效手段,用于携带外源基因的载体在肿瘤基因治疗中发挥了重要作用.其中腺相关病毒(AAV)载体具有安全性高、长效表达、宿主范围广泛等优点,在基因治疗中得到越来越广泛的应用.本文重点综述AAV的生物特点、载体发展及其在肿瘤基因治疗中的应用.     

重组腺相关病毒2型/人凝血因子IX的质量研究重组腺相关病毒2型/人凝血因子IX的质量研究

目的研究并建立重组腺相关病毒2型/人凝血因子IX(recombinant adeno-associated virus type 2/human blood coagulation factor IX,rAAV-2/hFIX)的质量标准。方法采用PCR法确认病毒所携带的重组核酸结构和测定辅助病毒(helper virus)和野生型腺相关病毒（wtAAV）的残留片段。SDS-PAGE电泳测定病毒外壳蛋白分子量及纯度，TSK gel SP-NPR阳离子交换柱系统测定病毒颗粒纯度。以斑点杂交法测定病毒颗粒数。一期法于IX因子基因剔除小鼠体内测定rAAV-2/hFIX生物学活性，并通过ELISA法测定感染BHK-21细胞后hFIX的表达量。结果PCR法确证病毒的重组核酸结构与构建预期相同；在1×10⁷ VG的rAAV-2/hFIX颗粒中，残留辅助病毒的基因片段数少于1个拷贝；在1×10⁸ VG的rAAV-2/hFIX颗粒中，野生型AAV-2基因片段数少于1个拷贝。病毒颗粒及外壳蛋白纯度均大于98%，病毒颗粒数大于1.0×10₁₅VG·L^-1(virus genome·L^-1)。IX因子剔除小鼠肌肉注射病毒后21 d，小鼠血液中人凝血因子IX活性达到大于正常人因子IX活性的15%，IX因子的体外表达水平大于20.0 μg·L^-1。其他各项检测指标均符合规定。结论建立了rAAV-2/hFIX的质量标准，用于控制产品质量。     

关于重组腺相关病毒基因治疗制品药学评价的思考

重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus, rAAV)载体与其他病毒载体相比,具备感染能力强、可持续表达目的基因、无致病性和非基因组整合等优点,已成为体内基因治疗的主要病毒载体。目前,国际上已有3个rAAV相关的基因治疗产品获批上市,另有两百余个候选药物正在开展临床试验。但是,国内工业界在开发临床应用级rAAV产品时面临诸多挑战,监管方对于此类产品的药学评价也缺乏实际审评经验。为此,本文总结了rAAV基因治疗产品的最新研究进展,从原材料、生产工艺及质量控制等方面对此类产品的药学评价考虑要点展开讨论,以期促进此类产品的临床转化与应用。     

大鼠星状细胞激活相关蛋白基因的克隆及其重组腺相关病毒载体的构建

克隆大鼠星状细胞激活相关蛋白(Stellate Cell Activation-associated Protein,STAP)基因,构建其重组腺相关病毒载体(rAAV-STAP),为进一步研究STAP基因功能提供有效工具。用RT-PCR法从大鼠肝组织中扩增出大鼠STAP基因,将STAP cDNA插入腺相关病毒(AAV)表达质粒pAM/CAG中,构建重组质粒pAM/CAG-STAP。以磷酸钙共转染法将pAM/CAG-STAP及辅助质粒pAd/H22转染293细胞,经293细胞包装后得到复制缺陷型重组腺相关病毒rAAV-STAP。ELISA法测定病毒滴度,Western blot法检测重组病毒感染293细胞后STAP的表达情况。实验结果表明,RT-PCR法从大鼠肝组织中扩增出573bp cDNA,测序证实为大鼠STAP基因。Western blot法证实rAAV-STAP感染293细胞后可在细胞内表达STAP。     

降低重组腺相关病毒载体中空病毒颗粒的对策

可稳定表达治疗基因而无明显不良反应的重组腺相关病毒(rAAV)载体被认为是最有发展前景的基因治疗载体。但如何建立可以有效去除rAAV载体中具潜在致病危害的空病毒颗粒,使产品质量符合临床使用要求的纯化工艺是研究人员面临的巨大挑战。以下总结了空病毒颗粒形成的过程及有别于rAAV载体的特点,并对可以将其与rAAV载体有效分离的技术手段进行了评价。     

重组腺相关病毒载体的免疫性研究及其解决策略

重组腺相关病毒载体（rAAV）作为一种高靶向性和良好安全性的病毒载体,在基因治疗的临床前和临床研究中具有极广泛的应用前景。目前在全球范围内已有71项临床研究在进行之中或已经完成。其中有相当部分在血友病、视网膜疾病、帕金森、囊性纤维化以及癌症等疾病的治疗中都取得了显著疗效。随着临床上的成功,人们对rAAV所引起的免疫性及其应对策略也进行了更为广泛而深入的研究。本文将就rAAV的外壳蛋白以及目的基因产物所引起的免疫性进行综合探讨,并结合我们的部分研究工作从改变外壳蛋白、给药方式以及消除内源性外壳蛋白的表达等方面对消除外壳蛋白所引起的免疫性的一些策略加以详述。     

携带人S100A1基因的重组腺相关病毒载体的构建及鉴定

目的:构建携带有人S100A1基因的重组腺相关病毒(Adeno-associated viru,AAV)载体,并对其进行鉴定.方法:用BamH I和EcoRI 将目的基因pUC57-Simple-S100A1和腺相关病毒骨架质粒pAAV-IRES-ZsGreen1行双酶切,回收酶切质粒的目的片段进行连接,产物转化感受态DH5a,获得重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-IRES-ZsGreen1-S100A1.酶切及测序鉴定后,将pAAV-IRES-ZsGreen1-S100A1、包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper三质粒共转染AAV-293,包装重组腺相关病毒rAAV-IRES-ZsGreen1-S100A1.收获重组病毒后感染HEK293细胞,荧光计数法测定病毒滴度,病毒基因组外源基因扩增鉴定重组病毒的包装是否成功.结果:重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-IRES-ZsGreen1-S100A1经双酶切和测序鉴定正确;荧光显微镜下观察转染AAV-293细胞72 h后,病毒包装效率达95％～100％,荧光计数法测定病毒感染滴度达(2～3)×107 TU/mL;提取重组病毒基因组成功扩增出外源目的基因S100A1片段.结论:成功构建携带有人S100A1的重组腺相关病毒载体rAAV-IRES-ZsGreen1-S100A1,收获的病毒具有较高滴度,为今后利用腺相关病毒载体进行S100A1基因转染治疗慢性心力衰竭的体外及体内研究提供了实验基础.     

基因免疫使用的腺相关病毒载体

基因免疫开创了疫苗研究的新纪元,这种免疫方法提供了稳定而且长期不断的蛋白抗原来源.DNA疫苗制备简单,没有明显的毒性或宿主免疫力并能有效诱导体液和细胞免疫.使用病毒载体的DNA疫苗在一些临床前实验模型中具有较高的基因转移效率和诱导保护性与治疗性免疫作用.本文论述了腺相关病毒在疫苗研制中的应用潜力.     

腺相关病毒载体介导的VEGF121基因的构建及其在人脐静脉内皮细胞的表达

目的 研究腺相关病毒载体介导人血管内皮生长因子基因(AAV-VEGF121)的体外促血管内皮细胞生长作用.方法 RT-PCR法获取人VEGF121基因,克隆入pAAV-MCS载体中,构建成pAAV-VEGF121(处理组),以空白载体克隆入pAAV-MCS病毒(对照组);两组分别在AAV-293细胞中包装成pAAV-VEGF121病毒颗粒和空白病毒颗粒.相同条件下,两组分别感染人脐静脉内皮细胞(HUVEC),半定量RT-PCR检测细胞内VEGF121基因mRNA的表达;CCK-8法测取OD450nm值,绘制细胞增殖曲线;电子显微镜观察细胞超微结构的改变.结果 成功构建AAV-VEGF121;半定量RT-PCR显示处理组细胞内VEGF121的mRNA表达水平高于对照组(P＜0.01);细胞增殖曲线显示处理组细胞增殖能力明显高于对照组;透射电镜显示处理组细胞内与蛋白质合成有关的细胞器增生明显活跃.结论 AAV-VEGF121基因对血管内皮细胞的生成具有促进作用.     

艾滋病疫苗替代品腺相关病毒介导抗体基因的研究进展

重组腺相关病毒(rAAV)载体介导的抗体基因治疗药物,可为宿主直接提供中和抗体而使其免受艾滋病毒感染,有望成为艾滋病预防及治疗疫苗的替代品。综述人免疫缺陷病毒(HIV)专属性广谱中和抗体发现过程的文献资料,介绍了rAAV介导的抗HIV抗体基因治疗的试验结果,并对rAAV在艾滋病预防及治疗的研究进展作了分析。     

基因免疫使用的腺相关病毒载体

基因免疫开创了疫苗研究的新纪元，这种免疫方法提供了稳定而且长期不断的蛋白抗原来源。DNA疫苗制备简单，没有明显的毒性或宿主免疫力并能有效诱导体液和细胞免疫。使用病毒载体的DNA疫苗在一些临床前实验模型中具有较高的基因转移效率和诱导保护性与治疗性免疫作用。本文论述了腺相关病毒在疫苗研制中的应用潜力。     

口服重组腺相关病毒基因药物

重组腺相关病毒 (rAAV) 载体介导的口服基因药物引起业界广泛的重视。尽管经口服给药后转基因的有效表达面临许多障碍, 但该技术的有效性已得到大量实验证实。本文总结了口服rAAV基因药物的临床前研究结果, 重点阐述了该类型药物的传递、吸收、分布和基因转导等药动学特点。已证实rAAV基因药物对人体的安全性高, 但口服rAAV基因药物的临床应用仍需对其作用机制和生物药剂学特征进行深入和广泛的研究。     

CGE-LIF方法分析重组腺相关病毒(rAAV)衣壳蛋白的比例含量

目的:建立毛细管凝胶电泳串联激光诱导荧光检测器(CGE-LIF)方法分析重组腺相关病毒(rAAV)衣壳蛋白VP1、VP2和VP3比例含量并进行方法学验证。方法:CGE-LIF分析rAAV衣壳蛋白方法为：rAAV样品加入4%SDS-150 mmol·L^-1 NEM的溶液预变性(70℃,5 min);再加入P503染料标记(70℃,10 min);再加入1%SDS进行变性(70℃,5 min),然后混匀上机检测。方法验证包括准确性、精密度、线性、检测限、定量限,耐用性等。另外考察了P503、TAMRA、FQ 3种染料条件及rAAV不同血清型和部分批间一致性。结果:CGE-LIF分析不同血清型rAAV(包括2、5、8、9、10型)可将其衣壳蛋白VP1、VP2和VP3基线分离并且峰形尖锐。准确性显示衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的实测结果与预期结果的相关系数r>0.99;重复性结果显示每个衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的迁移时间RSD均<1.5%,校正峰面积百分比的RSD均<5%;中间精密度结果显示衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的迁移时间RSD均<...     

基于腺相关病毒载体的癌症免疫治疗研究进展

腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)载体因其出色的基因传递能力和安全性已经成为基因治疗领域的重要工具。近年来,将AAV载体用于癌症免疫治疗已成为一个新的热点研究方向,主要包括以下几个方面：一是基于AAV载体的新型肿瘤疫苗的开发,通过AAV载体表达肿瘤相关抗原,激活机体的特异性抗肿瘤免疫反应;二是AAV载体介导的免疫细胞修饰,通过AAV载体对免疫细胞进行编辑并用于过继性细胞治疗;三是AAV载体介导的细胞因子的传递,通过AAV载体持续表达抑制肿瘤生长的细胞因子,调节肿瘤微环境和免疫平衡。这些策略均展现出了良好的应用前景,但在实际应用中也存在着一些挑战,如免疫消除、转导效率低等问题。文章将对近年来基于AAV载体的肿瘤免疫治疗的研究进展进行综述,并总结研究中存在的挑战及未来发展方向,以期对这一拥有广泛前景的领域的研究提供参考。     

应用SEC-UV-MALS-RI技术分析重组腺相关病毒(rAAV)的颗粒滴度和实心率

目的:建立分子排阻色谱(SEC)串联紫外检测器(UV)、多角度激光散射检测器(MALS)和示差检测器(RI)的方法分析重组腺相关病毒(rAAV)的颗粒滴度和实心率。方法:对rAAV、rAAV空壳对照品和二者混合样品进行SEC-UV-MALS-RI串联分析,流动相为50 mmol·L^-1磷酸盐缓冲液,流速为0.3 mL·min^-1,进样量为50μL,温度为室温,采集时间为30 min;紫外检测器选择260 nm和280 nm双通道;18角度激光散射检测和示差检测采用系统默认设置;用WYATT软件分析结果。结果:样品颗粒滴度为4.816×10¹² vp·mL^-1,RSD为0.37%;空壳对照品颗粒滴度为3.199×10¹² vp·mL^-1,RSD为0.75%。按不同预设比例混合的5份样品颗粒滴度的RSD均在3%以内,实心率RSD均在4%以内。混合样品的颗粒滴度和实心率测定结果与预期值基本一致。结论:采用SEC-UV-MALS-RI方法可以分析rAAV制品的颗粒...     

腺相关病毒载体纯化技术的研究进展

目的:综述腺相关病毒(AAV)载体的分离纯化方法,为AAV的规模化制备提供参考。方法:以"AAV""Purity""Chromatography""腺相关病毒""纯化"等为关键词,组合检索2000年1月-2015年8月在Pub Med、Web of Science、Elsevier、中国知网、维普等数据库中有关AAV分离纯化的文献,选择有代表性的文献进行归纳、总结,分别从AAV纯化的超速离心法、液相色谱法、化学试剂法和超滤法等4个方面进行综述。结果:共查阅到相关文献260余篇,其中有效文献48篇。液相色谱法纯化AAV表现优异,亲和色谱、离子交换色谱等色谱技术已经广泛用于AAV1、2、4、5、6、8、9等不同血清型载体的分离纯化,甚至较难分离的AAV的空壳载体也可以实现分离。但是每种血清型载体的理化性质不尽相同,很难用同一种方法纯化所有载体。结论:液相色谱法在规模化纯化AAV载体具备良好优势,但是应该根据不同血清型载体理化特征建立对应的纯化工艺。