人胎脑和SD大鼠脑中β—NGF的提取

目的 研究拟获得快速高效的β－NFG（β－神经生长因子）纯化方法,并为其生物特征研究和临床应用奠定基础。方法 通过低温高速离子、离子交换层析、透析等过程,从人胎脑和SD大鼠脑中分离纯化β－NGF,用SDS－PAGE分析其分子量和纯度,并经PC12细胞突起生长试验鉴定其生物学活性。结果 从人胎脑和SD大鼠脑中分离纯化得到的β－NGF提取物在SDS－PAGE图上均呈单一条带,它们都能很好地促进PC12细胞长出突起,且人胎脑β－NGF提取物促进PC12细胞长出突起的能力和人重组β－NGF差别无显著性。结论 实验获得了纯度高且生物活性良好的β－NGF。在分离纯化的其他参数不变时,分离纯化过程的总时间和温度对β－NGF的得率和生物学活性有明显影响。     

胎脑中神经生长因子（NGF）的提取及生物活性鉴定的研究

通过匀浆、离心、除脂、超滤及柱层析等过程，从中小月份引产的人胚胎脑中提取出较纯的ＮＧＦ。经ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶平板电泳发现其分子量为１６０００和３６０００的二个组分，大于小鼠ＮＧＦ１４０００的分子量；另外，其氨基酸组成与蛇及小鼠ＮＧＦ略有不同。本提取液能维持并促进鸡胚脊髓和背根神经节神经细胞在体外的存活和生长，具有良好的生物学活性及稳定性；毒性试验证实无刺激性及毒副作用。     

人β-NGF基因在大肠杆菌中的表达

目的:为β-NGF的基因制药选择一种新方法。方法：直接从人血细胞基因组DNA中PCR扩增出β-NGF基因片段，将构建的重组体pBV220-β-NGF转化大肠杆菌DH5α，并将筛选的阳性克隆通过4212诱导表达。结果经限制酶酶切电泳和DNA测序证实，确为β-NGF全长序列(约380bp)；全菌经SDS-PAGE电泳显示表达了β-NGF蛋白。结论：成功克隆了β-NGF基因全长序列并在大肠杆菌中获稳定表达。     

人β-NGF基因的体外扩增、克隆及其序列的分析

目的　对人β－ ＮＧＦ基因进行体外扩增和克隆及其序列分析,为其在真核细胞中的表达及其临床应用打下基础。方法　本实验设计并合成一对特异性引物,采用聚合酶链反应分别从人脑ｃＤＮＡ 和人睾丸ｃＤＮＡ 以及人脑基因组ＤＮＡ中扩增出β－ 神经生长因子（β－ ＮＧＦ）基因,并和Ｔ４ 载体相连接,经筛选得到人β－ ＮＧＦ克隆,并用Ｓａｎｇｅｒ 双脱氧末端终止法进行序列分析。结果　凝胶电泳显示在预期的位置出现阳性条带。结论　阳性克隆经序列分析证明克隆基因序列正确     

胎大鼠脑内小胶质细胞的分离纯化和鉴定

 摘要：目的 分离纯化和鉴定胎大鼠脑内小胶质细胞,为小胶质细胞的研究奠定基础。方法 利用盐酸利多卡因注射液联合震荡培养法分离纯化胎大鼠脑内小胶质细胞,免疫荧光技术及流式细胞技术鉴定小胶质细胞的纯度。结果 通过盐酸利多卡因注射液联合震荡培养法,得到98%纯度的小胶质细胞。结论 盐酸利多卡因注射液联合震荡培养法是一种能获得较高纯度胎大鼠脑内小胶质细胞的方法。     

人脑神经生长因子的分离和纯化及其生物学活性的鉴定

人胎脑经离心，透析和离子交换纤维素层析等方法，分离纯化２．５Ｓ神经生长因子。根据７ＳＮＧＦ和其活性亚单位β－ＮＧＦ的等电点的不同，分离得到２．５Ｓ的ＮＧＦ。用ＳＤＳ－聚丙烯酰胺电脉测得其分子量约１３．３。用等电聚焦电泳测得其等电点分别为９．０、９．２和９．３５。     

脑溢安对大鼠脑出血后神经生长因子和白细胞介素—1β表达 …

目的：观察脑出血后神经生长因子（ＮＧＦ）和白细胞介素－１β（ＩＬ－１β）的表达及中药制剂脑溢安的干预作用。方法：用Ⅶ型胶原酶于脑内定位注射诱导大鼠脑出血模型,通过Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交与ＥＬＩＳＡ方法检测出血后脑内ＮＧＦ与ＩＬ－１βｍＲＮＡ及其蛋白的表达与含量。结果：大鼠脑出血后第１ｄＮＧＦ与ＩＬ－１βｍＲＮＡ表达增加,第２ｄＮＧＦｍＲＮＡ下降至正常组水平,第４ｄ、７ｄ低于正常组水平;ＩＬ－１βｍＲ     

人脑神经生长因子的分离和纯化及其生物学活性的鉴定

人胎脑经离心、透析和离子交换纤维素层析等方法,分离纯化２．５Ｓ神经生长因子（ＮＧＦ）。根据７ＳＮＧＦ和其活性亚单位β－ＮＧＦ的等电点的不同,分离得到２．５Ｓ的ＮＧＦ。用ＳＤＳ－聚丙烯酰胺电脉测得其分子量约１３．３。用等电聚焦电泳测得其等电点分别为９．０、９．２和９．３５。在ＰＣ１２细胞的培养过程中,加入ＮＧＦ的提取物可以促进ＰＣ１２细胞的突起生长。     

新生儿脐动脉血β-NGF的测定及其意义

神经生长因子(nerve growth factor,NGF)由3个亚单位α、β、γ组成,其β亚单位具有完整的生物学功能.动物实验证明NGF水平与动物的生长发育有密切的关系[1].本研究通过检测新生儿脐动脉血β-NGF水平,探讨NGF与人类胎儿生长发育的关系.     

2.5S神经生长因子的提取纯化

通过二次CMSM52离子交换纤维素柱层析,从小鼠颌下腺分离纯化了2.5S神经生长因子。经SDS—聚丙烯酸胺凝胶电泳纯度鉴定,仅显示单一蛋白带。生物活性鉴定表明该纯化的神经生长因子可诱导鸡胚背根神经节轴突长出。     

生地黄中低聚糖的提取和纯化研究

目的研究从生地黄中提取分离低聚糖的工艺。方法以水苏糖的量为指标,采用正交试验优化水提取工艺,考察了除杂工艺中大孔树脂种类、洗脱液用量及活性炭脱色方法,并采用葡聚糖凝胶柱纯化得到生地黄低聚糖。结果优选的水提取工艺为:12倍量水,煎煮3次,每次0.5 h。水提取液经D-101大孔吸附树脂除杂,0.1%活性炭脱色3次,SephadexG15葡聚糖凝胶分离纯化获得生地黄低聚糖部位,其中水苏糖质量分数大于60%。结论该工艺从生地黄中提取分离低聚糖部位,工艺合理、可行,低聚糖部位收率达药材量的26%。     

都可喜和抗脑衰对痴呆大鼠记忆巩固能力及脑内NGF和BDNF含量的影响

目的：探讨都可喜和抗脑衰对痴呆大鼠记忆巩固能力及不同脑区神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)含量的影响。方法：选用老龄Wistar大鼠，制作血管性痴呆动物模型并观察药物对记忆巩固能力的影响；通过免疫组化技术研究药物对痴呆大鼠不同脑区NGF，BDNF含量的影响。结果：都可喜和抗脑衰均使痴呆大鼠游水迷宫全程时间明显缩短，5min入盲端错误次数明显减少；都可喜使痴呆大鼠额叶、海马、丘脑、杏仁核、小脑梨状细胞层和髓质的NGF表达增加一个级别，大鼠额叶、丘脑、尾状核、小脑髓质的BDNF表达也增加一个级别；抗脑衰使痴呆大鼠额叶、海马、小脑梨状细胞层和髓质的NGF表达增加一个级别，大鼠额叶、尾状核的BDNF表达增加一个级别。结论：都可喜和抗脑衰均能提高记忆巩固能力，改善痴呆程度，都可喜在提高脑内NGF、BDNF含量方面优于抗脑衰。     

大鼠精原细胞的分离纯化及免疫化学研究

目的探讨大鼠精原细胞的分离纯化方法及纯化后的细胞特性。方法应用复合酶消化法制备10d龄SD大鼠的睾丸单细胞悬液,采用差速贴壁结合非连续性Percoll密度梯度离心的方法纯化精原细胞。分别以c-kit和α6-整合素作为细胞标记,观察睾丸组织中的精原细胞与纯化后细胞的免疫化学特征。通过流式细胞仪分别检测纯化后细胞表达c-kit和α6-整合素的阳性率。结果在睾丸组织中精原细胞特异表达c-kit和α6-整合素。纯化后的单细胞中有c-kit和α6-整合素的阳性表达。流式细胞仪检测:以c-kit作为细胞标记,未纯化组的阳性表达率为1·59%±0·04%,纯化组为68·33%±2·45%,两组差异非常显著(P<0·01);以α6-整合素作为细胞标记,未纯化组的阳性表达率为2·38%±0·60%,纯化组为72·04%±3·65%,两组差异非常显著(P<0·01)。台盼蓝排斥试验表明纯化后细胞的活性率>95%。结论C-kit、α6-整合素可作为特定时期精原细胞的表面标志。采用复合酶消化、差速贴壁结合非连续性Percoll密度梯度离心的方法纯化精原细胞,能获得纯度和活性较高的精原细胞。     

人胎脑纹状体发育过程中NSCs变化的原位杂交研究

目的:观察人胎脑纹状体不同发育时期NSCs的变化。方法:60例胎龄16~28周的水囊引产胎儿,采用原位杂交及光镜技术对人胎脑纹状体NSCs的分布、形态以及数量进行检测。结果:不同胎龄人胎脑纹状体均可见Nestin mRNA阳性表达NSCs,呈圆形、椭圆形及星形等多形性,且明显群状分布,多数单个存在,细胞体积相差悬殊,有大有小,细胞有0~3个突起,胞核呈圆形和椭圆形,1~4个核仁不等,细胞染色质疏松。随着胎龄的增加,纹状体NSCs逐渐减少。结论:不同胎龄人胎脑纹状体均存在NSCs,Nestin mRNA可作为定性NSCs的可靠标志物。     

脑脉安胶囊对大鼠急性脑梗死损伤中BDNF mRNA表达的影响

目的探讨脑脉安胶囊对大鼠急性脑梗死损伤大脑皮层中脑源性神经生长因子(BDNF)mRNA表达的影响。方法雄性SD大鼠36只,随机分为脑脉安胶囊低剂量组、脑脉安胶囊中剂量组、脑脉安胶囊高剂量组、西药组、假手术组、缺血24 h模型组共6组,每组6只。采用线栓法制作大鼠局灶性脑缺血模型,3只于24 h断头取脑,HE染色观察大鼠大脑皮层区细胞损伤程度,3只取出大鼠脑组织,提取脑组织中总RNA进行RT-PCR扩增BDNF mRNA特异性片段,分析各组BDNF mRNA的变化。结果缺血24 h模型组大鼠均出现明显的神经功能缺损症状,有明显缺血性形态学改变如细胞水肿等,BDNF mRNA扩增产物相对光密度较假手术组明显升高(P<0.01);脑脉安胶囊各剂量组及西药组皮层区神经细胞水肿减轻,BDNF mRNA扩增产物相对光密度均较缺血24 h模型组明显升高,具有统计学意义(P<0.01)。结论脑脉安胶囊通过上调脑源性神经因子BDNF,使受损的神经功能得到恢复,从而发挥其对治疗急性脑梗死的作用。     

SD大鼠脑皮质星形胶质细胞的纯化

目的 改进实验步骤获取符合体外研究使用的富含星形胶质细胞的培养物.方法无菌条件下取新生1天内的SD乳鼠的脑皮质,先机械吹打,然后以差速贴壁、摇床振荡以及传代的方法去处其他细胞,SABC法和免疫荧光双标方法GFAP鉴定纯度.结果成功获取星形胶质细胞比例>95%的培养物.结论上述方法可靠地获取了符合体外研究要求的培养物,免疫荧光双标方法较直观.     

正常人脑Glob—N的分离及其结构的初步分析

目的 探索一种新的脑胶质瘤生长抑制因子Ｇｌｏｂ－Ｎ的分离鉴定方法。方法人脑中性鞘糖脂经过加压柱层析，梯度甲醇／氯仿溶液洗脱。对所得到的产物行＾１Ｈ－ＮＭＲ和＾１３Ｃ－ＮＭＲ测定。结果 含甲醇６０％的甲醇／氯仿溶液的洗脱物为纯化Ｇｌｏｂ－Ｎ，层析展开后呈单一清晰条带，Ｒｆ值０．４５。初步结构分析表明人脑Ｇｌｏｂ－Ｎ含Ｎ－乙酰半乳糖，共３个糖基，其神经酰胺部分共有３３个碳原子。结论 柱层析分离中性鞘糖     

鼠尾胶原蛋白提取、分离、纯化方法的建立及鉴定

目的建立一种高效提取、分离、纯化鼠尾胶原蛋白的方法。方法通过对鼠尾进行剥离获得鼠尾腱,用Tris-HCl缓冲液、胃蛋白酶处理获得鼠尾胶原蛋白原液、反复使用氯化钠溶液进行分级盐析、醋酸溶液复溶进行鼠尾胶原蛋白的纯化。超纯水透析除去无机盐类获得纯化的鼠尾胶原蛋白。通过SDS-PAGE蛋白质电泳、氨基酸含量分析等技术手段鉴定。结果本研究建立的方法可以获得高纯度的鼠尾胶原蛋白,纯度达到电泳纯。与国外进口的商业化鼠尾胶原蛋白产品相比无差异。研究了提取、分离、纯化参数对得率、纯度的影响,建立了最优的鼠尾胶原蛋白提取条件,胃蛋白酶用量:1∶500,酶解时间:72 h,盐析浓度:2 mol/L,提取所用酸溶液:0.05mol/L醋酸溶液。结论为鼠尾胶原蛋白的扩大化生产提供了合适的工艺参数,为大量获得鼠尾胶原蛋白并进行更深层次的功效方面研究提供了理论支持和实践基础。