含HN和VP3及IL-18重组鸡痘病毒体内抑制骨肉瘤细胞S-180效应的观察

目的:研究含凋亡素基因、鸡新城疫病毒的HN基因及IL-18基因的重组鸡痘病毒对小鼠骨肉瘤的抑制效应.方法:建立BALB/C小鼠荷S-180骨肉瘤模型,瘤内注射重组鸡痘病毒,测定肿瘤生长率、抑瘤率和小鼠血清唾液酸含量,肿瘤组织病理学分析检测重组鸡痘病毒对骨肉瘤的抑制效应.结果: rFPVHN、rFPVVP3和rFPV3(rFPVVP3IL-18)均对骨肉瘤有抑制作用,但rFPV3组抑瘤率高于rFPVHN 组、rFPVVP3组和鸡痘病毒野毒对照组达到51.7%,血清唾液酸含量明显减低(4.22±0.27),P=0.008 7.结论:凋亡素基因、鸡新城疫病毒的HN基因及IL-18基因联合应用具有协同抑制骨肉瘤的效应.     

山仙颗粒含药血清诱导S-180肉瘤细胞凋亡及其对bcl-2、Bax基因表达的影响

目的:探讨山仙颗粒(SXG)含药血清诱导体外培养S-180肉瘤细胞的凋亡作用及其对凋亡相关基因bcl-2及Bax表达的影响。方法:以不同浓度的山仙颗粒含药血清作用于体外培养的S-180肉瘤细胞,待24、48、72h后倒置显微镜下观察细胞形态变化并制备细胞涂片,采用TUNEL法检S-180肉瘤细胞凋亡率,免疫细胞化学(SABC)检测S-180肉瘤细胞中凋亡相关基因bcl-2、Bax表达的变化。结果:SXG含药血清可明显诱导S-180肉瘤细胞凋亡,导致其细胞形态改变,并能使bcl-2表达降低(P<0.01)、Bax表达增强(P<0.01),且呈浓度和时间依赖性。结论:SXG含药血清能有效诱体外培养的S-180肉瘤细胞凋亡,其机制可能与抑制bcl-2表达,促进Bax表达有关。     

骨肉瘤细胞凋亡与p53基因表达的研究

目的 探讨骨肉瘤细胞凋亡与p53蛋白异常的相关性,p53基因在骨肉瘤细胞凋亡发生中所起作用及两者与骨肉瘤预后的关系.方法 采用末端脱氧核糖核酸转移酶介导的Bio-dUTP末端标记技术(TUNEL)和免疫组化对40例骨肉瘤活检组织的细胞凋亡指数和p53蛋白表达进行检测.结果 骨肉瘤组织中存在细胞凋亡(凋亡/40).p53蛋白阳性组的凋亡%～14%,平均3.1%±3.5%)和p53蛋白异常表达(阳性率为55%、22指数范围为0指数明显低于p53蛋白阴性组(P＜0.01).结论 p53异常可能抑制细胞凋亡.细胞凋亡指数、p53蛋白表达与骨肉瘤病人的预后有关.     

凋亡素诱导人成骨肉瘤细胞多药耐药株凋亡的研究

目的研究凋亡素对人成骨肉瘤细胞0S-732多药耐药株R-OS-732的作用.方法凋亡素基因VP3经酶切后克隆入质粒pIRES1,获得重组质粒pIRVP3,通过脂质体法pIRVP3转染R-0S-732细胞,RT-PCR检测凋亡素在细胞中的表达;光镜及电镜下观察瘤细胞;提取瘤细胞基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳;流式细胞仪检测凋亡率.结果凋亡素基因已在转录水平表达;光镜及电镜下两组细胞形态变化明显;电泳见转染组DNA呈梯状条带,对照组为单一条带;转染组凋亡率明显高于空白对照组(P＜0.01).结论凋亡素可有效诱导R-OS-732细胞凋亡.     

氯化镉诱导骨肉瘤细胞凋亡的效应及其分子机制

目的 通过观察氯化镉诱导的骨肉瘤细胞凋亡与细胞特异性周期阻滞及caspase活化的影响,阐明氯化镉诱导的细胞凋亡效应及其分子机制.方法 应用AnnexinV/PI和API等标记,流式细胞仪对人骨肿瘤细胞凋亡及周期特异性的检测,运用RT-PCR的方法检查Caspase-3、Caspase-9活化情况.结果 处于静止期的外周血对氯化镉凋亡诱导不敏感,而G1期氯化镉诱导骨肉瘤细胞出现了明显的细胞凋亡.氯化镉诱导的细胞凋亡主要是在细胞周期的G1期发生.观察组采用氯化镉凋亡诱导,对照组未做处理,结果显示观察组的Caspe-3、Caspase-9 mRNA的表达值显著高于对照组.结论 氯化镉诱导的细胞凋亡与骨肉瘤细胞的细胞周期相关,存在G1期细胞周期阻滞的周期特异性,且此过程中发生了caspase活化,参与细胞凋亡.     

电离辐射对小鼠腹腔积液型S180细胞凋亡的影响

目的：观察电离辐射诱导小鼠Ｓ１８０细胞凋亡与辐射剂量、照射方式、抑瘤作用及生存期的。方法：将Ｓ１８０荷瘤鼠分为对照组,不同剂量组,以医用直线加速器Ｘ线单次照射和分次照射。采用光镜、电镜、ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳法、以及流式细胞法观察Ｓ１８０细胞凋亡的形态学和生化学特征,并观察不同处理组的小鼠抑瘤情况及生存期。结果：（１）单次照射、分次照射的均能导出典型的凋亡特征。（２）分次照射凋亡率高于次单次照射。     

caspase-6基因诱导成骨肉瘤细胞凋亡

目的：探讨caspase6对成骨肉瘤细胞株的凋亡诱导作用。方法：应用RTPCR方法检测成骨肉瘤细胞株SOSP9607中caspase6基因的表达水平。以腺病毒adv5作载体，构建含caspase6基因的转基因载体，用脂质体包裹法转染SOSP9607细胞株， 用RTPCR方法检测转染后SOSP9607细胞中caspase6基因的表达。用MTT法检测转染caspase6对SOSP9607细胞株生长的影响。结果：成骨肉瘤细胞株SOSP9607中未检出caspase6表达。RTPCR法证实转染caspase6后SOSP9607中caspase6表达显著增强，MTT检测显示对SOSP9607细胞的生长有抑制作用，形态学观察及DNA电泳证实转染后的细胞株存在细胞凋亡特征。结论：caspase6对成骨肉瘤细胞的生长有抑制作用，并可诱导成骨肉瘤细胞凋亡。     

脐带血树突状细胞对小鼠S-180移植瘤的作用研究

目的 :观察脐带血树突状细胞对小鼠S - 180细胞株移植瘤的作用。方法 :采用脐带血来源的单核细胞制备树突状细胞 ,体外经S - 180细胞肿瘤相关抗原 (TAA)致敏后免疫小鼠 ,一周后接种S - 180细胞株。或先制备荷瘤小鼠模型 ,一周后再接种致敏树突状细胞。结果 :脐带血来源的树突状细胞经胃癌细胞系S - 180的TAA致敏后既能明显保护小鼠该移植瘤的发生 ,又能抑制已发生移植瘤的生长。同对照组相比 ,预防组和治疗组的瘤体积明显缩小 ,细胞免疫功能趋于正常 ,生存期延长 (P <0 0 5 )。结论 :脐带血树突状细胞对小鼠S - 180移植瘤的发生有预防作用 ,对荷瘤小鼠移植瘤的生长有抑制作用 ,为树突状细胞的临床应用提供了进一步的依据     

Survivin反义寡核苷酸对骨肉瘤细胞凋亡的影响

目的:采用survivin反义寡核苷酸(ASODN)封闭骨肉瘤细胞survivin的作用,观察其对骨肉瘤细胞系MG63增殖和凋亡的影响。方法:以脂质体为载体,介导survivin反义寡核苷酸转染人骨肉瘤细胞系MG63,用MTT法测定细胞增殖;流式细胞仪检测转染survivin反义寡核苷酸后细胞凋亡率;Westernblot及半定量RTPCR检测转染survivin反义寡核苷酸后的骨肉瘤细胞survivin蛋白及mRNA表达。结果:脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染骨肉瘤细胞系MG63后,细胞增殖明显受到抑制,细胞凋亡率明显增加,骨肉瘤细胞survivin蛋白及mRNA表达均明显降低。结论:脂质体介导转染survivin反义寡核苷酸可以抑制细胞增殖,有效降低细胞内survivin基因的表达,促进细胞凋亡。     

横纹肌细胞培养液对S-180细胞生长抑制作用的体外实验研究

目的:观察横纹肌细胞微环境对肿瘤细胞生长的影响,探讨横纹肌内转移瘤罕见这一现象的发生机制.方法:采用酶解法原代培养新生Wistar大鼠心肌细胞和骨骼肌细胞,形态学和免疫酶染色方法检测横纹肌α-肌动蛋白进行细胞鉴定,免疫酶染色法进行细胞纯度鉴定,MTT法分析比较骨骼肌和心肌细胞细胞培养液对S-180细胞和正常肾小球系膜细胞的体外生长抑制作用,并运用胰酶消化法,热灭活法初步探讨横纹肌细胞培养液中抑瘤物质的理化性质.结果:S-180细胞与CMCM、MMCM共同培养后,细胞存活率明显下降,与DMEM相比差异均具有显著性(P<0.05),MCs细胞的细胞存活率无明显影响(P>0.05).DDP对S-180细胞和MCs细胞均具有显著性抑制作用(P<0.05).心肌细胞培养液和骨骼肌细胞培养液经胰酶消化后抑制活性仍然存在(P<0.05),经热灭活后活性消失(P>0.05).结论:新生大鼠横纹肌细胞培养液对S-180细胞的增殖有明显的抑制作用;而对正常细胞的增殖无明显影响,与顺铂的抑制作用明显不同.横纹肌细胞培养液中有可能存在一种抑瘤物质,可能是横纹肌转移瘤罕见的关键因素.     

Induction of apoptosis in S-180 and S-180R tumor cells by adriamycinin vivo

Apoptosis of tumor cells have become a new standard for chemotherapy. It is useful to demonstrate induction of apoptosis in tumor cells by anti-cancer drugsin vivo. We reported the results of apoptosis induction in murine tumor cell line S-180 and it’s resistant cell line S-180R by adriamycin in different dose and different time. We found that apoptosis in S-180 cells could be induced by low dose of adriamycin, the apoptosis was started at 24 h. after the administration, and reached to 62.5% of the cells to apptosis until 72 h. Comparison with the parental cell line, only 13% of S-180R cells were apoptosed. At high dose, 20% of S-180R cells were apoptosed, whereas, almost all S-180 cells were killed in the same time. The lymphocytes were appeared in abdominal cavity of the mice after treatment of adriamycin for 24 h. It was very interested to find out that there was no lymphocyte left in the abdominal cavity of the mice with S-180R cells treated at high dose of adriamycin.     

DEVELOPMENT OF AN ADRIAMYCIN RESISTANT MURINE TUMOR S-180 CELL LINE IN VIVO

Adriamycin resistant cells were obtained from low dotage treated BABL/c mice Inoculated with S-180 cells. Resistance of these cells for adriamycin was 66-fold more than their parental cells. The resistance for a typical DNA topoisomerase Ⅱ inhibitor VP16 (Etopcaide) was increased 9 times. Overexpression of multidrug resistant gene (MDR gene) products, P-glycoproteins (P-1 70), was also demonstrated by immunohistochemistry. Furthermore, the ability of the resistant cells to reduce net cellular drug accumulation measured by flow fluorescence cytometry was 89-fold higher than their parental cells. These results support the hypothesis that the resistance of S-180R cells to adriamycin was mainly due to the overexpression of P-glycoproteins. The S-180R cells will be useful to select drugs or some other therapeutic strategies to overcome multidrug resistance in vivo.     

凋亡素对R-OS-732细胞骨架的影响

目的 研究凋亡素(apoptin,VP3)对骨肉瘤OS-732多药耐株(R-OS-732)细胞骨架的影响及生长抑制作用。方法 将VP3基因克隆入载体pIRESI,获得重组质粒pIRV3;脂质体法转染R-OS-732细胞;制作细胞骨架标本。结果 实验组细胞骨架网状结构减少,浓聚,分布不均;对照组细胞骨架网状结构脉络清晰,舒展,分布也相对均匀。结论凋亡素对R-OS-732细胞生长具有抑制作用并导致细胞骨架破坏。     

热疗对纤维肉瘤S180株的抑瘤作用及其生物学机制

目的探讨热疗对纤维肉瘤S180株的抑瘤作用及其生物学机制。方法实验用40只昆明小鼠,接种S180肿瘤细胞株后用加热进行实验干预,标本于实验后6、20、54h取材,原位末断标记法(TUNEL)检测凋亡细胞,流式细胞仪测定细胞周期分布,RT-PCR检测Bcl-2基因的mRNA表达。结果热疗可以诱导纤维肉瘤S180株细胞凋亡,改变细胞周期分布,使发生G1期阻滞,下调Bcl-2基因。结论热疗对纤维肉瘤S180株有抑瘤作用,本实验结果为进一步开展基因配合热放疗治疗肿瘤和选择肿瘤放化疗结合时机和化疗药物提供了实验依据。     

TK基因转染骨肉瘤U-2细胞体外实验研究

目的 研究脂质体介导的TK/GCV系统对人骨肉瘤细胞的杀伤作用及其产生的旁观者效应.方法 构建重组质粒pIRES-EGFP-tk,制备和转化感受态大肠杆菌BL21以及鉴定测序,提取、纯化重组质粒DNA,培养和转染人骨肉瘤细胞株U-2 OS,流式细胞仪分析和荧光倒置显微镜下观察细胞生长状态,用转染后的培养液的上清加入TK （-） U-2 OS中观察旁观者效应.结果 成功地构建出包含有TK基因cDNA片段的重组质粒pIRES-EGFP-tk,通过PCR等方法鉴定质粒大小和位点均符合实验设计.荧光显微镜下观察U-2 OS （TK＋）呈现绿色荧光.U-2 OS TK/GCV培养上清液可明显诱导细胞凋亡.但将上清液用0.2μm的滤膜滤过后,诱导凋亡作用消失.结论成功构建重组质粒pIRES-EGFP-tk,体外实验表明人骨肉瘤细胞系U-2 OS对脂质体介导的TK/GCV系统敏感,并且有明显的旁观者效应,可望成为骨肉瘤基因治疗的新途径.     

三氧化二砷抑制骨肉瘤转移和侵袭的体外研究

目的研究三氧化二砷（As2O3）对骨肉瘤细胞运动、迁移和侵袭的影响及初步机制探讨。方法通过初筛选用人类骨肉瘤细胞系MNNG,采用细胞迁移实验、伤口愈合实验、侵袭实验和免疫印迹等方法研究As2O3对骨肉瘤细胞转移的影响。结果通过迁移实验选择迁移能力最强的MNNG细胞作为研究对象,经过As2O3处理后,MNNG细胞的伤15愈合能力减弱,迁移和侵袭的穿膜细胞数均明显低于对照组,差异有统计学意义（P=0．0016,P=0．0015）,并能下调基质金属蛋白酶9（MMP－9）的表达。结论As2O3能有效抑制骨肉瘤细胞的运动、迁移和侵袭能力,其作用机制可能与下调MMP－9的表达相关。     

The balance of serum IL-18/IL-37 levels is disrupted during the development of oral squamous cell carcinoma

Growing evidences have demonstrated a pivotal role of chronic inflammation in oral squamous cell carcinoma (OSCC) through the modulation of inflammatory cells and cytokine production. IL-37 is newly discovered anti-inflammatory member of IL-1 family and can bind to IL-18 receptor to inhibit IL-18 (pro-inflammatory member of IL-1 family) function. Investigation on the balance of IL-18/IL-37 would provide new insights into the function of IL-1 family in OSCC. Thus, serum IL-18 and IL-37 levels of OSCC patients (n = 108), leukoplakia patients (n = 40), and healthy donors (n = 36) were collected to analyze the balance of IL-18 and IL-37, and also determine their diagnostic value and prognostic significance in OSCC. The results showed that OSCC patients had high IL-18 and low IL-37 levels in serum and peripheral blood mononuclear cell (PBMC). The ratio of IL-18/IL-37 in serum efficiently distinguished non-cancer individuals from OSCC patients (cut off value: 2.15). Moreover, patients with high IL-18 and low IL-37 were susceptible to develop advanced tumor stage and lymph node metastasis (Odd ratios of IL-18/IL-37 is 4.903 and 12.613, respectively). Meanwhile, higher IL-18/IL-37 ratio could predict shorter overall survival and disease-free survival of OSCC patients, although it was not an independent prognostic factor. We further analyze the correlations of serum IL-18/IL-37 with immunocytes in peripheral blood and found that high IL-18 level was associated with more CD19⁺ B cells, while serum IL-37 seem to be associated with reduced percentage of CD3⁺CD8⁺ T cells, indicating its balance could change the adaptive immune response. Unexpectedly, we first revealed the different function of IL-18/IL-37 in serum and tumor tissues. High mRNA expression of IL-18 in tumor tissues correlated with low lymph node metastasis rate and low tumor stage, which was contradictory to the pro-tumor role of IL-18 in serum. In conclusion, enhanced ratio of IL-18/IL-37 level in serum could be an efficient biomarker for OSCC. Its balance might regulate CD19⁺ B cells and CD3⁺ CD8⁺ T cells for OSCC progression.     

IL-12与IL-18联合刺激对树突状细胞分泌的exosome活性的影响

目的:观察IL-12与IL-18联合刺激对树突状细胞(dendritic cell,DC)分泌的exosome(DC derived exosome,Dex)活性的影响,为探索高效的exosome肿瘤疫苗奠定基础。方法:取正常健康人外周血单个核细胞诱导培养DCs,分别以IL-12、IL-18或IL-12+IL-18联合刺激DC,并设空白对照组、T细胞对照组,分别提取各组的Dex,Western blotting检测Dex中HLA-DR、CD83的表达,流式细胞仪检测CD54、CD80及CD86的表达;MTT法检测Dex刺激T细胞增殖的作用,ELISA法测定T细胞IFN-γ的分泌量。结果:IL-12、IL-18、联合组、空白组的Dex中均有HLA-DR、CD83蛋白表达;联合组Dex的CD54(323.67±44.06 vs 246.17±31.91、236.33±33.87、167.67±28.73,P<0.05)、CD80(406.37±39.18 vs 331.67±36.15、335.67±41.38、260.00±35.58,P<0.05)及CD86(390.50±38.06 vs 314.33±36.64、319.00±33.10、246.83±30.55,P<0.05)表达均高于IL-12组、IL-18组及空白组;联合组刺激T细胞增殖高于IL-12组、IL-18组及空白组、T细胞组(1.98±0.31vs 1.55±0.23、1.57±0.21、1.10±0.18、0.53±0.09,P<0.05);联合组刺激T细胞分泌IFN-γ水平高于IL-12组、IL-18组及空白组、T细胞组(436.67±61.80 vs 295.04±40.25、358.18±55.77、225.00±36.44、139.50±17.63,P<0.05)。结论:IL-12与IL-18联合刺激能增加Dex表达CD54、CD80及CD86,促进Dex刺激的T细胞的增殖及其IFN-γ的分泌。     

山仙颗粒对S-180荷瘤小鼠T细胞活性及瘤组织中Caspase-9影响的实验研究

目的:通过建立昆明小鼠S-180荷瘤模型,观察山仙颗粒(SXG)对S-180荷瘤小鼠T细胞活性及肿瘤组织中Caspase-9表达的影响,探讨其抗肿瘤的分子机制.方法:构建S-180荷瘤小鼠模型,并随机分为5组,即空白对照组、模型组、SXG低、中、高剂量组,早晚灌胃给药,连续30天.颈椎脱臼处死小鼠,游离脾脏,剥离肿瘤组织.应用MTT比色法及免疫组织化学法分别检测荷瘤小鼠脾脏T细胞活性与S-180实体瘤组织中Caspase-9的表达.结果:SXG用药各组小鼠T细胞对于S-180细胞的抑制率均高于模型组,与模型组比较均有显著差异(P<0.01);SXG用药各组,S-180肿瘤组织中Caspase-9的表达明显上调,与模型组相比较具有显著差异(P<0.01).结论:SXG有抑制肿瘤的作用,其机制与促进Caspase-9介导的肿瘤细胞凋亡密切相关.