人乳头瘤病毒11型E7蛋白基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的构建人乳头瘤病毒11型(HPV11)E7蛋白基因腺病毒载体,并在真核细胞表达。方法用PCR法,扩增出HPV11E7基因,定向克隆至pENTR-TOPO载体形成重组质粒TOPO-E7。TOPO-E7与腺病毒载体pAD/CMV/V5-DESTTM重组反应,E7基因被重组到腺病毒载体上。该载体经PacI酶切,脂质体法转染人胚肾293A细胞,获得重组腺病毒载体pAD-E7。pAD-E7转染人HaCaT细胞,激光共聚焦显微镜分析E7蛋白表达情况。结果经酶切及序列分析鉴定,重组质粒TOPO-E7成功构建。重组子pAD-E7转染293A细胞后,获得滴度为1.4×107pfu/mL的重组腺病毒载体。该载体转染HaCaT细胞,48h后激光共聚焦显微镜下可见细胞内E7蛋白表达。结论重组腺病毒载体能有效介导HPV11E7基因在真核细胞的表达。     

尖锐湿疣皮损中HPV类型及p53、bcl—2分子表达研究

目的 探讨尖锐湿疣(CA)中HPV（人乳头瘤病毒）感染类型及其p53和bcl－2（B细胞淋巴瘤样因子2）分子在HPV6／11阳性尖锐湿疣发病中的可能作用。方法 用PCR法检测了22例CA皮损中HPV6／11和HPV16／18,用免疫组化方法检测了尖锐湿疣组织中p53和bcl－2分子的表达。结果 （1）所有标本均为HPV6／11阳性,未检测出HPV16／18;（2）40．9％的尖锐疣皮损在表皮角质形成细胞中有p53蛋白的表达,但阳性细胞数量较少,主要散在分布于基底层;（3）bcl－2蛋白在CA及鳞状细胞癌中未见表达。结论 （1）HPV6／11是CA的主要致病病毒;（2）CA中部分出现p53分子表达提示这部分细胞可能已出现恶性转化倾向;（3）bcl-2可能与角质形成细胞来源的良性增生性疾病以及恶性肿瘤关系不大。     

稳定表达人乳头瘤病毒16E7蛋白HaCaT细胞株的建立

目的建立稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)16E7蛋白的HaCaT细胞株.方法利用PCR及酶切技术扩增出CaSki细胞中HPV16E7基因并定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HPV16E7.将重组质粒转染入HaCaT细胞,经G418筛选稳定表达HPV16E7蛋白的细胞株并予以鉴定.结果经酶切、测序鉴定构建pcDNA3.1(+)-HPV16E7成功.RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后检测到HPV16E7mRNA表达的特异性297 bp条带;Western印迹可检测到E7蛋白稳定表达.结论成功构建出稳定表达HPV16E7蛋白的HaCaT细胞株.     

稳定表达人乳头瘤病毒16E7蛋白HaCaT细胞株的建立

目的建立稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)16E7蛋白的HaCaT细胞株.方法利用PCR及酶切技术扩增出CaSki细胞中HPV16E7基因并定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HPV16E7.将重组质粒转染入HaCaT细胞,经G418筛选稳定表达HPV16E7蛋白的细胞株并予以鉴定.结果经酶切、测序鉴定构建pcDNA3.1(+)-HPV16E7成功.RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后检测到HPV16E7mRNA表达的特异性297 bp条带;Western印迹可检测到E7蛋白稳定表达.结论成功构建出稳定表达HPV16E7蛋白的HaCaT细胞株.     

稳定表达人乳头瘤病毒16E7蛋白HaCaT细胞株的建立

目的建立稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)16E7蛋白的HaCaT细胞株.方法利用PCR及酶切技术扩增出CaSki细胞中HPV16E7基因并定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HPV16E7.将重组质粒转染入HaCaT细胞,经G418筛选稳定表达HPV16E7蛋白的细胞株并予以鉴定.结果经酶切、测序鉴定构建pcDNA3.1(+)-HPV16E7成功.RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后检测到HPV16E7mRNA表达的特异性297 bp条带;Western印迹可检测到E7蛋白稳定表达.结论成功构建出稳定表达HPV16E7蛋白的HaCaT细胞株.     

宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型E6、人乳头瘤病毒16型E7蛋白表达及DNA病毒载量与调节性T细胞浸润的相关性分析

目的 探究宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型(HPV16)E6、HPV16 E7蛋白表达及DNA病毒载量与调节性T(Treg)细胞浸润的相关性及临床意义。方法 选取成都医学院第一附属医院2018年1月至2020年1月84例行手术治疗的宫颈癌患者的癌组织作为宫颈癌组,选取同一医院同期手术治疗的42例宫颈上皮内瘤变(CIN)患者的宫颈组织作为CIN组,另选取42例因子宫肌瘤行全子宫切除术的患者的正常宫颈组织作为正常组。对比分析三组组织中HPV16 E6、HPV16 E7蛋白表达及DNA病毒载量、Treg细胞浸润的情况。结果 宫颈癌组HPV16 E6、HPV16 E7蛋白阳性表达率及DNA病毒载量、Treg细胞占CD4⁺T细胞比例均高于CIN组、正常组,CIN组上述指标均高于正常组(P<0.05);宫颈癌组织中HPV16 E6、HPV16 E7蛋白阳性表达率及DNA病毒载量与Treg细胞占CD4⁺T细胞比例呈正相关(P<0.05);HPV16 E6、HPV16 E7蛋白阳性表达率及DNA病毒载量、Treg细胞占CD4⁺...     

人乳头瘤病毒与角质形成细胞增殖关系的研究进展

近年来国外文献报道了人乳头瘤病毒 (HPV)可使培养角质形成细胞成倍增殖的现象 ,现综述如下。在 HPVS中 ,HPV16和 HPV18与 90 %以上的宫颈癌有关 ,HPV16脱氧核糖核酸能诱发角质形成细胞和子宫颈细胞的不可移动及变化。 E6和 E7病毒基因与P53 和 Rb 细胞肿瘤抑制基因相互作用 ,有可能在这一过程中起重要作用。尽管如此 ,应用全基因组所产生的转移效率低 ,表明了对于基因的作用。HPV转染影响角质形成细胞 ,而角质形成细胞对于导致使它们要求降低的具有威胁性的增长因素极敏感。表皮细胞生长因子受体 (EGFR)水平的特定增长 ,已经在 …     

犀地凉血方通过LncRNA NEAT1/miR-485-5p/STAT3调控网络对HaCaT细胞增殖、凋亡影响的研究

目的探讨犀地凉血方对HaCaT细胞LncRNA NEAT1/miR-485-5p/STAT3调控网络及细胞增殖、凋亡的影响。方法以IL-17诱导的HaCaT细胞为研究对象, 通过qPCR、Western印迹法检测LncRNA NEAT1、miR-485-5p、STAT3 mRNA和蛋白在HaCaT细胞和正常人表皮角质形成细胞(NHEK细胞)中的表达。采用荧光原位杂交技术(FISH)观察LncRNA NEAT1、miR-485-5p在HaCaT细胞中的表达;采用双萤光素酶报告基因实验验证LncRNA NEAT1、miR-485-5p、STAT3之间的靶向调控关系。犀地凉血方煎煮取汁给予大鼠灌胃后采集含药血清, 以含药血清干预和/或LncRNA-NEAT1过表达载体转染HaCaT细胞, 将HaCaT细胞分对照组、过表达LncRNA NEAT1组、犀地凉血方组、犀地凉血方+过表达LncRNA NEAT1组, 采用qPCR、Western印迹法、流式细胞仪、CCK8等实验技术分别检测LncRNA NEAT1、miR-485-5p、STAT3表达及细胞增殖、凋亡情况。采用独立样本t检验、单因素方...     

GJB6基因突变体过表达慢病毒载体的构建及其在HaCaT细胞中的表达

目的:明确GJB6目的基因蛋白Cx30在GJB6 3种突变体A88V、G11R和V37E在HaCaT细胞中的表达.方法:构建GJB6基因突变体的慢病毒载体,并转染至HaCaT,应用荧光倒置显微镜检测其表达.结果:突变体中G11R和A88V经过多次转染实验,能够明确观察到HaCaT细胞细胞膜上有Cx30蛋白的荧光表达;而V37E突变型荧光表达极弱或无.结论:3种突变体的Cx30表达量不同,初步推测突变体编码的蛋白质或不能定位于角质形成细胞膜或不能形成功能性的Cx30,从而影响了HaCaT细胞正常的增殖和分化.     

人乳头瘤病毒11型E6的原核表达

目的　构建、克隆人乳头瘤病毒 11型 (HPV11)E6蛋白基因 ,并进行表达、纯化和鉴定。方法　用PCR法 ,从尖锐湿疣 (CA)标本中扩增出HPV 11型E6蛋白基因 ,与 pET3 2a载体连接成重组表达质粒pET3 2a/E6;重组质粒转入BL2 1大肠杆菌 ,经诱导表达硫氧还蛋白E6融合蛋白 (Trx E6) ;该蛋白经 3SNTAResin纯化柱纯化 ,SDS PAGE和WesternBlotting检测鉴定。 结果　经酶切及序列分析鉴定 ,重组质粒 pET3 2a/E6成功构建 ,诱导后高表达Trx E6融合蛋白 ,WesternBlotting鉴定证实表达蛋白分子量为 3 60 0 0D的Trx E6融合蛋白。结论　获得高表达、高纯度的HPV11E6蛋白 ,为该蛋白的功能及免疫学分析及CA的疫苗研究打下了基础。     

人乳头状瘤病毒16 E6/E7基因稳定表达的永生化角质形成细胞的建立及鉴定

【摘要】 目的 构建人乳头状瘤病毒（HPV）16 E6/E7基因稳定表达的人永生化角质形成细胞（KC），为研究HPV16 E6/E7诱导的细胞永生化及恶性转化机制提供细胞模型。方法 两步消化法分离培养原代人包皮角质形成细胞（HFK），利用慢病毒感染技术对细胞稳定转染HPV16 E6/E7基因，连续培养30代以上，筛选出永生化KC，分为3组：①空白对照组：传代2次的原代HFK；②实验组：传代2次的原代HFK感染LV5-HPV16 E6/E7，感染细胞记录为A0代，感染后以传代次数记录（A1、A2……）；③阳性对照组：HPV16阳性宫颈癌细胞SiHa。应用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、Western印迹实验分别检测空白对照组、实验组、阳性对照组HPV16 E6/E7 mRNA、蛋白及CK14蛋白的表达，CCK-8及Transwell Insert方法检测细胞的增殖及侵袭能力。裸鼠致瘤实验检测实验组A30、阳性对照组SiHa细胞的致瘤能力。结果 成功分离原代HFK。LV5-HPV16 E6/E7重组质粒感染原代HFK后，空白对照组细胞无荧光表达，连续传代后出现衰老表现，实验组A30细胞体积、形态较原代HFK无明显变化，且荧光表达率为100%。与空白对照组相比，实验组A1、A10、A20、A30细胞HPV16 E6 mRNA表达水平显著升高（t值分别为7.12、8.07、6.53、5.66；P值分别 < 0.001、 < 0.001、 = 0.001、 = 0.005）；与空白对照组相比，实验组A1、A10、A20、A30细胞HPV16 E7 mRNA表达水平也显著升高（t值分别为3.20、4.29、3.75、4.22；P值分别为0.024、0.008、0.013、0.014）。空白对照组未见HPV16 E6/E7蛋白的表达，而A30及SiHa细胞可见HPV16 E6/E7蛋白的表达。CCK-8实验显示，实验组A10、A20、A30细胞增殖水平显著高于空白对照组（t值分别为6.49、7.55、9.43；P值分别为0.003、0.002、0.001），而A1的增殖水平与空白对照组比较，差异无统计学意义（t = 2.40，P = 0.074）。Transwell Insert侵袭实验显示，A30不能穿过基底膜，SiHa细胞可穿过基底膜被染成蓝色。裸鼠接种A30细胞2个月后无肉眼可见肿瘤，组织学亦显示无肿瘤形成，裸鼠接种SiHa细胞后可于皮下形成肿瘤。结论 通过采用慢病毒技术转染HPV16 E6/E7基因成功建立人永生化角质形成细胞，可作为HPV相关研究中的理想细胞模型。     

慢病毒介导shRNA沉默Nicastrin基因的人永生化角质形成细胞模型构建

目的 构建Nicastrin(NCT)基因的RNA干扰慢病毒表达载体,并在人永生化角质形成细胞(HaCaT细胞)上鉴定其沉默效率,构建NCT基因稳定下调的人永生化角质形成细胞模型,为后续研究NCT基因下调对角质形成细胞的生物学行为影响奠定实验基础.方法 设计3个靶向NCT基因特异性短发卡RNA(shRNA)表达序列并连接到慢病毒表达质粒pGLV3/H 1/GFP+ Puro中,成功构建慢病毒重组表达质粒,并通过测序鉴定.将构建的重组表达质粒与包装质粒共转染293T细胞,产生慢病毒颗粒,并测其滴度.将HaCaT细胞分为空白组(未感染病毒)、阴性对照组(NC组,感染空载病毒LV3-shNC)和干扰组(感染NCT-shRNA1、2、3慢病毒).流式细胞仪检测慢病毒转染效率,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、Western印迹检测靶基因的沉默效率,筛选出沉默效果最佳的干扰序列.结果 测序表明,NCT-shRNA慢病毒重组表达质粒构建成功.重组表达质粒与包装质粒共转染293T细胞后产生的慢病毒颗粒滴度为109 TU/ml.慢病毒感染HaCaT细胞后,流式细胞仪检测,慢病毒转染效率大于95％.qRT-PCR结果,与NC组相比,干扰组NCT mRNA表达量明显下降,其中NCT-shRNA1组NCT基因沉默效果最佳,干扰效率达到75％.Western印迹结果,与NC组相比,shRNA1组NCT蛋白表达抑制率为71.7％.结论 成功筛选出高效NCT-shRNA干扰序列,构建NCT-shRNA慢病毒重组表达载体,并构建NCT基因稳定下调的人永生化角质形成细胞模型.     

人乳头瘤病毒16型 E6通过微小RNA-504调控宫颈癌细胞增殖、侵袭和凋亡的研究

目的 探讨人乳头瘤病毒16型(HPV16)E6通过微小RNA(miR)-504对宫颈癌SiHa细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。方法 将体外培养的SiHa细胞分为对照组、空载体组、E6过表达组、E6过表达+miR-NC组和E6过表达+miR-504组。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测HPV16 E6 mRNA和miR-504的表达;采用免疫印迹法检测HPV16 E6蛋白表达;采用噻唑蓝(MTT)法、Transwell小室和流式细胞仪分别检测细胞增殖、侵袭和凋亡情况。结果 与对照组和空载体组比较,E6过表达组细胞中HPV16 E6蛋白和mRNA表达水平均明显升高,而miR-504表达水平降低(P<0.05);与对照组比较,E6过表达组细胞增殖活力和侵袭能力明显升高,而细胞凋亡率降低(P<0.05);与E6过表达组和E6过表达+miR-NC组比较,E6过表达+miR-504组细胞中miR-504表达水平和细胞凋亡率明显升高,而细胞增殖活力和侵袭能力明显降低(P<0.05)。结论 HPV16 E6可能通过下调miR-504的表达促进宫颈癌SiHa细胞的增殖、侵袭并抑制其细胞凋亡。     

人乳头瘤病毒11型基因组DNA在HaCaT株中的转染

目的 探讨转染与筛选技术获取稳定携带有HPV11基因组DNA的细胞的可能性。方法 对含有pBR322.HPV11质粒的大肠杆菌培养扩增,然后进行质粒的提取与纯化,并用限制性内切酶BamHⅠ切割下HPV11全长基因。低熔点琼脂糖回收后,用T4 DNA连接酶进行线状DNA的自身环化,再与pIK-neo质粒、用Lipofectamine试剂共转染HaCaT细胞。通过G418筛选阳性细胞克隆,将阳性克隆细胞合并与培养扩增后,用FQ-PCR技术检测细胞内HPV11DNA的存在,用巢式RT-PCR技术检测HPV11 E1^E4 mRNA的表达。结果 HPV11型基因组DNA转染至HaCaT细胞后,经G418筛选约2周,培养皿内即可见对G418抵抗的阳性细胞克隆出现,其形态与普通HaCaT细胞相似。用FQ-PCR在筛选后的HaCaT细胞中检测到HPV11DNA的存在,平均病毒DNA载量为（15.9 ± 16.8）拷贝/细胞。传代3次后细胞内病毒DNA无丢失,载量为（23.9 ± 1.1）拷贝/细胞。与未传代细胞相比,二者间差异无统计学意义（t = -0.822,P > 0.05）。巢式RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后检测到HPV11 E1^E4 mRNA表达的特异性628 bp条带。结论 HPV11基因组DNA可通过脂质体转染法成功导入HaCaT细胞内,通过筛选可获得阳性细胞,且经3次传代后HPV11DNA仍然存在。     

高表达αB-晶状体蛋白对HaCaT细胞存活和凋亡的影响

目的:探讨αB-晶状体蛋白(αB-crystallin)高表达对人皮肤角质形成细胞(HaCaT)存活和凋亡的影响。方法:构建αB-crystallin的真核表达载体,转染至HaCaT细胞中并筛选出稳定高表达αB-crystallin的HaCaT细胞株,MTT法和流式细胞术分别检测高表达αB-crystallin对HaCaT细胞的细胞存活率和细胞凋亡率的影响。结果:成功筛选出高表达αB-crystallin的HaCaT/CRYAB-1、HaCaT/CRYAB-2,该两者的αB-crystallin表达水平均较亲代HaCaT明显升高。αB-crystallin高表达的HaCaT细胞在H_2O_2处理后细胞存活率明显升高(t=5.23,P0.05),细胞凋亡率明显下降(t=15.09,P0.05)。结论:αB-crystallin具有促人角质形成细胞存活和抗细胞凋亡的作用。     

人乳头瘤病毒11型E7蛋白基因的克隆和表达

目的 从尖锐湿疣皮损标本中扩增出人乳头瘤病毒11型(HPV11)E7蛋白基因．并进行表达、纯化和鉴定。方法用PCR法，从尖锐湿疣标本中扩增出HPV11E7蛋白基因，与pGEX-6P-1载体连接成重组表达质粒pGEX-6P-1／E7；重组质粒转入BL21大肠杆菌，经诱导表达融合蛋白GST-E7；该蛋白经剪刀酶切除GST，Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化，SDS-PAGE和蛋白质印迹法检测鉴定。结果经酶切及序列分析鉴定，重组质粒pGEX-6P-1／E7成功构建．诱导后高表达GST-E7融合蛋白并得到纯化，蛋白质印迹证实表达蛋白为E7蛋白。结论获得高表达、高纯度的HPV11 E7蛋白，为该蛋白的功能及免疫学分析及尖锐湿疣疫苗研究打下了基础。     

HPV16E6蛋白与hDaxx在HeLa细胞的定位及对凋亡的影响

目的 探讨外源人乳头瘤病毒16型E6蛋白(HPV16 E6)与人Daxx蛋白(hDaxx)在HeLa细胞内的亚细胞定位及诱导HeLa细胞凋亡的影响.方法 Western印迹法检测融合蛋白DsRed-HPV 16 E6和EGFP-hDaxx的表达.激光共聚焦显微镜观察HPV16 E6和hDaxx的亚细胞定位.将HeLa细胞分为对照组、TNF-α处理组、转染空载体组、转染HPV16 E6组、共转染HPV16 E6和hDaxx组.后4组均经TNF-α诱导.用流式细胞仪测定细胞凋亡率,分光光度法检测Caspase-8与Caspase-3的相对活性.结果 融合蛋白DsRed-HPV16E6和EGFP-hDaxx在细胞内表达并分布于胞质与胞核,出现共定位现象,且部分hDaxx从胞核转移至胞质.转染E6组凋亡率(21.4％±1.1％)低于转染空载体组(27.0％±0.9％,P＜ 0.01);与转染E6组相比较,共转染组凋亡率(32.5％±2.1％)显著升高(P＜0.01).转染E6组Caspase-8和Caspase-3相对活性分别为0.057±0.003、0.054±0.006,均低于空载体组(0.092±0.012、0.093±0.005,均P＜0.01);与转染E6组相比较,共转染组Caspase-8和Caspase-3相对活性(0.109±0.013、0.110±0.004)均显著升高(P值均＜ 0.01).结论 HPV16 E6使部分hDaxx从胞核转位至胞质,二者发生共定位.HPV16E6蛋白可抑制TNF-α诱导的HeLa细胞凋亡,bDaxx高表达可下调HPV16 E6蛋白这种作用.     

P53 PCNA K-i67 bcl-2在尖锐湿疣中的表达

目的　探讨尖锐湿疣 (CA)中P5 3、Ki 6 7、bcl 2、增殖细胞核抗原 (PCNA)表达与人乳头瘤病毒 (HPV )感染的关系。方法　用免疫组化方法对 40例CA和 10例正常包皮进行检测。结果　 40例CA中P5 3、Ki 6 7、bcl 2、PCNA阳性标本分别为 33例 ( 82 .5 % )、37例 ( 92 .5 % )、2 0例 ( 5 0 .0 % )、35例 ( 87.5 % )。CA组各种蛋白的表达强度均明显高于对照组 (P <0 .0 5 )。HPV感染的空泡细胞核中同时有P5 3、Ki 6 7、PCNA过度表达者 2 5例。P5 3、bcl 2阳性细胞多分布于基底层、棘细胞中下层。结论　CA中存在P5 3、Ki 6 7、PCNA、bcl 2过度表达 ,提示角质形成细胞异常增生与HPV感染有关。     

人类乳头瘤病毒16全基因在体外培养的正常人角质形成细胞中的瞬时表达

目的 利用含有人类乳头瘤病毒(HPV)16全基因的质粒转染正常人角质形成细胞,观察HPV16 mRNA在转染细胞的表达。方法 用FuGENE^TM6转染试剂,将携带HPV16全基因的质粒pSV2-neo/16转染体外培养的正常人角质形成细胞,在转染后24h提取细胞总RNA和DNA,进行RT-PCR和Southern印迹分析。结果 24h后,RT-PCR成功地扩增出110bp的片段,转染细胞中已出现HPV16 mRNA的表达,Southern印迹证实转染细胞中含有HPV16全基因7.9kb。结论 pSV2-neo/16转染正常人表皮角质形成细胞,24h内即可检测到HPV16mRNA表达。     

早老蛋白增强子2基因沉默对HaCaT细胞增殖及γ分泌酶表达的影响

目的:构建早老蛋白增强子2（PSENEN）基因沉默的人永生化角质形成细胞（HaCaT）模型,探究PSENEN基因表达下调对HaCaT细胞增殖以及γ分泌酶表达的影响。方法:设计3组靶向PSENEN基因的shRNA序列,与线性化的LV3-pGLV-h1-GFP-puro载体构建慢病毒重组表达质粒,经酶切及测序鉴定后,进行慢...