结核分枝杆菌Rv2660c蛋白结构分析及抗原表位预测

目的 分析结核分枝杆菌Rv2660c蛋白的结构并预测其抗原表位,为研发针对结核潜伏性感染的治疗性疫苗和药物提供新的靶点。方法 用BLAST软件分析Rv2660c蛋白与人类蛋白的同源性,然后运用生物信息学方法预测其二级结构、跨膜结构、信号肽序列及T细胞和B细胞抗原表位。结果 BLAST结果显示,Rv2660c蛋白与人类蛋白同源性不高,同源性最高的人类蛋白是MAD 6蛋白,同源性仅为16%。Rv2660c蛋白无跨膜区,为胞外蛋白,不含信号肽序列;该蛋白含丰富的B细胞和T细胞抗原表位,19-35、48-54、28-44和58-73位氨基酸残基可能存在优势线性B细胞表位;56-64位和65-74位氨基酸可能存在优势辅助性T细胞表位,66-74、41-49、63-71位氨基酸可能存在优势细胞毒性T细胞表位。结论 Rv2660c蛋白含丰富抗原表位,具有较强的体液免疫和细胞免疫原性,可望作为潜伏性感染结核的治疗性疫苗和药物的作用靶点。     

结核分枝杆菌毒力基因片段Rv0450c分子克隆及原核表达

目的 通过分子克隆的方法对结核分枝杆菌H37Rv中编码MMPL4蛋白的Rv0450c基因以及编码该蛋白一个161氨基酸的膜内区域(I161)和一个371氨基酸的膜外区域(O371)的基因片段在大肠杆菌中的表达和纯化方法进行研究,为进一步探讨MMPL4与结核分枝杆菌耐药相关功能性研究以及抗体制备提供依据。方法 以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增Rv0450c基因片段,并克隆到原核表达载体pET28b质粒中,获得的重组质粒转化原核表达宿主大肠杆菌BL2 1(DE3)pLysS中,经IPTG诱导后SDS-PAGE电泳方法检测重组蛋白的表达,并进行纯化。结果 从结核分枝杆菌基因组H37RvDNA中成功扩增出Rv0450c基因及编码I161/O371的DNA片段,并构建原核表达质粒pET28b-Rv0450c,pET28b-I161和pET28b-O371重组MMPL4蛋白和I161在大肠杆菌中表达不明显,而膜外区域O371以包涵体形式高表达。结论 Rv0450c基因原核表达质粒可以成功构建并在大肠杆菌内较好表达,为进一步MMPL4功能研究和抗体制备打下良好基础。     

结核分枝杆菌Rv3428c重组蛋白表达与纯化及其单克隆抗体的制备

目的 制备并鉴定Rv3428c的单克隆抗体,为结核分枝杆菌快速特异性抗原检测奠定基础。方法 同源重组得到pET28a-Rv3428c表达载体,转入E.coli BL21(DE3)后进行IPTG诱导表达,用Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白。重组蛋白免疫小鼠后进行细胞融合,间接ELISA、Western Blot筛选阳性杂交瘤细胞系,以筛选获得的阳性杂交瘤细胞诱导小鼠产生腹水,蛋白A亲和层析法纯化抗体,BCA法测定浓度,ELISA和SDS-PAGE进行单克隆抗体的鉴定及亚型和效价的测定。结果 成功构建pET28a-Rv3428c表达载体、表达并纯化出目的蛋白。Rv3428c蛋白免疫小鼠使小鼠产生致敏B淋巴细胞,在聚乙二醇作用下,淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合,形成杂交瘤细胞。筛选得到的阳性杂交瘤细胞株,通过体内诱生法制备获得Rv3428c单克隆抗体。该单抗属于IgG2a亚类,κ型轻链,效价约为1∶128 000,浓度为4 mg/ml。结论 本研究制备并纯化了Rv3428c重组蛋白,获得了抗Rv3428c单克隆抗体,为Rv3428c用于结核分枝杆菌快速特异性抗原检测奠定基础。     

结核分枝杆菌Rv3425蛋白原核可溶性表达

目的在原核系统内获得结核分枝杆菌Rv3425蛋白可溶性表达并进行纯化,Western-blot技术初步鉴定重组蛋白的抗原性和特异性。方法将Rv3425核酸编码序列克隆至融合表达载体p ET-Dsb C中,然后进行融合蛋白Dsb CRv3425表达并实现亲和纯化,用Western-blot分析其抗原性和特异性。结果 Rv3425基因在大肠杆菌中获得可溶性表达,亲和纯化的Dsb C-Rv3425蛋白与结核病患者血清标本呈强阳性反应,与健康人血清标本呈阴性反应。结论Dsb C-Rv3425蛋白在大肠杆菌中以可溶性表达形式存在,具有较好的抗原特异性和免疫原性,对结核病诊断有潜在的应用价值。     

结核分枝杆菌Rv2994基因原核表达及鉴定

目的构建结核分枝杆菌Rv2994基因原核表达载体并进行表达,为进一步研究奠定基础。方法PCR扩增Rv2994基因编码序列,定向克隆入融合蛋白原核表达载体pGEX-1λT获得重组表达质粒pGEX-2994,转化大肠杆菌测序后诱导表达,纯化目的蛋白并免疫新西兰大白兔获取多价抗体。结果从结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出Rv2994基因,成功构建了融合表达质粒pGEX-Rv2994,转化大肠杆菌JM109后,经IPTG诱导,表达出约73kDa重组融合蛋白,用Western blotting证实其有良好的抗原性,纯化蛋白免疫新西兰大白兔,获得了高效价的抗体。结论成功构建了原核表达载体pGEX-2994,获得并纯化了GST-Rv2994融合蛋白,制备了高效价的多价血清,为Rv2994基因的功能研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌抗原Rv0585c人T细胞抗原表位鉴定及其免疫原性评价

目的 研究结核分枝杆菌抗原Rv0585c的抗原表位及其免疫原性,为结核病特异免疫诊断技术和疫苗的研发提供基础。方法 利用生物信息学TE-predict和IEDB人T细胞抗原表位预测软件进行结核分枝杆菌抗原Rv0585c的人T细胞抗原表位预测,根据预测结果,合成表位多肽,用ELISpot试验检测预测表位在临床结核病患者中的免疫反应性。分别采用高、低剂量（100 μg/只和50 μg/只）的Rv0585c抗原表位多肽、同时以高、低剂量（50 μg/只和20 μg/只）的Ag85B蛋白抗原为对照,对随机分组的BALB/c小鼠进行免疫。利用ELISA方法检测IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10的水平。结果 经生物信息学技术预测到Rv0585c 66个人T细胞抗原表位,选取合成了表位分布集中的抗原表位多肽9条。人群ELISpot试验筛选出3条阳性人T细胞表位多肽：P10110、P10112、P10117,用于肺结核检测的灵敏度分别为14.00%、12.00%和6.00%,特异度分别为100.00%、100.00%和97.96%;联合用于肺结核检测的灵敏度和特异度分别为22.00%和97.96%。动物免疫试验结果显示,P10110多肽高、低剂量刺激小鼠产生较高水平的IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10,P10112多肽高、低剂量刺激小鼠产生较高水平的IFN-γ、IL-2和IL-10,均高于阴性对照组,差异有统计学意义（P<0.001）。结论 Rv0585c蛋白及其T细胞表位具有较好的免疫原性及免疫反应性,能刺激机体产生较强烈的细胞免疫应答,具有潜在的结核病细胞免疫诊断和新型结核疫苗的应用价值。     

ABC外排泵基因Rv1747c在结核分枝杆菌中的表达与耐药相关性研究

目的研究临床结核分枝杆菌中ABC外排泵基因Rv1747c的表达及与耐药性产生的关系,探讨临床结核分枝杆菌耐药的分子机制。方法采用SYBR GreenⅠ实时定量PCR方法,检测ABC外排泵基因Rv1747c在临床结核分枝杆菌中的表达水平。结果 Rv1747c基因在临床耐药菌株的表达水平(1.30±1.02)高于敏感菌株的(0.70±0.59),但差异无统计学意义,Rv1747c基因在敏感株中无高表达,在耐药组中发生7株菌的高表达占29.2%,差异有统计学意义(P<0.05);在利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇耐药菌株中均出现Rv1747c基因的高表达。结论结核分枝杆菌临床分离株的耐药性与ABC外排泵基因Rv1747c的高表达相关;ABC外排泵基因的高表达可以使药物外排能力增加,从而导致耐药性产生。同时可能还有其他机制参与结核分枝杆菌耐药性的生成。     

结核分枝杆菌Rv3914抗原的克隆表达与纯化

目的构建结核分枝杆菌Rv3914蛋白的重组质粒,并在大肠埃希菌中表达及纯化,为结核病血清学诊断提供候选抗原。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增Rv3914基因片段,插入到pET-28b(+)载体中,构建pET28b-Rv3914重组质粒,转化大肠埃希菌E.coli BL21plysS(DE3),经IPTG诱导表达后,应用Ni-NTA亲和柱纯化重组蛋白。结果 PCR扩增出Rv3914基因序列,重组质粒经测序并经BLAST分析后发现无点突变。pET28b-Rv3914重组质粒在大肠埃希菌E.coli BL21plysS(DE3)中主要以可溶性形式表达,重组蛋白占细胞蛋白总表达量的30%以上,经Ni-NTA柱纯化后,得到纯度超过90%、相对分子质量约为14.7×103的目的蛋白质。结论高纯度结核分枝杆菌Rv3914重组蛋白的获得为研究结核互补特异性抗原组合在结核病血清诊断中的价值奠定了基础。     

结核分枝杆菌ESAT-6 His融合蛋白的原核表达及纯化

摘要:目的 构建含有His标签结核分枝杆菌esat-6基因的原核表达质粒,并在体外进行原核表达和纯化。方法 提取结核分枝杆菌基因组DNA,对其采用聚合酶链反应技术扩增esat-6基因,并构建至表达载体pET28a上。将测序正确的载体转化大肠杆菌BL21,然后对His-ESAT6融合蛋白通过IPTG诱导进行表达,最后对重组蛋白使用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹进行分析。结果 PCR扩增出结核分枝杆菌esat-6基因,成功构建至表达载体pET28a-ESAT-6上,并在体外优化表达,产生高水平的目的蛋白表达产物。结论 成功构建并表达了含有His标签的ESAT-6融合蛋白,为临床中预防和治疗结核病提供了有效的参考。     

结核分枝杆菌ESAT-6的原核表达与纯化及免疫原性检测

目的构建及鉴定含有GST标签的结核分枝杆菌esat-6基因的原核表达载体,并在大肠埃希菌中高效表达融合蛋白。方法 PCR扩增结核分枝杆菌esat-6基因,并构建到pGEX4T-1上,重组质粒经测序鉴定后进行诱导表达,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹分析重组蛋白。结果扩增出了结核分枝杆菌esat-6基因,构建了具有正确基因序列的质粒载体pGEX4T-1-ESAT-6,转化大肠埃希菌BL21后经诱导产生了高水平的表达产物,蛋白纯化后可被结核病患者血清特异性识别。结论构建了质粒载体pGEX4T-1-ESAT-6,并经诱导后高效表达了ESAT-6融合蛋白,为进一步研究结核菌的免疫机制奠定了基础。     

结核分枝杆菌4种新抗原的克隆表达及血清学评价

目的 初步评价结核分枝杆菌4种新抗原Rv0432、Rv0674、Rv1566c和Rv1547的血清学诊断价值。方法 以结核分枝杆菌实验室标准参照菌株H37Rv全基因组DNA为模板PCR扩增Rv0432、Rv0674、Rv1566c基因的完整序列,Rv1547基因分为两段（Rv1547-1和Rv1547-2）扩增,与PET-32a表达载体构建重组质粒,重组蛋白利用亲和层析的方法进行纯化。待检测血清和BL21（DE3）菌体蛋白孵育进行预处理。各重组抗原用ELISA对151份待检血清（41份健康组血清和110份细菌学阳性结核患者组血清）进行IgG抗体检测。检测结果用受试者工作特征曲线对其诊断效能进行分析和评价。采用t检验比较目的蛋白在结核患者组和健康组的差异性。结果 成功克隆表达和纯化了蛋白Rv0432、Rv0674、Rv1566c、Rv1547-1和Rv1547-2,ELISA结果显示Rv0432、Rv0674、Rv1566c、Rv1547-1和Rv1547-2的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值、约登指数和曲线下面积分别为43.64%~92.73%、80.49%~92.68%、0.92~0.94、0.38~0.80、0.363~0.732和0.649~0.915。目的蛋白在结核组检测到的IgG抗体水平均大于健康组（P<0.000 1）。结论 结核分枝杆菌新抗原Rv0432、Rv0674、Rv1566c、Rv1547-1和Rv1547-2具有良好的血清学检测价值,可作为结核病免疫学诊断的候选抗原。     

艾滋病病毒与结核分枝杆菌双重感染对死亡的影响

目的 了解广西壮族自治区（广西）HIV及结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）双重感染对死亡的影响,为有效控制HIV/MTB双重感染提供依据。方法 利用中国疾病预防控制信息系统的艾滋病综合防治信息系统和结核病防治数据系统,收集整理2011年广西HIV/MTB双重感染患者,采用跨系统和大数据串联分析方法,交叉核对艾滋病治疗、随访、综合信息以及结核病患者登记报告基本信息,明确HIV/MTB双重感染患者;用描述性流行病学方法、χ²检验以及Cox比例风险回归模型描述、分析资料。结果 HIV感染者及艾滋病患者登记队列（HIV/AIDS队列）感染MTB比例为17.72%（2 533/14 293）;结核病患者登记队列（结核病队列）感染HIV比例5.57%（2 351/42 205）;随访1年内HIV/AIDS队列发现的HIV/MTB双重感染患者病死率为15.16%（384/2 533）,高于单纯感染HIV者随访1年的病死率（13.63%,1 603/11 760）（P<0.000 1）;19.33%（384/1 987）当年登记、当年死亡的HIV/AIDS由感染MTB引起。HIV/AIDS队列和结核病队列发现的双重感染分别有60.05%（1 521/2 533）、47.90%（1 126/2 351）开始抗病毒治疗;HIV/AIDS队列发现的结核病患者结核病治愈率为15.48%（392/2 533）,完成疗程比例为27.48%（696/2 533）;结核病队列发现的HIV/AIDS其结核病治愈率为19.70%（463/2 351）,完成疗程比例为37.26%（876/2 351）;64.13%（785/1 224）HIV/MTB双重感染报告时CD4⁺T淋巴细胞计数（CD4）<200个/μl。与单纯感染HIV者相比,HIV/MTB双重感染患者5年死亡风险增高1.17倍,和单纯感染MTB者相比,HIV/MTB双重感染者12个月死亡风险增加25.68倍。结论 广西HIV/MTB双重感染死亡、发病占报告艾滋病患者比例较高,病死率及死亡风险明显高于单纯感染HIV者及单纯感染MTB者;应该尽快提高抗病毒治疗覆盖率和抗结核治愈率;针对HIV感染者,应加强早发现和早治疗MTB感染。     

结核分枝杆菌Lsr2蛋白原核重组表达及其多克隆抗体制备

目的 利用原核系统获得重组结核分枝杆菌Lsr2蛋白,制备抗Lsr2多克隆抗体。 方法 以临床标准株 H37Rv DNA为模板,合成引物PCR扩增Lsr2核酸序列,插入原核表达载体pET28a,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达,柱上复性纯化后,重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备并纯化抗Lsr2多克隆抗体,采用间接ELISA和Western-blotting实验对抗体进行验证。 结果 成功构建pET28a-Lsr2表达质粒,重组蛋白Lsr2经SDS-PAGE电泳鉴定分子量为14 kD。亲和层析及柱上复性后,纯化的重组蛋白纯度在95%左右。制备的抗Lsr2多克隆抗体效价在1:5.5×10⁶以上,并能特异性识别纯化的重组蛋白和结核分枝杆菌菌体蛋白。 结论 成功在原核系统内表达并纯化了重组结核分枝杆菌Lsr2蛋白,制备了高效价的抗Lsr2多克隆抗体,为进一步研究Lsr2蛋白的功能,筛选其下游相互作用蛋白以及相关分子机制研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌对环丝氨酸耐药分子特征的初步研究

目的 探讨结核分枝杆菌对环丝氨酸耐药性与alrA、ddlA和cycA基因突变的关系,分析环丝氨酸耐药与基因型的关联性。方法 从菌株库中选取145株临床分离株,采用比例法测定菌株对环丝氨酸耐药表型、微孔板刃天青显色法测定最小抑菌浓度,PCR扩增、DNA直接测序法测定目的基因全长,与标准菌株H37Rv比对。间隔区寡核苷酸基因分型（spoligotyping）进行菌株基因型鉴定,分析耐药表型与基因型的关系,采用χ²检验分析差异有无统计学意义。结果 145株临床分离株中,环丝氨酸耐药菌株为24株,敏感株为121株。24株耐药菌株中,3株（12.5%）发生cycA非同义突变,涉及的密码子为188位、318位和508位,1株（4.2%）发生alrA非同义突变,涉及密码子为261位。敏感菌株的目的基因中仅检出同义突变。药敏试验证实,突变株的最小抑菌浓度均有不同程度的升高。北京基因型为88株,环丝氨酸耐药率为20.5%（18/88）,非北京基因型为57株,环丝氨酸耐药率为10.5%（6/57）,两者耐药率差异无统计学意义（χ²=2.47,P>0.05）。结论 alrA和cycA单核苷酸非同义基因突变可能是环丝氨酸耐药的机制之一。尚不能确定北京基因型或非北京基因型菌株与环丝氨酸耐药有相关性。     

青海省结核分枝杆菌临床分离株可变数目串联重复序列基因多态性研究

目的 初步了解青海省结核分枝杆菌临床分离株基因多态性和基因分型特征。方法 2009-2012年收集青海省疾病预防控制中心分离的结核分枝杆菌临床分离株,提取DNA,对15个可变数目串联重复序列(VNTR)位点进行PCR扩增和产物电泳分析,使用BioNumerics软件对菌株进行聚类分析。结果 共检测251株结核分枝杆菌临床分离株的15个VNTR位点,显示这些菌株有明显的基因多态性,15个VNTR位点中Hunter-Gaston指数>0.6的VNTR位点有6个,位点分辨能力最高的是MIRU26,经聚类分析,可分为4个基因群,238个基因型。4个基因群分别占4.9%、91.9%、1.6%和1.6%。结论 青海省流行的结核分枝杆菌菌株存在明显的VNTR基因多态性。     

rpoB gene sequencing and spoligotyping of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from India

Multi drug-resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR TB) has been well studied in outbreaks in settings of low endemicity in developed countries. However, the characteristics of MDR TB in the community with high endemicity such as India have not been well investigated. Mutations in the 81-bp rifampicin resistance-determining region of the rpoB gene were analyzed by DNA sequencing of 187 M. tuberculosis clinical isolates (149 resistant and 38 sensitive) from different parts of India. 146-Point mutations and two insertions were found in 146 of 149 resistant isolates in seven codons. The most common mutations were in codons 531 (59%), 526 (22%), and 516 (11.5%). Mutations were not found in three (2%) of the resistant isolates. N-terminal sequencing in these isolates showed no mutation at codon V176. None of the drug-susceptible isolates showed any mutation in the 437-bp rpoB gene segment sequenced. Genotypic analysis revealed a total of 80 different spoligotypes. A unique pattern was found in 65 (43.6%) isolates, whereas 84 (56.4%) were in 15 clusters. Comparison with an international spoligotype database showed ST26, Delhi type (18.1%), ST1, Beijing type (9.4%), and ST11 (5.4%), as the most common. The majority of isolates in the Beijing genotype (13/14) were associated with mutation 531TTG and similar drug-resistance patterns while other major clusters showed that the nature and frequency of occurrence of mutations in the rpoB gene were independent of spoligopatterns.     

中国6个省份结核分枝杆菌耐药状况及影响因素分析

目的 分析北京、吉林、新疆、陕西、湖南、河南6省份结核分枝杆菌耐药性数据,了解耐药性结核病分布特征及影响因素。方法 在6省份采用问卷调查收集背景资料,并使用比例法药物敏感性试验对4种一线抗结核药物（异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇）进行检测,再利用SPSS 20.0软件分析其危险因素。结果 总体耐药率和耐多药率分别为23.42%和13.51%。北京、吉林、湖南、河南、陕西、新疆分离株耐药率分别为21.50%、12.24%、36.27%、42.86%、27.78%、24.39%,耐多药率分别为4.67%、8.16%、24.51%、26.53%、15.28%、14.15%。χ²检验结果显示,各省份间单种药物耐药率、总体耐药率和耐多药率差异均有统计学意义（P=0.000）。单因素分析结果显示,结核病的复发、治疗史与耐药结核病的产生具有明显的相关性,差异有统计学意义（P<0.05）。结论 我国耐药结核病的形势非常严峻,调查地区结核病耐药性存在明显差异,应针对各地区主要的危险因素加强预防干预。     

基于全基因组测序的我国耐多药结核分枝杆菌耐药突变特征分析

目的 利用全基因组测序数据分析中国耐多药结核分枝杆菌的耐药相关基因突变谱及主要突变类型与菌株基因型的相关性。方法 查询并下载NCBI数据库中截至2019年8月公开发表的中国结核分枝杆菌全基因组测序数据,利用全基因组数据预测菌株分子药敏结果,统计不同药物耐药相关基因的突变类型,并分析耐药突变类型与菌株基因型的相关性。结果 根据分子药敏结果从2 019株菌株中鉴定出1 024株耐多药菌株,对常用抗结核药物的耐药相关基因主要突变类型分别为katG S315T（73.2%,异烟肼）、rpoB S450L（63.1%,利福平）、rpsL K43R（70.0%,链霉素）、embB M306V（37.4%,乙胺丁醇）、pncA启动子区T（-11）C（7.9%,吡嗪酰胺）、gyrA A90V（32.3%,氟喹诺酮类）、rrs A1401G（67.7%,二线注射类）、fabG1启动子区C（-15）T（87.0%,乙硫异烟胺）、folC I43T（30.4%,对氨基水杨酸）。其中,katG S315T、rpsL K43R、embB M306V、gyrA D94G在L2系菌株中的频率显著高于L4系菌株,folC I43T仅在L2系菌株中发现;katG S315T在古典北京型菌株中比例较高,而rpsL K43R在现代北京基因型菌株中的比例更高,其差异均有统计学意义（均P<0.05）。结论 本研究提供了基于全基因组测序的我国耐多药结核分枝杆菌对多种常用抗结核药的耐药相关基因主要突变类型,为研发敏感、特异的快速分子检测方法提供了依据;同时也发现多种耐药相关基因主要突变类型与菌株基因型有关。     

广西地区结核分枝杆菌异烟肼耐药基因突变特征分析

目的 分析广西地区结核分枝杆菌异烟肼(INH)耐药基因的突变特征,为耐药结核病的分子诊断提供依据。方法 选取2018年广西30个结核病耐药监测点收集的结核分枝杆菌菌株库中122株耐INH菌株和530株全敏感菌株进行全基因组测序。结果 652株结核分枝杆菌复合群菌株中,127株(19.48%)发生INH耐药基因突变,分别为katG(15.64%,102株)、fabG1(1.69%,11株)、ahpC(1.07%,7株)、kasA(0.61%,4株)和inhA(0.46%,3株)基因突变。INH耐药表型与基因突变的符合率为90.03%,比例法药敏检测INH耐药与基因测序检测基因突变结果吻合度不高(Kappa=0.677)。突变类型共有19种,单位点突变占96.85%,联合位点突变占3.15%。突变比率最高的位点为katG315(71.65%),碱基变化以AGC-ACC形式占比最高(12.13%)。katG、ahpC和kasA基因突变比例在INH耐药株中高于敏感株(均P<0.05),INH耐药株和敏感株inhA、fabG1基因突变比例比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。北...