在Ⅳ型皮肤的皮肤类似物中成纤维细胞对角质形成细胞起增殖作用而对黑素细胞的生长和色素沉着起抑制作用

利用去表皮的真皮和成纤维细胞基质构建了皮肤类似物模型，并且利用该模型观察了成纤维细胞分泌的可溶性因子对黑素细胞增殖和黑素合成的影响。方法：①从新鲜环切的成人包皮(Ⅳ型皮肤)分离表皮角质形成细胞、黑素细胞和真皮成纤维细胞，分别培养至第二代；②用去表皮的真皮作底物构建     

由HaCaT细胞组成的皮肤类似物中,HaCaT细胞具有接受贮存黑素小体的能力但黑素细胞不只限于基底层

ＨａＣａＴ细胞是一种永生的角质形成细胞系 ,可无限制的获取 ,并有分化特征 ,因此广泛用于正常表皮角质形成细胞的替代物。但此细胞和黑素细胞间的相互作用尚不清楚。作者探讨了ＨａＣａＴ细胞在皮肤类似物上是否和正常角质形成细胞一样 ,能与黑素细胞相互作用。　　皮肤成纤维细胞和表皮的黑素细胞均来源于包皮。ＨａＣａＴ细胞和成纤维细胞都生长在ＤＭＥＭ培养基中。黑素细胞生长在黑素细胞培养基 (ＭＧＭ )中。实验中用第 4代的成纤维细胞和第 2代生长的黑素细胞。ＨａＣａＴ细胞和黑素细胞分别按 1∶1和10∶1比例接种在两种不同的培养…     

用同一皮肤标本培养、纯化人正常黑素细胞、角质形成细胞及成纤维细胞的观察

目的建立从同一皮肤标本同步培养人正常黑素细胞、角质形成细胞和成纤维细胞的技术。方法利用同一供体的包皮,表真皮分离后,置37℃,5%CO2的孵箱中培养,根据细胞生长状况进行相应的传代和纯化处理。结果获得大量纯化、生长良好的人正常黑素细胞、角质形成细胞和成纤维细胞。结论实现了对同一组织来源的三种细胞在不同培养基中生长状况的同步观察。     

鳞状细胞癌细胞系12F细胞中白介素1αmRNA的表达及对紫外线照射的反应

目的 了解人角质形成细胞(KC)起源的鳞状细胞癌细胞系(SCC)12F细胞自发表达白介素1α(IL-1α)mRNA的能力以及紫外线照射对IL-1α分泌水平的影响。方法 采用RNA印迹法检测IL-1αmRNA的表达水平,采用ELISA方法检测IL-1α蛋白的分泌水平。结果 SCC12F细胞可在正常KC培养体系中自发表达IL-1αmRNA,其表达水平随细胞培养时间的延长而增强,在120h达到高峰值;经中波紫外线(UVB)照射后,IL-1α蛋白的分泌水平既随照射时间增加,亦随照射剂量增加。结论 SCC12F细胞在正常KC培养体系中可自发表达IL-1αmRNA,其IL-1α蛋白的分泌水平对UVB照射呈时效及量效反应。     

体外重建皮肤与正常人皮肤基本特征的对比研究

目的 用正常人的皮肤角质形成细胞和黑素细胞在体外重建皮肤,为将来用于临床、生物及药理学研究奠定基础.方法 从正常儿童的包皮分离、培养角质形成细胞、黑素细胞和成纤维细胞.用成纤维细胞和I型鼠尾胶原制备真皮类似物.将角质形成细胞和黑素细胞接种到真皮类似物表面进行培养,制备表皮类似物.将重建的皮肤类似物和正常人皮肤进行对比研究.结果 皮肤类似物的组织形态包括基底层、基底上层、角质层与正常人皮肤相似.与基底膜形成有关的标志,在皮肤类似物和正常人皮肤中的表达是相似的.角蛋白10、泛角蛋白在皮肤类似物和正常人皮肤中的表达也是相似的.结论 组织形态和所检测的各种标志的表达显示,该皮肤类似物与正常人皮肤相似.     

308nm准分子激光对角质形成细胞分泌细胞因子的影响

目的探讨308nm准分子激光对人角质形成细胞(HKC)增殖及分泌细胞因子的影响。方法CCK-8法检测不同剂量准分子激光照射后12h及24h对HKC增殖的影响;ELISA法检测细胞培养上清液中干细胞生长因子(SCF)、集落细胞生长因子(GM-CSF)、成纤维细胞生长因子(bFGF)的浓度;DNA Ladder法检测准分子激光照射后HKC晚期凋亡情况。结果细胞活力与照射剂量呈负相关,照射后12h的细胞活力与24h相比差异有显著性(P=0.001);308nm准分子激光剂量在100～300mJ/cm2时,HKC分泌SCF,GM-CSF,bFGF的增加呈剂量依赖性,与对照组(0mJ/cm2)比较差异有显著性(P<0.001),6h后分泌的SCF,GM-CSF,bFGF开始增加,24h后达到峰值。准分子激光照射可诱导HKC出现晚期凋亡。结论308nm准分子激光可能通过诱导角质形成细胞分泌SCF,GM-CSF,bFGF等促进黑素细胞增殖分化的细胞因子,使白癜风皮损复色。     

紫外线照射对HaCaT细胞起源的白介素10和白介素4的影响

我们以往的研究表明,UV照射对HaCaT细胞分泌Th1型细胞因子白介素12(IL-12)和干扰素-γ(IFN-γ)无明显影响.本研究在此基础上,以长波紫外线(UVA)和中波紫外线(UVB)照射人永生化表皮细胞HaCaT细胞,检测UV照射后HaCaT细胞IL-10、IL-4受体的表达情况和细胞培养液中IL-10、IL-4的含量,探讨UV照射对角质形成细胞产生Th2型细胞因子的影响及其与T细胞亚群失衡的相关性.     

不含佛波醇酯和霍乱毒素条件下黑素细胞的培养

目的:建立不含佛波醇酯(TPA)和霍乱毒素(CT)培养液培养人类正常表皮黑素细胞的方法,避免TPA的致瘤危险和霍乱毒素的毒性。方法:临床环切包皮经中性酶-胰酶(D ispaseⅡ-Trypsin)两步消化后,获得表皮基底细胞悬液,于不含TPA和CT的KC-SFM角质形成细胞无血清培养基培养,用差速贴壁法及胰酶差速消化法去除角质形成细胞,用两段法去除成纤维细胞污染,观察黑素细胞的增殖情况和树突伸展状态,采用多巴(Dopa)染色和免疫组化对黑素细胞进行鉴定。结果:经过7天的培养,黑素细胞达到70%汇合,细胞呈双极、三极或多极的树突状。经1-2次传代,黑素细胞纯度达98%以上,Dopa染色和抗S-100单抗染色阳性。结论:用不含TPA和CT的KC-SFM角质形成细胞培养基可以获得大量高纯度黑色素细胞。     

皮肤科学基础

UVA1对人体皮肤成纤维细胞的影响及临床应用（综述）;308nm准分子激光对豚鼠皮肤黑素细胞的影响；马拉色菌对角质形成细胞分泌黑素合成相关细胞因子的影响；表皮生长因子受体反义寡核苷酸对紫外线诱导的表皮角质形成细胞c—jun活性的影响；人毛囊体外分离及培养技术的改进.     

补骨脂对SCF/Kit/MITF信号通路的调控作用

目的探讨中药单体补骨脂对SCF/Kit/MITF信号通路的调控作用。方法建立黑素细胞和角质形成细胞共培养体系,加入终浓度为2mg/mL的补骨脂醇提物,每24h更换新鲜培养基和补骨脂素1次,连续3d后收集细胞,RT-PCR法检测正常对照组和补骨脂组SCF,c-kit,MITF和酪氨酸酶mRNA的表达。用终浓度2mg/mL的补骨脂处理角质形成细胞爬片,连续3d后用免疫组化法检测正常对照组和补骨脂组SCF蛋白的表达。黑素细胞爬片,加入经补骨脂处理后的角质形成细胞上清,免疫组化法检测正常对照组和补骨脂组MITF蛋白的表达。结果补骨脂组SCF,c-kit,MITF和酪氨酸酶mRNA表达均较正常组明显增高(P=0.000)。经补骨脂处理后的角质形成细胞SCF免疫组化结果显示,细胞浆呈深棕黄色着色,与正常对照组的差异有统计学意义(P=0.000),加入经补骨脂处理的角质形成细胞培养上清后的黑素细胞MITF免疫组化结果显示,细胞核呈深棕黄色着色,与正常培养黑素细胞的差异有统计学意义(P=0.007)。结论中药单体补骨脂能促进角质形成细胞分泌SCF,进而促进MITF的表达,使酪氨酸酶表达增加。     

紫外线照射对皮肤成纤维细胞影响的实验研究

目的研究紫外线(UV)照射对皮肤成纤维细胞形态学、生长增殖状态、突变频率和ATPmRNA表达水平的影响。方法采用一定剂量的中长波紫外线照射培养的新生儿包皮成纤维细胞。通过细胞计数记录细胞增殖,光学显微镜观察形态学变化,次黄嘌呤磷酸核糖转移酶突变实验检测突变频率,RT-PCR法检测ATPmRNA表达水平。结果成纤维细胞经UVB照射后,形态受损,细胞增殖减缓,照射72h后细胞活性只增加了约0.2倍,而非照射组增加约2.4倍。在每106个突变克隆细胞中突变频率由20mJ/cm2的(20.4±6.7)个增加到60mJ/cm2的(97.7±7.1)个。ATPmRNA表达水平随照射剂量及照射时间增加而呈下调变化。结论UV照射可使人成纤维细胞ATPmRNA表达水平呈剂量及时间依赖性下调变化,在能量消耗条件下成纤维细胞形态异常,生长受抑,突变频率与照射剂量的增加成正相关。     

rhFGF-7对体外培养人皮肤角质形成细胞增殖的影响

目的建立一种人皮肤角质形成细胞分离和培养的方法,研究重组人成纤维细胞生长因子7(rhFGF-7)对人皮肤角质形成细胞增殖的影响。方法取环切术后包皮,分别用胰酶和dispaseⅡ酶消化法分离表皮,用无血清培养基进行无滋养层培养,采用免疫细胞化学方法对培养的细胞进行鉴定,并用细胞计数法测定细胞的生长曲线,MTT法检测rhFGF-7对人皮肤角质形成细胞增殖的影响。结果与胰酶消化分离表皮相比,dispaseⅡ酶消化获得的表皮,其细胞贴壁率高,增殖速度快,且成纤维细胞污染少;荧光显微镜下细胞胞浆呈黄绿色,为角蛋白阳性染色;培养的角质形成细胞可持续增殖至第8代,10ng/mL的rhFGF-7促角质形成细胞增殖作用最显著。结论所建立的人皮肤角质形成细胞分离和培养方法,可获得高纯度的人皮肤角质形成细胞,rhFGF-7可促进体外培养人皮肤角质形成细胞的增殖。     

紫外线对皮肤角质形成细胞和成纤维细胞产生MMP-1和MMP-3的影响

目的:研究中波紫外线辐射对体外培养的表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞产生基质金属蛋白酶-1(MMP-1)和MMP-3的直接和间接影响,研究绿茶中的主要活性成分表没食子儿茶酚没食子酸酯(EGCG)对此影响的保护作用。方法:体外培养角质形成细胞株HaCaT和真皮成纤维细胞,中波紫外线辐射、不同浓度IL-6刺激及EGCG处理后,ELISA方法测定上清液中Pro-MMP-1和MMP-3蛋白含量,半定量RT-PCR方法测细胞中mRNA含量。结果:UVB30mJ/cm2辐射后角质形成细胞分泌的pro-MMP-1和MMP-3并未增加(P>0.05),真皮成纤维细胞合成和分泌MMP-1和MMP-3mRNA含量和蛋白水平均显著增加(P<0.05),IL-6(8、16、24pg/mL)可显著增加成纤维细胞产生MMP-1和MMP-3(P<0.05)。EGCG(0.15、0.3mM)能够显著抑制紫外线诱导成纤维细胞产生MMP含量的增加(P<0.05),但IL-6刺激成纤维细胞所产生的MMP-1和MMP-3的增加不受EGCG的影响(P>0.05)。结论:中波紫外线辐射并不能直接导致角质形成细胞分泌MMP-1和MMP-3增加,但紫外线辐射后角质形成细胞分泌的IL-6可促进成纤维细胞产生MMP。EGCG对IL-6刺激成纤维细胞产生MMP增加没有影响,但它可以显著抑制紫外线辐射直接导致的成纤维细胞产生MMP-1和MMP-3的增加,对防治皮肤光老化可能有一定作用。     

碱性成纤维细胞生长因子和内皮素-1体外协同培养正常人黑素细胞

目的探讨在不含霍乱毒素的MCDB153培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和内皮素-1(ET-1)能否体外培养正常人黑素细胞。方法取健康青少年包皮环切术后的新鲜包皮标本,经修剪、分离、消化和离心获得表皮细胞,用含bFGF和ET-1的MCDB153培养基重悬细胞,于常规条件下培养;倒置显微镜下观察细胞形态;L-Dopa染色及S-100免疫细胞化学法鉴定黑素细胞;生长曲线法记录黑素细胞生长状况;MTT法测定黑素细胞活性。结果黑素细胞生长良好,1周后即进入指数生长期;细胞形态正常,具有2～6个树突以及2～3级树突,细胞纯度较高,无角质形成细胞和/或成纤维细胞污染。多巴染色使黑素细胞胞浆和树突呈棕褐色,胞核呈棕红色,S-100免疫组化DAB显色使黑素细胞胞浆呈棕褐色,证实为正常人黑素细胞;细胞活性良好,随时间延长活性逐渐升高。结论采用bFGF和ET-1协同培养人黑素细胞是一种较好的方法,可用于实验研究。     

人头皮毛囊外根鞘无色素黑素细胞的分离和纯化培养进一步研究

目的：从人头皮毛囊外根鞘分离纯化培养无色素黑素细胞。方法：采用两步酶法(0．50％分离酶和0．50％胶原酶V)获得游离的毛囊，高浓度0．50％，胰酶30min消化游离的毛囊外根鞘细胞，并以优化的培养基进行细胞培养。用HMB-45和NKI／beteb单克隆抗体免疫组化染色、透射电镜对培养物进行鉴定。结果：培养物中初始贴壁细胞大多数为无色素黑素细胞，仅有少量的角质形成细胞，无成纤维细胞污染。经二次传代差别胰酶处理很容易去除角质形成细胞。取培养3周的细胞经免疫组化和透射电镜鉴定证实为无色素黑素细胞。传3代后细胞得到完全纯化。结论：两步酶法结合高浓度的胰蛋白酶处理细胞可彻底清除成纤维细胞，获得无色素黑素细胞的纯培养。     

308nm准分子激光诱导T淋巴细胞凋亡的研究

目的:探讨308 nm准分子激光对T淋巴细胞直接和间接诱导凋亡的作用及转化生长因子β1(TCF-β1)在诱导T淋巴细胞凋亡中的作用.方法:308 nm准分子激光分别照射角质形成细胞和体外分离的活动期白癜风患者外周血T淋巴细胞;ELISA检测照射后24h及48 h角质形成细胞培养上清中的TGF-β1浓度;流式细胞仪检测照射后48 h的T淋巴细胞凋亡情况;建立Transwell细胞共培养系统(角质形成细胞位于上室,T淋巴细胞位于下室),308 nm准分子激光照射Transwell上室,照射后48 h检测T淋巴细胞凋亡情况;照射前加入不同浓度的抗TGF-β1抗体(25、250、2 500 pg/L),于照射后48 h采用流式细胞仪分别检测T淋巴细胞凋亡情况.结果:308 nm准分子激光诱导角质形成细胞分泌TGF-β1的增加呈剂量依赖性;流式细胞仪检测结果显示:准分子激光可直接诱导T淋巴细胞凋亡;准分子激光照射Transwell上室可间接诱导T淋巴细胞凋亡;照射前加入抗TGF-β1抗体.可抑制308 nm准分子激光的诱导凋亡作用.结论:308 nm准分子激光直接照射可诱导T淋巴细胞凋亡,也可作用于角质形成细胞间接诱导T淋巴细胞凋亡.TGF-β1在308 nm准分子激光诱导T淋巴细胞凋亡中起重要作用.     

角质形成细胞无血清培养基条件下构建组织工程皮肤

目的 探讨在角质形成细胞无血清培养基条件下,用人成纤维细胞、角质形成细胞和黑素细胞接种于人去表皮真皮构建组织工程皮肤.方法 胰酶和胶原酶消化处理健康小儿包皮,获得表皮和真皮细胞悬液.分别将角质形成细胞、黑素细胞传至第3代,成纤维细胞传至第5代,调整细胞密度为2.5×105/ml.制备人去表皮真皮(含部分基底膜成分),先将成纤维细胞悬液种于6孔板板底,24 h后将人去表皮真皮放入6孔板,角质形成细胞、黑素细胞悬液接种于人去表皮真皮表面(成纤维细胞、角质形成细胞、黑素细胞比例为1∶4∶1.实验组用角质形成细胞无血清培养基培养,对照组用含10％ FBS的DMEM、K-SFM、M254,3种培养液比例为1∶1∶1的混合培养基培养,人去表皮真皮作为空白对照.液下培养3d后,空气液面培养相结合的方式进行培养,每3天换液1次,2周后取培养的组织工程皮肤分别行HE染色,Melan-A、S-100、HMB45、CKpan、P63、K5、K6、K14、Ki67、Vimentin、Collagen Ⅳ、Laminin免疫组化染色及PAS染色并取正常皮肤做阳性对照.结果 经过14d的气液培养,实验组出现完整的新生表皮结构,CKpan、P63、K5、K6、K14、Ki67、Melan-A、S-100、HMB45、Collagen Ⅳ、Laminin免疫组化染色阳性;对照组出现完整的新生表皮结构,可见角质层,CKpan、P63、K5/6、K14、Ki67、Laminin免疫组化染色阳性.结论 角质形成细胞、黑素细胞及成纤维细胞与人去表皮真皮在角质形成细胞无血清培养基条件下,体外可构建组织工程皮肤.     

中波紫外线辐射对原代及永生化角质形成细胞损伤能力的比较研究

目的：观察原代角质形成细胞和永生化HaCaT角质形成细胞对中波紫外线照射的反应差异。方法：采用不同剂量中波紫外线(UVB)照射上述两种细胞，评估UVB对细胞作用的时间及剂量效应，以倒置光学显微镜观察细胞受损程度，MTT法检测细胞活性。结果：UVB照射后，细胞损伤程度均随照射剂量加大而加重；另经24h、48h及72h孵育后，对两种细胞进行不同时间段的细胞活性(MTT)比值比较(72h／24h，72h／48h)：分别为原代角质形成细胞(1．16和1.63)和HaCaT细胞(0．96和0．91)。MTT结果显示低剂量紫外线照射时，细胞损伤恢复可发生在照射后48h；高剂量紫外线照射后，两种细胞的损伤程度均随孵育时间延长而加重。结论：原代角质形成细胞抵抗紫外线照射损伤的能力较强，而HaCaT细胞相对较易受损。     

不同肤色个体表皮角质形成细胞Caspase14表达的研究

目的 探讨不同肤色人群角质形成细胞中Caspase14表达变化,明确黑素细胞和（或）黑素对其表达的影响。 方法 以Western印迹检测不同肤色个体原代角质形成细胞Caspase14的表达。取体外培养不同肤色的2代角质形成细胞,分别加入不同肤色的黑素细胞在分化培养基下共同培养24 h,以不加黑素细胞组为对照,Western 印迹检测Caspase14的表达。结果 浅、深肤色个体包皮原代角质形成细胞Caspase14的表达存在显著差异,深肤色者（Fitzpatrick Ⅳ/Ⅴ）原代角质形成细胞中Caspase14的表达显著高于浅肤色者（FitzpatrickⅠ/Ⅱ）（P ＜ 0.01）;深、浅肤色个体的角质形成细胞在与不同肤色个体的黑素细胞在分化培养基中共培养后24 h后,检测发现,与对照组相比,浅肤色个体角质形成细胞Caspase14表达的增加,差异无统计学意义（P ＞ 0.05）,而深肤色个体角质形成细胞Caspase14的表达则显著上调（P ＜ 0.05）。结论 深肤色个体角质形成细胞Caspase14表达显著高于浅肤色个体者。黑素细胞显著增加深肤色者角质形成细胞中Caspase14水平的表达。     

p53蛋白在UVB诱导凋亡的富集表皮干细胞的角质形成细胞中的表达

目的研究p53蛋白在中波紫外线(ultraviolet lightB,UVB)诱导凋亡的富集表皮干细胞的角质形成细胞群中的表达情况。方法分离富集人表皮干细胞的角质形成细胞群和正常角质形成细胞群,使用UVB诱导两种细胞群凋亡,蛋白印迹法比较不同剂量UVB诱导前后两组细胞的p53蛋白表达的差异。结果两种细胞在不同剂量的UVB照射后p53蛋白表达均比照射前显著增加,在20mJ/cm2与40mJ/cm2照射剂量时,富集人表皮干细胞的角质形成细胞群p53蛋白表达高于正常角质形成的细胞群,差异有统计学意义(P<0.05)。结论富集人表皮干细胞的角质形成细胞p53蛋白表达比其它角质形成细胞对中波紫外线的照射易感。