MCF7细胞中肿瘤干细胞的增殖特征

背景：肿瘤干细胞学说认为,肿瘤干细胞是肿瘤不断增殖的根源,并与肿瘤的浸润转移、耐药现象密切相关。目的：在单细胞水平研究体外传代培养的MCF7细胞中肿瘤干细胞含量变化规律,认识肿瘤干细胞在体外培养环境下的增殖特点。方法：利用单细胞分离种植-成瘤性克隆方法对传代培养后不同时间点MCF7细胞中肿瘤干细胞的比例连续检测,流式细胞仪同步检测相应细胞样本中CD44＋CD24-/low亚群的含量变化。结果与结论：传代后培养的MCF7细胞在不同时间点其肿瘤干细胞比例及CD44＋/CD24-/low亚群比例均呈现有规律的变化。但CD44＋/CD24-/low亚群变化更为显著（36.84%到81.95%）,而肿瘤干细胞含量仅在小范围波动（38.54%～47.39%）。结果提示传代培养的MCF7细胞中,肿瘤干细胞具有通过调节自身增殖来保持其比例相对稳定的特点;CD44＋/CD24-/low亚群并不代表或者富集MCF7细胞株中的肿瘤干细胞亚群。     

MCF7细胞中肿瘤干细胞的增殖特征

背景:肿瘤干细胞学说认为,肿瘤干细胞是肿瘤不断增殖的根源,并与肿瘤的浸润转移、耐药现象密切相关。目的:在单细胞水平研究体外传代培养的MCF7细胞中肿瘤干细胞含量变化规律,认识肿瘤干细胞在体外培养环境下的增殖特点。方法:利用单细胞分离种植-成瘤性克隆方法对传代培养后不同时间点MCF7细胞中肿瘤干细胞的比例连续检测,流式细胞仪同步检测相应细胞样本中CD44+CD24-/low亚群的含量变化。结果与结论:传代后培养的MCF7细胞在不同时间点其肿瘤干细胞比例及CD44+/CD24-/low亚群比例均呈现有规律的变化。但CD44+/CD24-/low亚群变化更为显著(36.84%到81.95%),而肿瘤干细胞含量仅在小范围波动(38.54%～47.39%)。结果提示传代培养的MCF7细胞中,肿瘤干细胞具有通过调节自身增殖来保持其比例相对稳定的特点;CD44+/CD24-/low亚群并不代表或者富集MCF7细胞株中的肿瘤干细胞亚群。     

辐射与悬浮球培养联合纯化乳腺癌干细胞

目的:利用悬浮球培养联合不同辐射模式,高度纯化人乳腺癌MCF-7细胞中辐射抵抗的CD44+/CD24Aow乳腺癌干细胞.方法:利用含细胞因子的无血清培养体系培养MCF-7细胞,将培养形成的球囊细胞连续传代.选择第2代球囊细胞分别行2 Gy×4次及单次8 Gy照射.利用滤网收集存活细胞生成的微球囊,流式细胞仪检测纯化后微球囊中CD44+/CD24Aow细胞的含量.克隆形成检测及单击多靶模型曲线拟舍分析纯化后微球囊细胞的辐射敏感性.结果:单纯悬浮球培养与联合X线照射组之问CD44+/CD24Aow细胞的含量差异存在显著性(P<0.05),联合组高度纯化CD44+/CD24Aow细胞;多次分割及单次大剂量照射对CD44+/CD24Aow细胞的富集作用差异无显著性(P=0.303).纯化细胞照射后存活分数显著高于贴壁MCF-7细胞.结论:辐射联合悬浮球培养进一步纯化辐射抵抗的CD44+/CD24Aow乳腺癌干细胞的方法是可行的.     

T24膀胱癌细胞ARID1A基因的表达与细胞增殖活力相关性研究

目的探讨AT丰富结合域1A(ARID1A)基因的表达与膀胱癌细胞T24增殖活力的关系,为进一步基因功能研究提供基础。方法利用梯度稀释法分离获得膀胱移行癌细胞系T24的高增殖亚克隆细胞株,体外评价细胞株和亲代细胞系增殖活力差异,检测细胞周期调控基因CCND1和膀胱癌肿瘤干细胞标志因子CD44。检测染色质重建复合物SWI/SNF亚基基因ARID1A在亚克隆和亲代细胞系的转录表达水平差异。结果分离得到65个T24的亚克隆细胞株,其中T24-9亚克隆细胞株不同于亲代的梭形形态,呈细小的圆形形态,增殖能力明显强于亲代,CC-ND1、ARID1A和CD44的mRNA表达量均有增加。结论 T24细胞系中的含有高增殖活力的干细胞细胞亚群,染色质重建复合物基因ARID1A转录活跃,可能增加ARID1A突变的风险。     

基底样乳腺癌与管腔A乳腺癌干／祖细胞的表型分析

目的比较人基底样乳腺癌和管腔A乳腺癌干／祖细胞分化前后的细胞表型变化。方法应用乳腺癌细胞球无血清悬浮培养法获取乳腺癌干／祖细胞;分别以荧光免疫技术和流式细胞术检测基底样乳腺癌和管腔A乳腺癌干／祖细胞分化前后细胞角蛋白CK14、CK18、CK19和CD44、CD24的表达情况;分析原代细胞内CD44＋ CD24-细胞水平与克隆形成率的关系。结果基底样乳腺癌干／祖细胞表达CK19＋／CK14＋,不表达CK18,经血清诱导分化后,管腔上皮标志CK18和肌上皮标志CK14呈阳性表达;管腔A乳腺癌干／祖细胞呈CK18＋／CK19＋／CK14-表型,诱导分化后管腔上皮标志CK18和CK19表达,而肌上皮细胞标志CK14则不表达;CD24在基底样乳腺癌表达极低或无表达,但在管腔A乳腺癌高表达。基底样乳腺癌原代细胞中水平较高的是CD44-／CD24-/Low细胞,含CD44＋／CD24-／Low细胞（2．52±0．58）％,而管腔A乳腺癌CD44-／CD24＋细胞所占的比例最高,但不合CD44＋／CD24 -/Low细胞或水平极低。结论基底样乳腺癌和管腔A乳腺癌干／祖细胞有不同的细胞表型,二者的分化能力和分化方向也不同,可能起源于不同的乳腺上皮细胞。     

干细胞样细胞在不同乳腺癌细胞系的标记研究

目的:观察不同乳腺癌细胞系中干细胞样细胞的分布特点.方法:采用免疫细胞化学双染法,检测乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-468、MDA-MB-231中干细胞样细胞标志MUC-1/ESA、CD44/CD24的表达情况.结果:MCF-7细胞系MUC-1-/ESA+细胞的表达率为100%、CD44+/CD24-为2%:MDA-MB-468细胞系MUC-1-/ESA+细胞的表达率为35%、CD44+/CD24-为5%;MDA-MB-231细胞系MUC-1-/ESA+细胞的表达率为1%、CD44+/CD24-为85%.结论:不同乳腺癌细胞系可能具有不同的干/祖细胞体系.     

呼肠孤病毒对乳腺癌细胞的治疗作用

目的探讨呼肠孤病毒对乳腺癌细胞的治疗作用。方法比较呼肠孤病毒和表柔比星对MCF-7、BT474细胞的杀灭作用及其干细胞表型CD44+CD24-/low的表达变化(FCM法)。结果表柔比星和呼肠孤病毒均对乳腺癌细胞有杀灭作用。在表柔比星作用下MCF-7和BT474细胞中表达CD44+CD24-/low比例明显升高,为2.5%±0.6%和0.5%±0.1%(P<0.01)。病毒感染后MCF-7和BT474细胞中表达CD44+CD24-/low比例明显下降,均为0(P<0.05)。结论表柔比星对乳腺癌细胞有杀伤作用,但表柔比星可以富集乳腺癌干细胞。呼肠孤病毒对乳腺癌干细胞和癌症细胞同时具有治疗作用,有可能达到关闭癌细胞的目的。     

曲古抑菌素A抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖和诱导其凋亡的作用

目的：研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A对乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制作用和诱导凋亡作用。方法：乳腺癌MCF-7细胞经不同剂量曲古抑菌素作用后,用二甲氧唑黄比色法（XTT）法测定曲古抑菌素A对乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制率;用免疫细胞化学染色法观察其对凋亡相关基因p21wafl表达的影响。结果：不同浓度的曲古抑菌素均可抑制MCF-7细胞的增殖,且抑制率具有剂量和时间依赖性;凋亡相关基因p21wafl在曲古押菌素A作用细胞中的表达明显高于未进行处理的细胞。结论：曲古押菌素可抑制体外培养的人乳腺癌（MCF-7）细胞生长,诱导癌细胞发生凋亡。     

慢病毒转染绿色荧光蛋白对乳腺癌细胞系肿瘤干细胞相关亚群的影响

背景：研究发现通过流式分选的SP肿瘤干细胞具有干细胞功能，提示可用于检测表面标志未知的肿瘤干细胞。目的：观察慢病毒转染绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）对乳腺癌细胞系MCF-7中SP肿瘤干细胞生物学特性及亚群分布的影响。设计、时间及地点：细胞学基因检测水平体外观察，于2007—06／2008—07在南京医科大学第一附属医院普外科实验室完成。材料：MCF-7细胞株由上海细胞生物学研究所馈赠，GFP-MCF-7细胞株由江苏省人民医院普外实验室保存。方法：取MCF-7与GFP-MCF-7细胞株，加入含10％小牛血清的高糖DMEM培养液，在37℃、体积分数为0．05的CO2饱和湿度恒温箱中培养，生长至80％～90％融合时消化传代，取处于对数生长期的两种细胞进行实验。主要观察指标：利用流式细胞技术检测转染前后细胞中SP肿瘤干细胞的比例，运用Percoll不连续密度梯度法分离转染前后富集SP肿瘤干细胞的亚群，平板克隆实验测定各亚群的克隆形成率，观察比较转染前后细胞生长曲线、骨桥蛋白的表达水平。结果：MCF-7与GFP—MCF-7细胞中SP肿瘤干细胞比例分别为2．79％和2．73％，转染前后差异无显著性意义（t=-2．184，P〉0．05）。经Percoll分选，MCF-7与GFP—MCF-7细胞均分为5层，其中GFP—MCF-7第4亚群中明显富集SP肿瘤干细胞，且克隆形成率最高（t=3．415，P〈0．01）。转染前后细胞生长曲线无明显变化，且骨桥蛋白的表达水平基本相似（t=-2．562，P〉0．05）。结论：慢病毒转染绿色荧光蛋白对MCF-7中的SP肿瘤干细胞比例、亚群分布、细胞生物学特性无明显影响，且Percoll不连续密度梯度法富集效果显著。GFP-MCF-7细胞株可用于乳腺癌肿瘤干细胞转移动物模型的构建等实验。     

同种异基因成骨细胞对混合淋巴细胞反应体系中T细胞的免疫抑制

背景：由同种异基因骨髓间充质干细胞诱导的成骨细胞移植免疫反应各家报道不一致,差别明显。目的：体外观察由骨髓间充质干细胞诱导而成的成骨细胞对T细胞的免疫调节作用及特点。方法：用Ficoll-Hypaque梯度密度离心法分离出兔骨髓单个核细胞,体外扩增,获取第3代细胞,经典化学方法诱导为成骨细胞,将其按照不同的比例加入到T细胞形成双向混合淋巴细胞培养体系中,在第3,5,7天,用MTT比色法检测各组混合淋巴细胞培养体系中的T细胞增殖情况,24h后用流式细胞仪分析各组T细胞亚群凋亡情况。结果与结论：诱导后成骨细胞混合淋巴细胞培养体系中,成骨细胞对T细胞的增殖有抑制作用,在一定范围内,抑制作用具有量效关系。诱导后成骨细胞剂量大,时间延长,抑制程度增强;3次平均抑制率相比：1：20组低于1：80组（P〈0.01）;1：40组低于1：80组（P〈0.05）;诱导后成骨细胞能引起T细胞亚群凋亡,其中CD4＋（凋亡率8.57%）亚群不如CD8＋（凋亡率15.31%）细胞亚群凋亡显著（P〈0.01）。结果显示诱导的成骨细胞在体外能够通过细胞凋亡途径抑制T细胞的增殖,特别是CD8＋。但这种抑制不是特别强,表明诱导的成骨细胞虽有一定的免疫性,但其免疫性较低。     

三苯氧胺(TAM)及靶向CLC-3反义核苷酸对MCF-7(ER+)增殖的影响

目的研究氯离子通道CLC-3反义核苷酸及三苯氧胺对乳腺癌MCF-7细胞株增值的影响,探讨其在乳腺癌治疗方面的生物学基础,为临床乳腺癌的内分泌治疗及生物治疗提供参考。方法将MCF-7细胞分成如下6组,对照组(control group);实验组1:CLC-3反义核苷酸;实验组2:TAM 10μM;实验组3:TAM 20μM;实验组4:CLC-3反义核苷酸+TAM 10μM;实验组5:CLC-3反义核苷酸+TAM 20μM。单纯给予TAM时,于给药后24h收集细胞,以MTT比色法分析。结果随着TAM浓度从0逐渐增加到25μM,MCF-7细胞较对照组的增殖抑制率逐渐增加,呈剂量依赖性。0-10(P<0.05),10-20μM(P<0.01),单纯用反义链阻断CLC-3时MCF-7细胞的增殖没有明显受到抑制。CLC-3反义核苷酸+TAM 10μM与对照组相比有差异(P<0.05);CLC-3反义核苷酸+TAM 20μM较对照组相比有明显差异(P<0.01)。CLC-3反义核苷酸+TAM 10μM与TAM 10μM对比两组之间有差异(P<0.05);CLC-3反义核苷酸+TAM20μM与TAM 20μM对比两组之间有明显差异(P<0.01)。结论 TAM有抑制乳腺癌细胞株MCF-7增殖的作用,CLC-3反义核苷酸可以增加这种作用,且随TAM的浓度增加两者之间的协同作用增大。为临床乳腺癌的内分泌治疗及生物治疗提供了参考。     

MicroR-760 suppresses cancer stem cell subpopulation and breast cancer cell proliferation and metastasis: By down-regulating NANOG

Background and objectiveEmerging evidences suggest that cancer stem cells are responsible for tumor aggressive, metastasis and therapeutic resistance. To data, the mechanism underlying breast cancer stem cell (BCSC) population within tumor metastasis remains to be fully elucidated. The current study was to investigate the potential role of microRNA-760 (miR-760) and its associated target gene in population and metastasis of BCSC.MethodsCharacteristic BCSCs surface markers (CD44⁺/CD24^−/low) were determined by flow cytometry in breast cancer MCF-7 and BT-549 cells. Quantitative RT-PCR was used to evaluate miR-760 and NANOG mRNA expression. Expression of NANOG protein was determined using western blot. Cell proliferation was determined by MTT assay. The model of breast cancer cell xenograft was used to evaluate the effect of miR-760 on tumor growth.ResultsBT-549 cell has substantially more CD44⁺/CD24^−/low subpopulation than MCF-7 cell. Moreover, BT-549 cell expressed lower level of miR-760 and higher level of NANOG than MCF-7cell. By result from cellular miR-760 modulation, we found that miR-760 overexpression suppressed CD44⁺/CD24^−/low population as well as inhibited cell proliferation and migration of BT-549. On the contrary, knockdown of miR-760 promoted CD44⁺/CD24^−/low population and migration of MCF-7 cells. By luciferase reporter assay, miR-760 was proved to be functional associated with NANOG via regulating its expression. This functional interaction was showed to be involved in controlling proliferation and migration of MCF-7 and BT-549 cell.ConclusionThese data suggest that the target of miR-760/NANOG axis may represent a new therapeutic approach to suppress breast cancer stem cell subpopulation thereby prevent cancer metastasis.     

人鼻咽癌CD133^＋干细胞的生物学特性及意义

背景：有研究表明肿瘤细胞株中存在肿瘤干细胞,是肿瘤复发、转移的根源,但人鼻咽癌细胞株CNE-2中肿瘤干细胞的表达及生物学特性至今少有报道。目的：观察人鼻咽癌CD133^＋干细胞生物学特性及意义。方法：采用流式细胞仪检测人鼻咽癌细胞株CNE-2中CD133的表达情况。免疫磁珠分选技术获得人鼻咽癌CD133^＋干细胞,分别采用无血清培养法、CCK-8法、平板克隆形成试验及裸鼠体内成瘤实验检测CD133^＋干细胞的体外增殖及体内成瘤能力,并将其与CD133-及未分选鼻咽癌细胞进行比较,以了解CD133^＋干细胞的生物学特性。结果与结论：免疫磁珠富集的CD133^＋细胞在无血清培养基中呈悬浮生长,并可以形成肿瘤干细胞球。CD133^＋细胞与CD133-细胞比较具有较高的克隆形成能力（P〈0.01）;CD133^＋细胞在裸鼠体内的成瘤率高于CD133-细胞（P〈0.05）。结果证实,鼻咽癌CD133^＋干细胞能在体外分离培养,形成干细胞球,增殖能力强,在裸鼠体内具有极强的成瘤能力。     

Regulation of CD44 expression by tumor necrosis factor-α and its potential role in breast cancer cell migration

CD44 molecule plays critical role in distant malignant metastasis. It is expressed in standard form (CD44s) or variant form (CD44v). Tumor necrosis factor-α (TNF-α) is highly expressed in the cancer microenvironment. TNF-α was reported to modulate CD44 expression in several kinds of cancer. However, little is known about pathological role of TNF-α in breast cancer (BC) cells. In the current investigation, we investigated the effect of TNF-α on BC cells (MCF-7 and MDA-MB-231) viability, CD44 expression, and in vitro migration. We found that TNF-α down-regulated CD44s expression, up-regulated CD44v3 and CD44v6 expression through JNK pathway in MCF-7 cells. In MDA-MB-231 cells, TNF-α up-regulated CD44s, CD44v3 and CD44v6 expression via p38 pathway. These data indicate important role of CD44 molecule in BC pathology.     

乳腺癌中CD44、CD133~+细胞表达及其与临床特征相关性研究

目的探讨乳腺癌中CD44、CD133+细胞表达与临床特征的相关性,为临床诊治、预后评估提供依据。方法收集乳腺病理标本200例(乳腺增生25例,不典型增生22例,乳腺癌153例)及正常乳腺组织30例。采用免疫组织化学染色测定乳腺不同病变组织中的CD44、CD133+表达情况,分析乳腺癌不同临床病理特征的CD44、CD133+表达水平。结果 CD44、CD133+在乳腺癌中的阳性表达率均明显高于乳腺增生、不典型增生(P0.05)。在乳腺癌、乳腺增生、不典型增生中CD133+、CD44双重表达率分别为58.2%、32.0%、18.2%(P=0.00)。CD44、CD133+的表达水平随组织学分级、TNM分期的增高而升高(P0.05);肿瘤复发的乳腺癌CD44、CD133+表达水平明显高于非复发的乳腺癌(P0.05)。结论乳腺癌组织中CD44、CD133+的表达水平与乳腺癌临床病理特征存在存在一定相关性,因此,联合分析CD44、CD133+的表达有利于评估乳腺癌恶性程度和预后,也是乳腺癌治疗研究的一个方向。     

Smoothened activates breast cancer stem-like cell and promotes tumorigenesis and metastasis of breast cancer

Smoothened (Smo) is a G protein-coupled receptor protein encoded by the Smo gene of the hedgehog signalling pathway, which is thought to play an important role in maintaining organ patterning, cell differentiation and self-renewal. The possible role of Smo in the process of tumorigenesis and metastasis of breast cancer still remains unclear. The present experiments were to investigate the effect of Smo on activating breast cancer stem-like CD44⁺CD24⁻ cells and the tumorigenesis and metastasis of breast cancer. By injected CD44⁺CD24⁻ cells (1 × 10⁴) into the cleared fat pad of NOD/SCID mice, it was observed that CD44⁺CD24⁻ cells possess higher tumor-initiating capacity and metastasis properties than equal numbers of non-CD44⁺CD24⁻ cells. The mRNA and protein expressions of Smo in CD44⁺CD24⁻ cells were higher than those in non-CD44⁺CD24⁻ cells, indicating that Smo may play a role in maintaining breast cancer stem cell features. qRT–PCR results revealed that expressions of STAT3, Bcl-2 and cyclinD1 mRNA in MCF-7 cells were decreased after transfected by Smo siRNA. In addition, the expressions of MMP-2 and MMP-9 were downregulated in MCF-7 cells after Smo expression was inhibited. Smo inhibition may be a possible therapeutic target that potentially suppresses breast tumor formation and development.     

不同体外环境下舌癌干细胞标志CD44及ESA和CXCR4的表达

背景：细胞生存的微环境与蛋白的表达密切相关,在不同的环境中癌干细胞标志的表达可能存在差异。目的：探讨癌干细胞标志CD44、ESA、CXCR4的表达是否会在不同的细胞生存环境中发生改变。方法：选取舌癌TCA8113细胞系,分别建立干细胞培养基、常规标准培养基以及在标准培养基中添加阿霉素的3种体外培养微环境,采用免疫组化及流式细胞术,检测不同培养环境中3种标志在舌癌细胞中的表达。结果与结论：免疫组化法检测显示,在所有培养环境中CD44、ESA强阳性表达,CXCR4在干细胞培养基环境中弱阳性表达,其余为阳性表达;流式细胞术检测CD44与ESA在所有培养环境中均高水平表达;与常规标准培养基环境比较,在干细胞培养基的微环境中CXCR4极低水平表达,将舌癌细胞从干细胞培养基转回常规标准培养基后,CXCR4的表达回升;在阿霉素干预的培养环境中,CXCR4表达水平升高。结果表明舌癌干细胞标志在不同体外微环境下的表达存在差异,需结合体内环境与肿瘤组织的表达情况来寻找癌干细胞标志。并且不同微环境模式可能富集不同性质的癌干细胞。     

表没食子儿茶素没食子酸酯对乳腺癌细胞生长及迁移的影响

目的：探讨表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对乳腺癌细胞MCF-7生长的影响及对乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移的影响。方法：MCF-7细胞培养贴壁之后,加入EGCG处理,2d后收集蛋白,采用Western Blot检测磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶（phospho-p38MAPK）的表达;同样处理后收集活细胞,用细胞计数法检测细胞的存活;取对数生长期的MDA-MB-231细胞,分至6孔板培养,使用EGCG处理后,采用细胞划线法探测乳腺癌细胞的迁移。结果：使用EGCG处理乳腺癌细胞后,phospho-p38MAPK的表达降低,EGCG处理乳腺癌细胞4d后其增殖率降低50%,迁移活性降低。结论：EGCG处理乳腺癌细胞能抑制肿瘤细胞的生长以及迁移,这与p38 MAPK信号通路相关。