嗅鞘细胞的培养纯化及形态学特征

目的　建立体外培养纯化嗅鞘细胞 (Olfactoryensheathingcells,OECs)的模型 ,观察OECs生长状态和形态学变化 ,为研究神经再生获得丰富OECs来源奠定基础。方法　以原代培养的方法分离、培养成年大鼠嗅球OECs,再用阿糖胞苷抑制 ,P75抗体吸附方法纯化及Forskolin和牛垂体提取液 (bovinepituitaryextract,BPE)营养物质综合作用。根据P75免疫组化学染色结果统计所得OECs的纯度 ,同时对不同培养时期的OECs的形态进行观察。结果　 (1)此纯化方法所得的OECs纯度可达 95 %以上 ,细胞增殖速度较快 ,且细胞纯度不因培养时间的延长而明显下降。 (2 )未纯化前细胞形态多变 ,主要为巨噬细胞状、双极和多极状 ;纯化后 2～ 4天 ,OECs多呈双极或多极状 ;突起短小 ;4天后 ,OECs以突起细长的双极和三极为主 ,细胞走向一致 ,呈平行排列。结论　P75抗体吸附方法纯化效率高 ,Forskolin和BPE能够促进细胞的增殖 ,并影响细胞的形态及排布     

经改良的取材和差速贴壁法培养纯化嗅黏膜嗅鞘细胞

目的:采用经改良的取材和差速贴壁法培养纯化嗅黏膜嗅鞘细胞(OECs),以探求更加简单、高效的嗅黏膜OECs取材和培养纯化方法.方法:成年雄性SD大鼠6只,采用经改良的方法剥取嗅黏膜,然后用改良差速贴壁法培养纯化嗅黏膜OECs.倒置相差显微镜下观察细胞生长情况以及形态并照相,培养7 d、14 d细胞行NGFRp75免疫细胞化学染色鉴定,并根据免疫细胞化学染色结果计算细胞纯度.结果:体外培养的嗅黏膜OECs形态主要有扁圆形或油煎蛋形、梭形或双极、多突起形.嗅黏膜OECs NGFRp75免疫细胞化学染色阳性.培养7 d嗅黏膜OECs纯度为90%,培养14 d嗅黏膜OECs纯度为85%.嗅黏膜OECs最长可以存活35 d.结论:经改良的取材和差速贴壁法培养纯化嗅黏膜OECs具有简单、高效的优点,培养的嗅黏膜OECs的纯度完全可以达到细胞移植的要求.     

人鼻腔嗅粘膜嗅鞘细胞的原代培养和免疫组化观察

目的 建立人鼻腔嗅粘膜嗅鞘细胞（OECS）的体外培养方法。方法 利用鼻窦镜选取上鼻甲嗅区粘膜，原代培养嗅鞘细胞，进行形态学观察。结果 成功培养出人鼻腔嗅粘膜OECs，为扁平的双极、多极形态，对P75、GFAP呈阳性反应，纯度在50％左右。结论 人鼻腔嗅粘膜培养OECs的方法实用可行，但须在取材部位和纯化方面进一步探讨。     

成人、成年狗鼻腔嗅黏膜成鞘细胞的纯化、培养与鉴定

目的研究成人和成年狗嗅黏膜成鞘细胞（OECs）的分离与培养的方法,为探索在人体和大型动物模型的自体嗅黏膜OECs移植修复脊髓损伤奠定基础。方法采用差速贴壁方法分别从成人和成年比格狗的嗅黏膜分离出OECs,分别培养25d,在第6d、10d和25d进行形态学观察,最后进行OECs特异标记物NGFRp75的免疫细胞化学染色,鉴定成鞘细胞。结果原代培养的成人和成年狗嗅黏膜OECs在培养10d后明显增多,25d的OECs成熟,具有很长的突起,其形态多为双极和三极,NGFRp75的免疫组织化学染色呈阳性。本实验条件下,狗嗅黏膜OECs的生长状态比成人的好。而未进行差速贴壁的培养细胞则几乎均呈成纤维样细胞。结论差速贴壁的方法可以分离出较为纯化的成人、成年狗鼻腔嗅黏膜OECs。     

成年大鼠嗅球和鼻腔嗅粘膜成鞘细胞的分离、培养与鉴定

目的　在嗅球成鞘细胞 (OECs)移植到脊髓可有助于损伤神经纤维再生的基础上 ,分别对嗅球和嗅粘膜的OECs进行培养 ,探索自体嗅粘膜作为OECs供体的可能性。　方法　根据OECs、成纤维细胞和星形胶质细胞贴壁时间的不同 ,采用差时贴壁方法分离出OECs,培养 14div后进行NGFRp75和GDNF的免疫细胞化学染色。　结果　按形态学和免疫组织化学特性 ,培养的嗅球和嗅粘膜OECs可分为 3类 :双极细胞、三级细胞和扁圆细胞 ,其中以双极细胞最多。嗅粘膜的双极成鞘细胞的突起更加细长。　结论　差时贴壁细胞分离法是一种简单、经济、实用的成鞘细胞分离方法。鼻腔嗅粘膜OECs的形态学和免疫细胞化学特性与嗅球OECs基本相同 ,本实验为临床开展自体嗅粘膜OECs修复脊髓损伤的研究提供参考     

人胚嗅球嗅鞘细胞原代培养的实验研究

目的拟建立人胚胎嗅球嗅鞘细胞的培养方法并探讨这些细胞在活性、纯度方面是否具备临床应用水平。方法用含有促进细胞生长的谷氨酰胺、转铁蛋白、生物素、硒酸纳的无血清纯化液纯化嗅鞘细胞,胰蛋白酶消化收集细胞,制成单细胞悬液。采用台盼蓝染色法进行活性测定,P75NGFR和S-100双标免疫荧光染色鉴定,以Hoechst复染鉴定OECs的纯度。结果可见比较典型的嗅鞘细胞:双极或梭形、多突起形和扁圆形,主要以梭形和多突起形细胞为主。细胞活性大于95%,纯度大于90%。结论实验建立的人胚胎嗅球嗅鞘细胞原代培养的方法可行,细胞活性大于95%,纯度和均一性已达到临床应用水平。     

不同来源嗅鞘细胞的生长特性和生物学活性观察

目的探讨来源于乳鼠嗅球与成年大鼠嗅粘膜嗅鞘细胞（OECs）生长特性和生物学活性的区别，为临床应用不同来源OECs提供理论支持。方法选取成年SD大鼠嗅粘膜和乳鼠嗅球的OECs，通过原代培养，在不同时间观察细胞形态和生长趋势，测定培养细胞上清中神经营养因子一Ⅲ（NT-3）的含量。结果培养出相应OECs，同时期源自乳鼠嗅球OECs细胞活性高于嗅粘膜OECs，进入平台期后二者生物学活性一致。结论不同来源的OECs生长特性有差别，但其生物学活性一致。     

成年大鼠嗅神经鞘细胞纯化培养的研究

嗅神经鞘细胞(olfactoryensheathingcells,OECs)是目前用于神经再生研究较为理想的移植细胞,为了建立一种可以有效获得高纯度、高均一性的OECs培养方法,本实验采用2. 5月的大鼠嗅球为实验材料进行OECs培养,同时结合OECs的生物学特点在培养8d后,通过用硝酸纤维素膜吸附p75抗体,再对培养的OECs进行免疫亲和吸附和对成纤维细胞进行补体杀伤来纯化OECs, 在纯化后分别对培养2、4、6、8d的OECs进行p75免疫组化染色和纯度鉴定。实验结果发现,本研究采用的OECs纯化培养方法所获得OECs纯度在4个不同培养时间点都达到98%以上,说明此方法是一种高效率的纯化培养OECs的方法。     

小鼠嗅鞘细胞培养的初步研究

目的:研究小鼠嗅鞘细胞(OECs)体外培养的不同方法,为获取数量多、活性好、形态优的嗅鞘细胞提供一定的实验基础。方法:4只出生2～3个月的BALB/c小鼠,经枕骨大孔取嗅球,剥离嗅球外周两层制成细胞悬液。采取未纯化培养对照组、一次差速贴壁结合阿糖胞苷(Ara-c)纯化与多聚左旋赖氨酸包被培养板培养组(纯化包被组)和一次差速贴壁结合Ara-c纯化与未用多聚左旋赖氨酸包被培养板培养组(纯化未包被组)分别培养小鼠OECs,观察其原代和传代培养的细胞生长状况及形态,并进行免疫细胞化学鉴定。结果:纯化未包被组OECs早中期无论数量还是形态都优于纯化包被组,而未纯化对照组的OECs早中期数量明显优于纯化组。结论:一次差速贴壁结合Ara-c纯化未包被进行小鼠OECs培养是一种简捷有效地方法。     

原代培养大鼠嗅球成鞘细胞Nogo(N-18)的共聚焦激光扫描显微镜观察

目的 观察原代培养的成年大鼠嗅球成鞘细胞(OECs)Nogo(N-18)蛋白的表达，探讨Nogo与成鞘细胞促进神经再生作用的关系。方法 原代培养嗅球OECs，采用免疫组织化学和双标免疫荧光细胞化学技术，结合激光共聚焦扫描显微镜观察。结果 原代培养的嗅球OECs的Nogo(N-18)免疫细胞化学反应呈阳性，Nogo(N-18)蛋白主要分布于胞浆，而在胞膜及突起分布较少。结论 嗅球(OECs)含有Nogo—A蛋白，提示Nogo-18蛋白在嗅神经系统可能没有决定抑制轴突再生的作用。     

一种新的培养嗅鞘细胞方法(英文)

为了建立一种新的培养嗅鞘细胞的方法,从而为神经诱导修复材料的研究提供种子细胞。本研究取新生鼠的嗅球最外两层经胰蛋白酶消化成单细胞悬液,经差速贴壁法纯化,观察并记录其形态特征;经HE染色以及神经生长因子蛋白受体p75(NGFR-p75)和S-100免疫组化染色鉴定并计算其纯度。结果显示,获得的嗅鞘细胞突起呈双极或三级,p75和S-100阳性细胞纯度达到91%。上述结果提示该方法经济易行,所获得的嗅鞘细胞纯度高、活性好。     

两种不同纯度的嗅鞘细胞在体外存活与生长的比较

比较80%和50%两种纯度的嗅鞘细胞在体外培养条件下的存活与生长,为嗅鞘细胞体内移植选用最佳纯度提供依据。分离、培养并纯化成年SD大鼠嗅鞘细胞,将纯化的嗅鞘细胞和收集到的贴壁成纤维细胞进行约80%和50%的比例混合后接种,继续培养1d或3d。所有细胞于不同时间点行P75免疫细胞化学荧光染色,以鉴定嗅鞘细胞的初始及其后培养过程中数量和纯度的变化。观察细胞状态,计数细胞总数和P75免疫阳性细胞数目,求得各组嗅鞘细胞数量和纯度并行统计学分析。结果显示:两种不同纯度嗅鞘细胞在培养1d时形态正常,3d时纯度为50%的嗅鞘细胞胞体依然饱满,突起更加纤长,数量和纯度亦无明显下降。而纯度为80%的嗅鞘细胞在培养3d时已出现胞体萎缩和突起变短,数量从1d时每一观察区域内的35±13显著下降为23±5(P=0.02),但纯度未发生明显变化。结果表明50%纯度嗅鞘细胞的存活及生长状态优于80%者,提示细胞体内移植时应考虑选取50%纯度的嗅鞘细胞。     

成年大鼠嗅球成鞘细胞的原代培养

本实验取材于成年 Wistar大鼠嗅球的最外两层 ,进行原代培养嗅球成鞘细胞 ,用胶质纤维酸性蛋白抗体免疫组化方法确认。结果显示 :( 1)培养至第 10 d,原代培养物多见两种形态的细胞 :一种为单极、双极或多极细胞 ,带有细长的突起 ;另一种为所谓“煎蛋样”细胞 ,扁平状 ,胞质少极化 ,边缘不规则 ;( 2 )胶质纤维酸性蛋白反应显示这两种细胞均呈阳性 ,Nissl法复染后 ,可计数其纯度为 70 %～ 85 %。     

差速贴壁结合神经营养因子3体外纯化培养人胚嗅鞘细胞

目的:采用差速贴壁结合神经营养因子3的方法对人胚嗅球嗅鞘细胞进行原代纯化培养,探讨简单实用的嗅鞘细胞体外培养方法。方法:将差速贴壁后人胚嗅鞘细胞间隔48h用含100mL/L胎牛血清和含NT3的DF12培养液交替进行体外培养。观察嗅鞘细胞的生长变化,采用形态学和P75免疫细胞化学染色进行细胞及纯度鉴定。结果:体外培养的人胚嗅鞘细胞P75染色呈阳性反应,呈双极、三极细胞,细胞突起细长,并可形成细胞突起网络。在体外培养9d时可以获得95%的嗅鞘细胞,12d时为83%,且细胞状态良好。结论:差速贴壁法结合间断NT3应用是一种简单实用的嗅鞘细胞纯化培养方法。     

成年大鼠嗅粘膜细胞原代培养及形态学研究

为了探讨大鼠嗅粘膜嗅鞘细胞(OECs)的分离与纯化培养方法并对其形态学进行研究,我们自鼻腔嗅粘膜取材后采用差速贴壁、机械刮除和阿糖胞苷(Arac)抑制相结合的纯化培养方法培养嗅粘膜细胞,并分不同阶段进行镜下观察及p75NGFR和GFAP免疫组化染色鉴定。结果显示,自嗅粘膜组织可以培养出四种细胞:梭形细胞、双极细胞、窝形细胞和大细胞。其中大部分梭形和双极细胞呈p75NGFR或GFAP免疫反应阳性,属于OECs。结果提示本文介绍的培养方法可以培养出嗅粘膜OECs;差速贴壁、机械刮除和Arac抑制相结合方法可纯化OECs。     

阿糖胞苷结合神经生长因子体外纯化培养大鼠嗅鞘细胞

背景：由于嗅鞘细胞终生具有成髓鞘能力,如何利用简单而又经济的方法获得大量较高纯度的嗅鞘细胞是脊髓损伤研究的热点。 目的：分析阿糖胞苷结合神经生长因子对大鼠嗅球源性嗅鞘细胞纯化培养的可行性。 方法：将差速贴壁后的大鼠嗅鞘细胞首先用含10 mg/L阿糖胞苷的完全培养基培养24 h,然后用含体积分数为1%胎牛血清和25 μg/L神经生长因子的DMEM/F12培养基进行体外培养。观察嗅鞘细胞的生长变化,采用形态学和免疫组化染色对细胞及其纯度进行鉴定。 结果与结论：体外培养的大鼠嗅鞘细胞神经生长因子受体NGFRp75染色呈阳性反应,细胞呈双极和三级,伸出细长突出,并渐结成网状,在体外培养的第7天纯度为95%,第9天时为90%,且形态良好。结果提示阿糖胞苷结合神经生长因子是一种简单实用的嗅鞘细胞纯化培养方法。     

Culture and purification of human fetal olfactory ensheathing cells using different attachment rates combined with intermittent NT3 nutrition

Objective:To explore a simple and pragmatic method to obtain sufficient olfactory ensheathing cells from human fetus by selective attachment of harvested cells combined with intermittent NT3 nutrition. Methods:DMEM/F12 culture solution including 10% fetal bovine serum or NT3 was used to culture olfactory ensheathing cells intermittently every 48 h. The cell state and growth rates of OECs were observed, and P75 staining was used to estimate the purity of the cells. Results:Human fetal OECs were positive with P75 immunocytochemical staining. OECs in dipolar or tripolar shape formed networks by their processes in vitro. The purity of OECs in "good state" was about 95% at 9 d and 83% on 12 d, respectively. Conclusion:The method of using different attachment rates combined with intermittent NT3 addition is a simple and effective way to culture and purify OECs.